基于環(huán)介導等溫擴增技術檢測蘋果銹果類病毒的引物組、試劑盒和方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于環(huán)介導等溫擴增技術檢測蘋果銹果類病毒的引物組、試劑盒和方法，引物組包括外側引物對F3和B3、內側引物對FIP和BIP，其序列分別為SEQ ID NO:1～4；試劑盒包含如下組分：1）環(huán)介導等溫擴增反應液A；2）陽性對照樣品；3）空白對照樣品；4）顯色劑；方法包括下列步驟：1）待檢樣品RNA提??；2）蘋果銹果類病毒環(huán)介導等溫擴增；3）顯色檢測。本發(fā)明提供的快速檢測蘋果銹果類病毒的分子生物學方法，與現(xiàn)有技術相比，具有簡便易行、檢測高效性、靈敏度高、準確性高、特異性強等特點。
【專利說明】基于環(huán)介導等溫擴增技術檢測蘋果銹果類病毒的引物組、試劑盒和方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于環(huán)介導等溫擴增技術檢測蘋果銹果類病毒的引物組、試劑盒和方法，屬于生物檢測試劑【技術領域】。

【背景技術】
[0002]蘋果銹果類病毒(Apple scar skid viroid, ASSVd)歸于蘋果銹果類病毒屬(Apscaviroid),粒體由330個核苷酸組成。蘋果銹果類病毒的侵染寄主是蘋果和梨。感病的蘋果因品種和環(huán)境條件的變化表現(xiàn)出5種顯性病癥:銹果型、花臉型、銹果-花臉型、環(huán)斑型和綠點型，感病的梨大多數表現(xiàn)為隱性，少數為畸形果。由于類病毒在寄主植物細胞核中復制和累積，在感病寄主的葉、莖、皮、砧木，以及果實的表皮、果肉和種子中均可檢測出類病毒。因此，感染類病毒的果樹終生帶毒，并通過嫁接和修剪工具傳染的途徑使類病毒病蔓延。許多國家的蘋果樹和梨樹中均發(fā)現(xiàn)ASSVd的危害，我國東北、西北、華北，以及江蘇、安徽、山西和山東等地亦有發(fā)生。目前尚未有蘋果銹果類病毒的恒溫擴增方面的檢測技術的發(fā)明報道。因此，建立蘋果銹果類病毒的新型檢測鑒定方法，對于提高蘋果銹果類病毒的檢疫檢驗效率、防止蘋果銹果類病毒的傳入、傳出，保護我國農業(yè)的安全生產，促進我國農產品的順利出口，具有十分重要的意義。植物類病毒由于不顯性侵染比較普遍，癥狀表現(xiàn)受環(huán)境溫度的影響較大，而且?guī)追N鑒別植物對不同類病毒的反應癥狀相似，故難于應用生物測定的方法。由于類病毒不能產生任何蛋白質，所以也不能使用檢測病毒的電鏡、血清學方法。因此，選用分子生物學方法對蘋果銹果類病毒進行檢測。
[0003]在現(xiàn)有的核酸檢測方法中，常用的有聚合酶鏈式反應(常規(guī)PCR和實時熒光PCR)，該方法靈敏、特異，但需要高品質熱循環(huán)儀，而且因為溫度循環(huán)導致較長。其他新開發(fā)的核酸擴增方法，比如 NASBA (nucleic acid sequence-based amplificat1n)、3SR (self-sustained sequence replicat1n) > SDA (strand displacementamplificat1n)等,在擴增循環(huán),都有各自的創(chuàng)新點。NASBA和3SR使用一系列轉錄和反轉錄過程來循環(huán)以避免高溫變性作用，SDA則使用限制性內切酶和修飾過的模板來循環(huán)擴增。雖然它們的敏感性都很高，可以檢測并擴增小于10個拷貝的核酸樣本，但是它們還有各自需要克服的缺點。技術要求、材料要求、技術本身特異性缺陷等方面嚴重束縛了這些技術的推廣應用。因此，有必要提供一種更便捷，檢測靈敏度更高的檢測蘋果銹果類病毒的方法。


【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的要解決的技術問題的是提供一種用于檢測蘋果銹果類病毒的環(huán)介導等溫擴增的引物組、試劑盒和檢測方法，即利用環(huán)介導等溫擴增方法檢測蘋果銹果類病毒的引物和試劑盒，本發(fā)明可以克服其他檢測方法在病毒檢測的局限性，為蘋果銹果類病毒的檢測提供有效工具，能夠快速、特異性強、靈敏度高而且低成本的檢測蘋果銹果類病毒。
[0005]為解決上述技術問題，本發(fā)明采用以下技術方案: 本發(fā)明提供的蘋果銹果類病毒RT-LAMP檢測引物組，包括外側引物對F3和B3、內側引物對FIP和BIP,它們的堿基序列分別為SEQ ID NO:1?4。
[0006]本發(fā)明提供的檢測試劑盒，包含如下組分:
1)環(huán)介導等溫擴增反應液A:
包含 2 X RT-LAMP Mix 12.5 μ L、AMV-Bst 混合液 1.5 μ L、RNase-Free Water 2.8μ L、RT-LAMP檢測引物組6.2 μ L，F(xiàn)IP和BIP各2.5 μ L、終濃度均為I μ M ;F3和B3引物各0.6 μ L，終濃度均為0.25 μ Μ;引物F3、B3、FIP和BIP分別具有序列表SEQ ID N0:1?4的堿基序列；
2)B反應液陽性對照樣品:含蘋果銹果類病毒RNA模板，作為陽性模板。
[0007]3) C反應液空白對照樣品:為去離子水。
[0008]4)顯色劑:為10%的熒光染料SYBR GREEN I。
[0009]本發(fā)明還提供一種使用以上試劑盒，檢測樣品中蘋果銹果類病毒的方法，依次包括下列步驟:
I)待檢樣品RNA提取
采取Trizol法或RNA提取試劑盒抽提RNA模板。
[0010]2)蘋果銹果類病毒環(huán)介導等溫擴增
A:在反應管中依次加入待檢模板RNA 2 μ L和環(huán)介導等溫擴增反應液A 23 yL，充分混勻。
[0011]B:在63 1:恒溫反應條件下，進行環(huán)介導恒溫擴增反應60 min。
[0012]C:80 °C終止反應，5 min取出待檢。
[0013]擴增時，應設立2個對照:陽性對照(B反應液代替RNA模板)、空白對照(C反應液代替RNA模板)
3)顯色檢測
在每個反應管中加入I μ L顯色劑D，直接用肉眼觀察顏色變化，在陽性對照和空白對照都成立的情況下(即B液出現(xiàn)擴增，加入顯色劑后，擴增反應液顏色變?yōu)榫G色；C液無擴增，加入顯色劑后，擴增反應液顏色為橙色)，如果樣品的反應管中擴增反應液顏色變?yōu)槌壬?，說明待檢樣品不含蘋果銹果類病毒，如果顏色變?yōu)榫G色，則說明待檢樣品含有蘋果銹果類病毒。
[0014]上述蘋果銹果類病毒RT-LAMP檢測方法在番茄、辣椒上的應用。
[0015]本發(fā)明提供的快速檢測蘋果銹果類病毒的分子生物學方法，具有靈敏度高、特異性強等特點，與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益結果是:
1、簡便易行:該檢測方法通過恒溫水浴鍋或有穩(wěn)定熱源的設備就能進行實驗，通過反應產物顏色變化即可判定結果，省去了昂貴的儀器設備、繁瑣的電泳過程。
[0016]2、檢測高效性:該檢測方法所用檢測時間不足I小時，而PCR擴增時間較長，一般需要2小時以上，這樣能大大提高了檢測的效率。
[0017]3、靈敏度高:以蘋果銹果類病毒RNA為模板，該方法的檢測下限為10 f g/μ L，是常規(guī)PCR的100倍。
[0018]4、準確性高:該方法幾乎不受反應混合液中存在的大量外源本底RNA和雜質的影響，不需要從樣本中純化RNA，可直接利用發(fā)病組織或病殘體提取RNA快速檢測，大大提高了檢測的準確度。
[0019]5、特異性強:該方法通過2對引物特異性識別靶序列上的6個獨立區(qū)域，相對于PCR引物識別靶序列的2個獨立區(qū)域而言，特異性大幅提高，假陽性出現(xiàn)的概率也隨之降低。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1是本發(fā)明的特異性實驗圖。1:蘋果銹果類病毒；2:啤酒花矮化類病毒；3:梨泡狀潰瘍類病毒；4:桃潛隱花葉病毒；5:蘋果莖痘病毒；6:陰性對照。
[0021]圖2是本發(fā)明的靈敏性實驗圖。其中1~8:1 X 10'I X 10'I X 10'I X 10'
IX I(T5、I X 10' I X I(T7 ng/ μ LASSVd 感病材料總 RNA。
[0022]圖3 是 RT-PCR 靈敏性實驗圖。其中 1-8:1 X 10—1、I X 10_2、I X 10_3、I X 10_4、I X 10_5、I X 10' I X I(T7 ng/ μ L ASSVd 感病材料總 RNA0

【具體實施方式】
[0023]本發(fā)明采用環(huán)介導等溫擴增技術，并根據蘋果銹果類病毒全長基因序列設計了相應的RT-LAMP檢測引物組，包括外側弓I物對F3和Β3、內側弓I物對FIP和BIP，由此發(fā)明了用于檢測蘋果銹果類病毒的RT-LAMP檢測方法及試劑盒。應用本發(fā)明的檢測方法及試劑盒，僅需通過對蘋果、梨等疑似感染植株樣品進行RNA提取并進行環(huán)介導等溫擴增，即可快速檢測出是否感染蘋果銹果類病毒，方便基層快速、準確、簡便地進行病害診治，進而采取適當的防治措施，減少病害帶來的損失。
[0024]實施例1特異性實驗 (I)引物設計
LAMP方法，只有當2對引物與目的片段的六個區(qū)域都匹配上時才能進行擴增。本發(fā)明根據NCBI核酸序列數據庫中ASSVd序列(登錄號EU825613.1)，在保證擴增的兼并性和通用性的前提下通過比較分析基因高度保守區(qū)，設計LAMP外側引物對F3和B3、內側引物對FIP和BIP,設計完成后將引物在數據庫的Primer-Blast模塊下進行比對驗證,最后選取以下RT-LAMP檢測引物組:
外側引物對F3和B3
上游引物 F3:ACTCACCTGTCGTCGTCG (見序列表 SEQ ID NO:1)。
[0025]下游引物B3:GCCGCTGCGTCAAAGA (見序列表 SEQ ID NO: 2)。
[0026]內側引物對FIB和BIP，
上游引物 FIP:ACAGCGGAACTGGTGCGAGG-CGAAGGCCGGTGAGAAAGG (見序列表 SEQ IDN0:3)。
[0027]下游引物BIP: CTGCGCTGCCACCTACTCTC-AGAACAGGGGGCTCCAC (見序列表 SEQ IDN0:4)。
[0028](2)病毒RNA的提取
取0.1 g蘋果銹果類病毒、啤酒花矮化類病毒、梨泡狀潰瘍類病毒、桃潛隱花葉病毒、蘋果莖痘病毒樣品，加液氮研磨成粉末狀，將研磨物迅速移入1.5 mL離心管中，加入I mLTrizol Reagent,顛倒混勻，2°C ~8°C, 12000 g,離心 lOmin。取上清，15 °C ~30 °C,放置5min ;加入0.2 mL氯仿，用手劇烈震蕩(勿渦旋振蕩)，約15s。15°C ~30°C，放置2min~3min ；2V ~8°C, 12000 g，離心15min。小心吸取約為600 μ?的上層水相，勿擾動中間相和下層相。加 500 “1^異丙醇混合上清液，151:~301:，放置101^11。2°C ~8°C, 12000 g，離心 lOmin。去除上清液，沉淀中加入I mL 75%乙醇，洗滌；21:~81:，7500 g，離心5min。去除上清液，沉淀自然干燥后，將其溶于30 UL -50 μ L無RNase的水中，即為待檢模板RNA。
[0029](3)五種類病毒環(huán)介導等溫擴增
Α:分別在反應管中依次加入五種類病毒及陰性對照的待檢模板RNA 2 μ L和環(huán)介導等溫擴增反應液A 23 μ L，充分混勻。
[0030]B:在63 1:恒溫反應條件下，進行環(huán)介導恒溫擴增反應60 min。
[0031]C:80 °C終止反應，5 min取出待檢。
[0032](3)顯色檢測
加入顯色劑進行顯色反應，管3~管6，即蘋果銹果類病毒、梨泡狀潰瘍類病毒、桃潛隱花葉病毒、蘋果莖痘病毒的RNA模板均無擴增，反應液顏色沒有變化依然為橙色。陽性對照管管I (以反應液B為模板RNA)反應液顏色變?yōu)榫G色,陰性對照管管2 (以反應液C為模板RNA)反應液顏色為橙色。見圖1。
[0033]該組引物經在線BLAST的結果證實，具有很高的特異性，不會與其他病毒交叉反應。蘋果銹果類病毒屬于蘋果銹果類病毒屬(Apscaviroid)，主要侵染梨、蘋果等果樹，因此研究選擇了五種蘋果、梨、李上常見的類病毒為測試毒種。經驗證，除蘋果銹果類病毒RNA出現(xiàn)擴增，反應管反應液變?yōu)榫G色外，其余病毒均無擴增，反應管均為橙色，與預期相符，證明該組引物的良好特異性，與上述毒株均無交叉反應。
[0034]實施例2敏感性實驗
(I)用DEPC水將ASSVd類病毒RNA配比為I ng/ μ L模板液并向下做10倍梯度稀釋，依次為 I X 10' I X 10' I X 10' I X 10' I X I(T5、I X 10' I X l(T7ng/ μ L,各取 2 μ L 為模板分別進行LAMP及RT-PCR擴增反應。擴增引物組包含:
外側引物對F3和B3
上游引物 F3: TGGAGTAGAGGCTCTGCC。
[0035]下游引物B3: TCTTTGCATGCCTTTTGCG。
[0036]內側引物對FIB和BIP，
上游引物 FIP:GTCGCGTCTCCAAGAAGAGCC-CGAAACACCATCGATCGTCC?
[0037]下游引物BIP: CTGCTCGGTTCGCTCCAACC-AGGGGCTCAAGAGAGGATC。
[0038](2)病毒RNA的提取
取0.1 g不同稀釋濃度的樣品，加液氮研磨成粉末狀，將研磨物迅速移入1.5 mL離心管中，加入I mL Trizol Reagent,顛倒混勻，2°C ~8°C, 12000 g,離心lOmin。取上清，15°C~30°C，放置5min ;加入0.2 mL氯仿，用手劇烈震蕩(勿渦旋振蕩)，約15s。15°C~30°C,放置2min~3min ;2°C~8°C，12000 g，離心15min。小心吸取約為600 PL的上層水相，勿擾動中間相和下層相。加500 “1^異丙醇混合上清液，151:~301:，放置101^11。2°C~8°C,12000 g,離心lOmin。去除上清液,沉淀中加入I mL 75%乙醇,洗漆；2°C ~8°C, 7500 g,離心5min。去除上清液,沉淀自然干燥后,將其溶于30 μ L -50 μ L無RNase的水中，即為待檢模板RNA。
[0039](3)不同濃度的蘋果銹果類病毒環(huán)介導等溫擴增
A:分別在反應管中依次加入不同稀釋倍比的待檢模板RNA 2 μ L和環(huán)介導等溫擴增反應液A 23 μ L，充分混勻。
[0040]B:在63 1:恒溫反應條件下，進行環(huán)介導恒溫擴增反應60 min。
[0041]C:80 °C終止反應，5 min取出待檢。
[0042](4 ) RT-PCR擴增及檢測
RT-PCR擴增體系參照TIANGEN公司的Quant —步法RT-PCR試劑盒說明配置，反應條件為 50 °C反轉錄 30 min ；94 °C預變性 2 min; 94 °C 30 s，58 °C 30 s，72 °C 30 s，循環(huán)反應35次；65 °C延伸10 min。
[0043]取1.5 g瓊脂糖，于100 mL電泳緩沖液中加熱，充分溶化，加入溴化乙錠貯存液至終濃度為0.5 mg/mL，制膠，在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠；將3 mL?6mL PCR擴增產物分別和適量加樣緩沖液混合，點樣；9 V/cm恒壓電泳，直至溴酚藍指示劑遷移至凝膠中部；紫外檢測儀下觀察電泳結果并記錄。
[0044](5)顯色檢測
加入顯色劑進行顯色反應，管1-管5即I X 10' I X 10' I X 10' I X 10' I X I(T5 ng/μ L的RNA樣品均出現(xiàn)陽性擴增，反應液顏色變?yōu)榫G色，其檢測限可達到fg級；電泳結果顯示，蘋果銹果類病毒使用RT-PCR方法能夠得到10_3稀釋倍數，只有pg級水平。這說明本發(fā)明的LAMP方法的檢測靈敏度高出PCR方法100倍，如圖2和圖3所示。
[0045]實施例3:實際樣品檢測及對比實驗
將從山東、新疆等地田間采集的具有典型ASSVd類癥狀或沒有癥狀的樣品及實驗室留樣(出口臺灣梨接穗等)，分別采用LAMP、RT-PCR進行檢測，比較兩種方法的效果，以進一步評估LAMP方法的可靠性。
[0046]1、實際樣品LAMP檢測 I)病毒RNA的提取
取0.1 g樣品，加液氮研磨成粉末狀，將研磨物迅速移入1.5 mL離心管中，加入I mLTrizol Reagent,顛倒混勻，2°C ~8°C, 12000 g,離心 lOmin。取上清，15 °C ~30 °C,放置5min ;加入0.2 mL氯仿，用手劇烈震蕩(勿渦旋振蕩)，約15s。15°C ~30°C，放置2min~3min ；
2V ~8°C, 12000 g，離心15min。小心吸取約為600 μ?的上層水相，勿擾動中間相和下層相。加 500 “1^異丙醇混合上清液，151:~301:，放置101^11。2°C ~8°C, 12000 g，離心 lOmin。去除上清液，沉淀中加入I mL 75%乙醇，洗滌；21:~81:，7500 g，離心5min。去除上清液，沉淀自然干燥后，將其溶于30 UL -50 μ L無RNase的水中，即為待檢模板RNA。
[0047](3)不同來源樣品的蘋果銹果類病毒環(huán)介導等溫擴增
Α:分別在反應管中依次加入不同稀釋倍比的待檢模板RNA 2 μ L和環(huán)介導等溫擴增反應液A 23 μ L，充分混勻。
[0048]B:在63 1:恒溫反應條件下，進行環(huán)介導恒溫擴增反應60 min。
[0049]C:80 °C終止反應，5 min取出待檢。
[0050](4 ) RT-PCR擴增及檢測
RT-PCR擴增體系參照TIANGEN公司的Quant —步法RT-PCR試劑盒說明配置，反應條件為 50 °C反轉錄 30 min ；94 °C預變性 2 min; 94 °C 30 s，58 °C 30 s，72 °C 30 s，循環(huán)反應35次；65 °C延伸10 min。
[0051]取1.5 g瓊脂糖，于100 mL電泳緩沖液中加熱，充分溶化，加入溴化乙錠貯存液至終濃度為0.5 mg/mL，制膠，在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠；將3 mL?6mL PCR擴增產物分別和適量加樣緩沖液混合，點樣；9 V/cm恒壓電泳，直至溴酚藍指示劑遷移至凝膠中部；紫外檢測儀下觀察電泳結果并記錄。
[0052](5 ) LAMP產物及PCR產物檢測
LAMP產物加入顯色劑進行顯色反應，PCR產物利用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。結果顯示:利用上述LAMP和RT-PCR方法同時檢測實際樣品，所有不同地理來源的蘋果銹果類病毒樣品檢測結果均為陽性，兩種方法的符合率100%，但LAMP對設備要求更低，便捷性更高。
[0053]本發(fā)明所建立的檢測方法能快速、準確的檢測出蘋果銹果類病毒，為科學研究和生產實踐提供了一種簡便、快速、成本低廉的檢測技術，也為該病所引起的不同病害的早期預警及合理用藥提供了理論基礎和技術指導，對增加生態(tài)、社會和經濟效益都具有現(xiàn)實而深遠的意義。
【權利要求】
1.一種環(huán)介導等溫擴增的引物組，其特征在于，所述的引物組包括外側引物對F3和B3、內側引物對FIP和BIP，其序列分別為SEQ ID NO:1?4。
2.權利要求1所述的引物組在檢測蘋果銹果類病毒中的應用。
3.權利要求1所述的引物組在制備檢測蘋果銹果類病毒的試劑盒中的應用。
4.一種檢測蘋果銹果類病毒的環(huán)介導等溫擴擴增試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包含如下組分: 1)環(huán)介導等溫擴增反應液A:
2 X RT-LAMP Mix 12.5 μ L、AMV-Bst 混合液 1.5 μ L、RNase-Free Water 2.8 μ L、RT-LAMP檢測引物組6.2 μ L，F(xiàn)IP和BIP引物各2.5 μ L、終濃度均為I μ M ;F3和B3引物各0.6 μ L，終濃度均為0.25 μ M ;引物F3、B3、FIP和BIP分別具有序列表SEQ ID ΝΟ:1?4的堿基序列； 2)B反應液是陽性對照樣品:含蘋果銹果類病毒RNA模板，作為陽性模板； 3)C反應液是空白對照樣品:為去尚子水； 4)顯色劑:為10%的熒光染料SYBRGREEN I。
5.—種應用權利要求4所述的試劑盒檢測樣品中蘋果銹果類病毒的方法，其特征在于，所述的方法包括下列步驟: 1)待檢樣品RNA提取 采取Trizol法或RNA提取試劑盒抽提RNA模板， 2)蘋果銹果類病毒環(huán)介導等溫擴增 A:在反應管中依次加入待檢模板RNA 2 μ L和環(huán)介導等溫擴增反應液A 23 μ L,充分混勻； B:在63 1:恒溫反應條件下，進行環(huán)介導恒溫擴增反應60 min ； C:80 °C終止反應，5 min后取出待檢； 擴增時，設立2個對照:陽性對照和空白對照； 3)顯色檢測 在每個反應管中加入I μ L顯色劑，直接用肉眼觀察顏色變化，如果樣品的反應管中擴增反應液顏色變?yōu)槌壬?，說明待檢樣品不含蘋果銹果類病毒，如果顏色變?yōu)榫G色，則說明待檢樣品含有蘋果銹果類病毒。
【文檔編號】C12N15/11GK104498634SQ201410836420
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月29日 優(yōu)先權日:2014年12月29日
【發(fā)明者】吳興海, 張成標, 宋濤, 王簡, 封立平, 高宏偉, 紀瑛 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心