致產(chǎn)蛋異常重要病毒多重pcr檢測(cè)引物及方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種致產(chǎn)蛋異常重要病毒多重PCR檢測(cè)引物及方法，制備針對(duì)3種引起家禽產(chǎn)蛋異常重要病毒產(chǎn)蛋下降綜合征病毒、禽坦布蘇病毒及H9亞型禽流感病毒等病毒核酸的特異性捕獲探針，與對(duì)應(yīng)的病毒核酸雜交后，在連接酶作用下環(huán)化，隨后通過(guò)一對(duì)探針特異性的通用檢測(cè)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增進(jìn)行檢測(cè)，依據(jù)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物大小確定感染病原。該方法既可用于單一病毒的檢測(cè)，又可同時(shí)鑒別診斷3種不同的病毒，具有高效率、高特異性、高敏感度、低成本的特點(diǎn)，適合產(chǎn)蛋禽出現(xiàn)產(chǎn)蛋異常時(shí)大量臨床樣品的檢測(cè)分析，是明確引起產(chǎn)蛋異常的病原的早期快速鑒別診斷及分子流行病學(xué)分析的重要技術(shù)手段。
【專(zhuān)利說(shuō)明】致產(chǎn)蛋異常重要病毒多重PCR檢測(cè)引物及方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及致產(chǎn)蛋異常重要病毒多重PCR檢測(cè)引物及方法，具體涉及一種連接酶 依賴(lài)的致產(chǎn)蛋異常重要病毒多重PCR鑒別檢測(cè)方法及其應(yīng)用，屬于預(yù)防獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 近些年來(lái)，我國(guó)種禽和蛋禽在飼養(yǎng)過(guò)程中因疫病導(dǎo)致產(chǎn)蛋異常的問(wèn)題愈來(lái)愈嚴(yán) 重，主要表現(xiàn)為產(chǎn)蛋量和蛋品質(zhì)異常，如產(chǎn)蛋量難以達(dá)到正常峰值或驟然下降，出現(xiàn)軟殼 蛋、沙殼蛋、薄殼蛋、畸形蛋及小型蛋等，嚴(yán)重影響種（蛋）禽的生產(chǎn)性能，造成了巨大經(jīng)濟(jì)損 失?，F(xiàn)有研究表明，很多病原均可導(dǎo)致種（蛋）禽產(chǎn)蛋下降，如禽坦布蘇病毒（ATV)、產(chǎn)蛋下 降綜合征病毒（EDSV)、H9亞型禽流感病毒（H9AIV)、禽1型副黏病毒（APMV-I)及沙門(mén)氏菌 等多種細(xì)菌性病原。產(chǎn)蛋家禽的流行病學(xué)調(diào)查表明，60%以上的產(chǎn)蛋異常病例是由三種病毒 中的一種或兩種感染引起，而且臨床上由這三種病原感染后引起的很多臨床癥狀與病變十 分類(lèi)似，常繼發(fā)或并發(fā)而易誤診或延誤治療，從而引發(fā)更為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] 禽坦布蘇病毒屬于黃病毒科黃病毒屬的RNA病毒，是2010年4月在我國(guó)浙江、江 蘇和福建等地新發(fā)現(xiàn)的引起開(kāi)產(chǎn)蛋鴨、種鴨出現(xiàn)以產(chǎn)蛋驟降、低死亡為主要特征的急性高 度接觸性傳染病的病原。該病毒感染產(chǎn)蛋家禽后主要造成產(chǎn)蛋家禽的卵泡膜充血、出血， 卵泡變性、萎縮及瘢痕化等，極大的影響家禽的產(chǎn)蛋性能，發(fā)病后2天后家禽產(chǎn)蛋率下降達(dá) 30%-70%，嚴(yán)重的于發(fā)病后7~14天停產(chǎn)，部分感染病例出現(xiàn)不可逆性停產(chǎn)。到2014年底，我 國(guó)東南沿海及周邊地區(qū)均出現(xiàn)該病的流行，除了產(chǎn)蛋鴨和雞，鵝、肉鴨和麻雀等均有感染報(bào) 道，該病已嚴(yán)重危害到我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。
[0004] 產(chǎn)蛋下降綜合征病毒屬于禽腺病毒III型的DNA病毒，是于1976年發(fā)現(xiàn)的引起家禽 以產(chǎn)蛋下降為特征的一種傳染病的病原，該病毒感染后主要引起雞群產(chǎn)蛋驟然下降，軟殼 蛋和畸形蛋增加等，故又命名為產(chǎn)蛋下降綜合征1976。不同年齡的雞和鴨均可感染，但幼齡 家禽不表現(xiàn)臨床癥狀。產(chǎn)蛋家禽感染該病毒后，開(kāi)始發(fā)病時(shí)有或沒(méi)有一般性的下痢、食欲下 降和萎靡不振，隨后蛋殼褪色，接著泛起軟殼蛋、薄殼蛋。病程持續(xù)4?10周，產(chǎn)蛋下降幅 度達(dá)10%?40%，種蛋孵化率降低，出殼后弱雛增多，產(chǎn)蛋下降持續(xù)4?10周后一般可恢復(fù) 正常。
[0005] H9亞型禽流感病毒是正黏病毒科的RNA病毒，現(xiàn)有研究表明該病毒感染產(chǎn)蛋家禽 后同樣可引起家禽的產(chǎn)蛋率、受精率及孵化率下降等危害。當(dāng)20~ 30周齡種禽感染時(shí)， 會(huì)出現(xiàn)的呼吸道癥狀，同時(shí)產(chǎn)蛋量出現(xiàn)群體性下降，4~ 5天內(nèi)產(chǎn)蛋量可下降30 % ~70 %， 部分病例的產(chǎn)蛋禽甚至完全停止產(chǎn)蛋。4周后，產(chǎn)蛋禽緩慢恢復(fù)產(chǎn)蛋，但達(dá)不到感染前的 水平。
[0006] 連接酶依賴(lài)的PCR擴(kuò)增技術(shù)是一種由連接酶介導(dǎo)的核酸檢測(cè)技術(shù)，其工作原理 是：以一段人工合成的外源核酸序列作為捕獲探針，利用其兩端連接的與待檢核酸序列互 補(bǔ)的寡核苷酸序列，與待測(cè)樣品中的目標(biāo)的核酸雜交，從而在待檢核酸鏈上形成一個(gè)帶缺 口的、首尾靠近的環(huán)，隨后在連接酶作用將該環(huán)閉合形成一個(gè)完整的環(huán)；最后用針對(duì)該環(huán)外 源核酸序列部分的特異性引物在DNA聚合酶催化下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，達(dá)到檢測(cè)待測(cè)基因的目 的。當(dāng)檢測(cè)多個(gè)目的核酸序列時(shí)，只需加入將各自特異性的捕獲探針進(jìn)行雜交，最后用同一 對(duì)檢測(cè)引物進(jìn)PCR擴(kuò)增，即可到達(dá)鑒別診斷的目的。該技術(shù)不直接擴(kuò)增待檢核酸，而是通過(guò) 擴(kuò)增與待檢基因特異性雜交的外源基因來(lái)達(dá)到檢測(cè)待檢核酸的目的，既避免了檢測(cè)的非特 異性，又因減少了 PCR擴(kuò)增時(shí)的引物數(shù)量，使檢測(cè)效率和敏感性得到了保證。
[0007] 因此，根據(jù)連接酶依賴(lài)的PCR擴(kuò)增技術(shù)原理，建立一種可快速鑒別診斷禽坦布蘇 病毒、產(chǎn)蛋下降綜合征病毒、H9亞型禽流感病毒的多重PCR檢測(cè)方法作為產(chǎn)蛋家禽產(chǎn)蛋異 常病原的常規(guī)性檢測(cè)及疫病突發(fā)時(shí)病原的及時(shí)確診是十分有效的，為產(chǎn)蛋異常疫病病原的 早期診斷及防治措施的制定和執(zhí)行提供可靠的技術(shù)支撐。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供致產(chǎn)蛋異常重要病毒多重PCR檢測(cè)引物及方法。該方法是基于連接酶 的工作原理，用特異性的捕獲探針與對(duì)應(yīng)的病毒核酸雜交，并在連接酶作用下環(huán)化，隨后應(yīng) 用一對(duì)通用引物對(duì)環(huán)化的、針對(duì)不同病原的捕獲探針進(jìn)行檢測(cè)，依據(jù)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物大小 確定感染病原。
[0009] 所述連接酶是指DNA Taq連接酶。
[0010] 所述的3種引起產(chǎn)蛋禽產(chǎn)蛋異常重要病毒為產(chǎn)蛋下降綜合征病毒、禽坦布蘇病毒 及H9亞型禽流感病毒，其特異性的捕獲探針序列分別如Seq ID No. l，Seq ID No. 2和Seq ID No. 3 所示。
[0011] 針對(duì)3種病毒核酸捕獲探針的通用檢測(cè)引物序列如Seq ID No. 4和Seq ID No. 5 所示。
[0012] 其檢測(cè)程序主要分3個(gè)階段，第一階段為變性階段，95°C維持5 min ;第二階段為 連接酶介導(dǎo)的捕獲探針與模板的雜交及探針環(huán)化階段，95°C 50 s，55°C~63°C 5-10 min 進(jìn)行6個(gè)循環(huán)；第三階段為PCR檢測(cè)階段95°C 30 s，52°C~56°C 30 s，72°C 30 s進(jìn)行 25個(gè)循環(huán)，最后72 °C 10 min結(jié)束反應(yīng)。
[0013] 為獲得上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：依賴(lài)于連接酶的多重PCR擴(kuò)增 方法，包括以下步驟： 1、病原核酸特異性探針的制備：根據(jù)GenBank中已發(fā)布的產(chǎn)蛋下降綜合征病毒的 IOOkd蛋白基因、禽坦布蘇病毒的衣殼蛋白基因及H9亞型禽流感病毒的血凝素蛋白基因保 守區(qū)序列保守區(qū)及增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP)基因的部分序列，設(shè)計(jì)3對(duì)引物，這3對(duì)引物 的特征在于5'端分別為以上3種病原核酸序列的互補(bǔ)寡核苷酸序列，3'端為外源基因(本 發(fā)明中為增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因)核酸序列。以綠色熒光蛋白質(zhì)粒作為模板，用這3對(duì)引 物分別進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，獲得的3種擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化回收后即可作為病毒核酸特異性捕 獲探針。
[0014] 2、通用檢測(cè)引物的設(shè)計(jì)：根據(jù)3種病原捕獲探針的共有序列(外源基因部分，即增 強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因）設(shè)計(jì)一對(duì)反向引物，該對(duì)引物的特征在于其與待檢測(cè)的病原目的 基因親緣關(guān)系遠(yuǎn)，特異性的與已環(huán)化的捕獲探針上的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因雜交后，在 DNA聚合酶作用下啟動(dòng)PCR擴(kuò)增過(guò)程。
[0015] 3、多重PCR檢測(cè)方法的建立和優(yōu)化： (A)多重PCR反應(yīng)體系的配置，所述多重PCR反應(yīng)體系總計(jì)30 μ?，包括dNTPs 0.3 mM， IOXTaq DNA連接酶反應(yīng)緩沖液3 μ?，Taq DNA連接酶0.5 μ?，IOXTaq DAN聚合酶反應(yīng) 緩沖液3 PL (含Mg2+)，Taq DNA聚合酶0.50 μ?，通用檢測(cè)引物各8 pmol，3種捕獲探 針和DNA或cDNA溶液各2 μ?，加去離子水補(bǔ)足至30 μ?，另外配置一份不含樣品DNA或 cDNA的反應(yīng)液做陰性對(duì)照。
[0016] (B)多重PCR的反應(yīng)程序所有反應(yīng)均在同一個(gè)反應(yīng)管中完成，主要分3個(gè)階段，第 一階段為變性階段，95°C維持5 min ;第二階段為連接酶介導(dǎo)的捕獲探針與模板的雜交及探 針環(huán)化階段，95°C 50 s，55°C~63°C 5-10 min進(jìn)行6個(gè)循環(huán)；第三階段為PCR檢測(cè)階段 95°C 30 s, 52°C~56°C 30 s, 72°C 30 s 進(jìn)行 25 個(gè)循環(huán)，最后 72 °C 10 min 結(jié)束反應(yīng)。 擴(kuò)增結(jié)束后立即進(jìn)行電泳顯示檢測(cè)結(jié)果。PCR檢測(cè)的特異性還可以通過(guò)將PCR產(chǎn)物純化回 收后送生工上海生物工程有限公司測(cè)序驗(yàn)證。
[0017] (C)檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)化優(yōu)化的技術(shù)方案中，應(yīng)用上述3種捕獲探針與待檢樣品的核 酸雜交時(shí)，每3〇μ?的PCR反應(yīng)體系中每個(gè)探針的用量為8-12 pmoL。
[0018] 優(yōu)化的技術(shù)方案中，應(yīng)用的通用引物檢測(cè)環(huán)化的捕獲探針時(shí)，每3〇μ?的PCR反應(yīng) 體系中每個(gè)探針的用量為7-10 pmoL。
[0019] 本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)： 根據(jù)連接酶的工作原理，本發(fā)明首次建立了一種連接酶依賴(lài)的致產(chǎn)蛋異常重要病毒多 重PCR檢測(cè)技術(shù)，特異性的應(yīng)用于引起家禽產(chǎn)蛋異常重要病毒產(chǎn)蛋下降綜合征病毒、禽坦 布蘇病毒及H9亞型禽流感病毒的快速鑒別。該方法既可用于單一病毒的檢測(cè)，又可同時(shí)鑒 別3種不同的病毒，具有高效率、低成本的特點(diǎn)。
[0020] 本發(fā)明中所涉及的病毒核酸特異性捕獲探針是以與所檢測(cè)的3種病毒核酸序列 親緣關(guān)系都很遠(yuǎn)的綠色熒光蛋白基因片段為骨架，在片段兩端各連接一段與待檢測(cè)病毒核 酸序列互補(bǔ)的寡核苷酸序列后制備而成。通過(guò)探針兩端的目的基因互補(bǔ)序列特異性捕獲目 的病毒基因，而中間的綠色熒光蛋白基因片段則作為3種探針的共有序列并作為PCR檢測(cè) 的靶基因。因此，既避免了傳統(tǒng)多重PCR技術(shù)中多引物相互間的干擾擴(kuò)增效率的問(wèn)題，又因 為通過(guò)擴(kuò)增與待檢基因雜交的外源基因避免了檢測(cè)的非特異性，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性和敏 感性。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1是實(shí)施例中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖。圖中各泳道分別代表為：M、DNA Marker (DL2000) ; 1、減蛋綜合征病毒；2、禽坦布蘇病毒；3、H9亞型禽流感病毒；4、減蛋綜合征病 毒+禽坦布蘇病毒；5、減蛋綜合征病毒+H9亞型禽流感病毒；6、禽坦布蘇病毒+H9亞型禽流 感病毒；7、減蛋綜合征病毒+禽坦布蘇病毒+H9亞型禽流感病毒；8、陰性對(duì)照。

【具體實(shí)施方式】
[0022] 實(shí)施例1 病毒特異性捕獲探針的制備 本發(fā)明中用于檢測(cè)引起家禽產(chǎn)蛋異常的3種病毒的特異性捕獲探針，是通過(guò)如下方法 推導(dǎo)獲得的： 1. I、根據(jù)GenBank中已發(fā)布的產(chǎn)蛋下降綜合征病毒（EDSV)的IOOkd基因、禽坦布蘇病 毒（ATV)的衣殼蛋白基因及H9亞型禽流感病毒（H9AIV)的血凝素蛋白基因保守區(qū)序列保 守區(qū)及增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP)的部分序列，設(shè)計(jì)3對(duì)引物用于制備捕獲探針（引物信 息見(jiàn)下表1)。

【權(quán)利要求】
1. 用于家禽產(chǎn)蛋異常重要病毒多重PCR檢測(cè)方法的引物，其特征在于：所述的引物序 列如 Seq ID No. 4 和 Seq ID No. 5 所示。
2. 用于家禽產(chǎn)蛋異常重要病毒多重PCR檢測(cè)方法的探針，其特征在于：所述特異性的 捕獲探針序列分別如Seq ID No. 1，Seq ID No. 2和Seq ID No. 3所示。
3. 如權(quán)利要求1或2所述引物用于家禽產(chǎn)蛋異常重要病毒多重PCR鑒檢測(cè)方法，其特 征在于：利用病毒特異性探針與對(duì)應(yīng)病毒核酸雜交環(huán)化后，通過(guò)探針特異性的通用檢測(cè)引 物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，達(dá)到同時(shí)檢測(cè)3種引起家禽產(chǎn)蛋異常病原的目的。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多重PCR鑒別檢測(cè)方法，其特征在于：所述連接酶是指DNA Taq連接酶。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多重PCR鑒別檢測(cè)方法，其特征在于：其檢測(cè)程序主要分3 個(gè)階段，第一階段為變性階段，95°C維持5 min ;第二階段為連接酶介導(dǎo)的捕獲探針與模板 的雜交及探針環(huán)化階段，95°C 50 s，55°C~63°C 5-10 min進(jìn)行6個(gè)循環(huán)；第三階段為PCR 檢測(cè)階段 95°C 30 s, 52°C~56°C 30 s, 72°C 30 s 進(jìn)行 25 個(gè)循環(huán)，最后 72 °C 10 min 結(jié)束反應(yīng)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK104498631SQ201410823782
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月26日
【發(fā)明者】傅光華, 傅秋玲, 黃瑜, 程龍飛, 施少華, 陳紅梅, 萬(wàn)春和, 陳翠騰, 林建生 申請(qǐng)人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所