一種長(zhǎng)期保存蛹蟲草菌種的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及菌種保存【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種長(zhǎng)期保存蛹蟲草菌種的方法，包括如下步驟：A、菌種培養(yǎng)：在無菌條件下，將蛹蟲草健康菌種接種到滅菌好的PDA斜面培養(yǎng)基上，進(jìn)行暗培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿斜面40%-60%后，進(jìn)行光培養(yǎng)；B、培養(yǎng)基脫水：將裝有培養(yǎng)物的試管放入干燥皿，再將干燥皿置于冰箱中，待斜面培養(yǎng)基脫水至體積剩下20%-30%時(shí)，取出試管；C、菌種保存：往試管中緩慢注入滅菌好的石蠟油至淹沒培養(yǎng)物1cm以上，震蕩去除培養(yǎng)物表面氣泡，塞入滅菌好的脫脂棉花，用滅菌好的石蠟封口后加蓋滅菌好的pp薄膜，垂直擺放于0℃冰箱保存。本發(fā)明能更好地抑制菌種的生理活動(dòng)，菌種能保存3年以上，且保存后的菌種活力依然較好。
【專利說明】一種長(zhǎng)期保存蛹蟲草菌種的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及菌種保存【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種長(zhǎng)期保存蛹蟲草菌種的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)有的石蠟保存法的一般步驟為:將液體石蠟滅菌，放于37°C恒溫箱中，使水汽蒸發(fā)掉備用。再將已分純的待存菌在最適宜的斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使得到健壯的菌體，用無菌吸管吸取已滅菌的液體石蠟，注入已長(zhǎng)好的斜面培養(yǎng)基上，用量以高出斜面Icm為準(zhǔn)，將試管直立，貼上標(biāo)簽，置4°C下保存。該方法制作簡(jiǎn)單，不需要特殊設(shè)備，菌種可以保存I年左右不需要經(jīng)常移種，缺點(diǎn)是保存的時(shí)候需要直立放置。
[0003]但對(duì)于有些生命力頑強(qiáng)的菌種，如蛹蟲草菌種，現(xiàn)有的石蠟保存法并不適用，因此，有必要研發(fā)一種能更好地抑制菌種的生理活動(dòng)的長(zhǎng)期保存方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點(diǎn)和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種長(zhǎng)期保存蛹蟲草菌種的方法，該方法能更好地抑制菌種的生理活動(dòng)，相比現(xiàn)有的液體石蠟保存法，經(jīng)本發(fā)明的方法保存的蛹蟲草菌種能保存3年以上，且保存后的菌種活力依然較好。
[0005]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種長(zhǎng)期保存蛹蟲草菌種的方法，包括如下步驟:
A、菌種培養(yǎng):在無菌條件下，將蛹蟲草健康菌種接種到滅菌好的PDA斜面培養(yǎng)基上，進(jìn)行暗培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿斜面40%-60%后，進(jìn)行光培養(yǎng)；
B、培養(yǎng)基脫水:將裝有培養(yǎng)物的試管放入干燥皿，再將干燥皿置于冰箱中，待斜面培養(yǎng)基脫水至體積剩下20%-30%時(shí)，取出試管；
C、菌種保存:往試管中緩慢注入滅菌好的石蠟油至淹沒培養(yǎng)物Icm以上，震蕩去除培養(yǎng)物表面氣泡，塞入滅菌好的脫脂棉花，用滅菌好的石蠟封口后加蓋滅菌好的pp薄膜，垂直擺放于0°C冰箱保存。優(yōu)選的，緩慢注入滅菌好的石蠟油至淹沒培養(yǎng)物l-3cm。
[0006]本發(fā)明通過將菌絲長(zhǎng)滿斜面40%_60%后，再進(jìn)行光培養(yǎng)，可以根據(jù)菌絲的生長(zhǎng)速度來決定培養(yǎng)時(shí)間。本發(fā)明通過在石蠟封口后加蓋滅菌好的PP薄膜，能保持試管口的衛(wèi)生，防止污染。
[0007]優(yōu)選的，所述步驟A之前還包括步驟A0、材料準(zhǔn)備:將裝有PDA斜面培養(yǎng)基的試管用4層報(bào)紙封口，滅菌前在試管的內(nèi)外各加I層pp薄膜，高溫高壓滅菌后去掉外層的pp薄膜，在超凈臺(tái)上晾至常溫，接種后去掉內(nèi)層的PP薄膜；將脫脂棉花、石蠟和石蠟油滅菌備用。
[0008]本發(fā)明通過將裝有PDA斜面培養(yǎng)基的試管用4層報(bào)紙封口，其透氣性較好，方便后續(xù)培養(yǎng)基的脫水；本發(fā)明通過在試管的內(nèi)外各加I層PP薄膜，能防止PDA斜面培養(yǎng)基在滅菌過程中破損；本發(fā)明通過在高溫高壓滅菌后去掉外層的PP薄膜，有利報(bào)紙上水分蒸發(fā)，保證干爽，減少污染。
[0009]優(yōu)選的，所述步驟A中，暗培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為24°C ±1°C，培養(yǎng)時(shí)間為2-3天。
[0010]所述暗培養(yǎng)在干爽環(huán)境下進(jìn)行，能減少污染；本發(fā)明通過將暗培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度控制在24°C ±1°C，培養(yǎng)時(shí)間控制在2-3天，有利于菌絲的生長(zhǎng)。
[0011]更為優(yōu)選的，所述步驟A中，暗培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為24°C，培養(yǎng)時(shí)間為2天。
[0012]優(yōu)選的，所述步驟A中，光培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為24°C ±1°C，光照強(qiáng)度為400-6001ux，培養(yǎng)時(shí)間為1-2天。
[0013]本發(fā)明通過將光照強(qiáng)度控制在400-6001UX，有利于分生孢子的生長(zhǎng)；本發(fā)明通過將培養(yǎng)時(shí)間控制在1-2天，分生孢子數(shù)量多，質(zhì)量好。
[0014]更為優(yōu)選的，所述步驟A中，光培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為24°C，光照強(qiáng)度為5001ux，培養(yǎng)時(shí)間為I天。
[0015]上述一種長(zhǎng)期保存蛹蟲草菌種的方法得到的蛹蟲草菌種，所述蛹蟲草菌種的保存時(shí)間為3-4年。
[0016]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明的方法采用培養(yǎng)基脫水步驟，能抑制菌種的生理活性，并配合低溫保存，進(jìn)一步抑制菌種的生理代謝，延長(zhǎng)保存時(shí)間。本發(fā)明的方法能更好地抑制菌種的生理活動(dòng)，相比現(xiàn)有的液體石蠟保存法，經(jīng)本發(fā)明的方法保存的蛹蟲草菌種能保存3年以上，且保存后的菌種活力依然較好。
[0017]蛹蟲草人工培養(yǎng)中，出發(fā)菌種的質(zhì)量是決定子實(shí)體有效成分含量高低的關(guān)鍵因素，但蛹蟲草優(yōu)良菌種在繁殖過程中，退化是難以避免的。因此，篩選獲得優(yōu)良菌種之后，將之有效保存，并在必要的時(shí)候復(fù)活，最大程度發(fā)揮菌種的生產(chǎn)性能，將有利于保證優(yōu)良菌種的供應(yīng)，促進(jìn)人工栽培蛹蟲草的規(guī)?；彤a(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

【具體實(shí)施方式】
[0018]為了便于本領(lǐng)域技術(shù)人員的理解，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，實(shí)施方式提及的內(nèi)容并非對(duì)本發(fā)明的限定。
[0019]實(shí)施例1
一種長(zhǎng)期保存蛹蟲草菌種的方法，包括如下步驟:
A、菌種培養(yǎng):在無菌條件下，將蛹蟲草健康菌種接種到滅菌好的PDA斜面培養(yǎng)基上，進(jìn)行暗培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿斜面40%后，進(jìn)行光培養(yǎng)；
B、培養(yǎng)基脫水:將裝有培養(yǎng)物的試管放入干燥皿，再將干燥皿置于冰箱中，待斜面培養(yǎng)基脫水至體積剩下20%時(shí)，取出試管；
C、菌種保存:在超凈工作臺(tái)上往試管中緩慢注入滅菌好的石蠟油至淹沒培養(yǎng)物1cm，用小型漩渦振蕩器去除培養(yǎng)物表面氣泡，塞入滅菌好的脫脂棉花，用滅菌好的石蠟封口后加蓋滅菌好的PP薄膜，垂直擺放于0°C冰箱保存。
[0020]所述步驟A之前還包括步驟A0、材料準(zhǔn)備:將裝有PDA斜面培養(yǎng)基的試管用4層報(bào)紙封口，滅菌前在試管的內(nèi)外各加I層pp薄膜，高溫高壓滅菌后去掉外層的pp薄膜，在超凈臺(tái)上晾至常溫，接種后去掉內(nèi)層的PP薄膜；將脫脂棉花、石蠟和石蠟油滅菌備用。
[0021]所述步驟A中，暗培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為23°C，干爽環(huán)境下培養(yǎng)2天。
[0022]所述步驟A中，光培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為23°C，光照強(qiáng)度為4001ux，培養(yǎng)時(shí)間為2天。
[0023]上述一種長(zhǎng)期保存蛹蟲草菌種的方法得到的蛹蟲草菌種，所述蛹蟲草菌種的保存時(shí)間為3年。
[0024]實(shí)施例2
一種長(zhǎng)期保存蛹蟲草菌種的方法，包括如下步驟:
A、菌種培養(yǎng):在無菌條件下，將蛹蟲草健康菌種接種到滅菌好的PDA斜面培養(yǎng)基上，進(jìn)行暗培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿斜面45%后，進(jìn)行光培養(yǎng)；
B、培養(yǎng)基脫水:將裝有培養(yǎng)物的試管放入干燥皿，再將干燥皿置于冰箱中，待斜面培養(yǎng)基脫水至體積剩下22%時(shí)，取出試管；
C、菌種保存:在超凈工作臺(tái)上往試管中緩慢注入滅菌好的石蠟油至淹沒培養(yǎng)物
1.5cm，用小型漩渦振蕩器去除培養(yǎng)物表面氣泡，塞入滅菌好的脫脂棉花，用滅菌好的石蠟封口后加蓋滅菌好的PP薄膜，垂直擺放于0°C冰箱保存。
[0025]所述步驟A之前還包括步驟A0、材料準(zhǔn)備:將裝有PDA斜面培養(yǎng)基的試管用4層報(bào)紙封口，滅菌前在試管的內(nèi)外各加I層pp薄膜，高溫高壓滅菌后去掉外層的pp薄膜，在超凈臺(tái)上晾至常溫，接種后去掉內(nèi)層的PP薄膜；將脫脂棉花、石蠟和石蠟油滅菌備用。
[0026]所述步驟A中，暗培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為24°C，干爽環(huán)境下培養(yǎng)3天。
[0027]所述步驟A中，光培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為23°C，光照強(qiáng)度為4501ux，培養(yǎng)時(shí)間為I天。
[0028]上述一種長(zhǎng)期保存蛹蟲草菌種的方法得到的蛹蟲草菌種，所述蛹蟲草菌種的保存時(shí)間為3.5年。
[0029]實(shí)施例3
一種長(zhǎng)期保存蛹蟲草菌種的方法，包括如下步驟:
A、菌種培養(yǎng):在無菌條件下，將蛹蟲草健康菌種接種到滅菌好的PDA斜面培養(yǎng)基上，進(jìn)行暗培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿斜面50%后，進(jìn)行光培養(yǎng)；
B、培養(yǎng)基脫水:將裝有培養(yǎng)物的試管放入干燥皿，再將干燥皿置于冰箱中，待斜面培養(yǎng)基脫水至體積剩下25%時(shí)，取出試管；
C、菌種保存:在超凈工作臺(tái)上往試管中緩慢注入滅菌好的石蠟油至淹沒培養(yǎng)物2cm，用小型漩渦振蕩器去除培養(yǎng)物表面氣泡，塞入滅菌好的脫脂棉花，用滅菌好的石蠟封口后加蓋滅菌好的PP薄膜，垂直擺放于0°C冰箱保存。
[0030]所述步驟A之前還包括步驟A0、材料準(zhǔn)備:將裝有PDA斜面培養(yǎng)基的試管用4層報(bào)紙封口，滅菌前在試管的內(nèi)外各加I層pp薄膜，高溫高壓滅菌后去掉外層的pp薄膜，在超凈臺(tái)上晾至常溫，接種后去掉內(nèi)層的PP薄膜；將脫脂棉花、石蠟和石蠟油滅菌備用。
[0031]所述步驟A中，暗培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為24°C，干爽環(huán)境下培養(yǎng)2天。
[0032]所述步驟A中，光培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為24°C，光照強(qiáng)度為5001ux，培養(yǎng)時(shí)間為I天。
[0033]上述一種長(zhǎng)期保存蛹蟲草菌種的方法得到的蛹蟲草菌種，所述蛹蟲草菌種的保存時(shí)間為4年。
[0034]實(shí)施例4
一種長(zhǎng)期保存蛹蟲草菌種的方法，包括如下步驟:
A、菌種培養(yǎng):在無菌條件下，將蛹蟲草健康菌種接種到滅菌好的PDA斜面培養(yǎng)基上，進(jìn)行暗培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿斜面55%后，進(jìn)行光培養(yǎng)；
B、培養(yǎng)基脫水:將裝有培養(yǎng)物的試管放入干燥皿，再將干燥皿置于冰箱中，待斜面培養(yǎng)基脫水至體積剩下28%時(shí)，取出試管； C、菌種保存:在超凈工作臺(tái)上往試管中緩慢注入滅菌好的石蠟油至淹沒培養(yǎng)物
2.5cm，用小型漩渦振蕩器去除培養(yǎng)物表面氣泡，塞入滅菌好的脫脂棉花，用滅菌好的石蠟封口后加蓋滅菌好的PP薄膜，垂直擺放于0°C冰箱保存。
[0035]所述步驟A之前還包括步驟A0、材料準(zhǔn)備:將裝有PDA斜面培養(yǎng)基的試管用4層報(bào)紙封口，滅菌前在試管的內(nèi)外各加I層pp薄膜，高溫高壓滅菌后去掉外層的pp薄膜，在超凈臺(tái)上晾至常溫，接種后去掉內(nèi)層的PP薄膜；將脫脂棉花、石蠟和石蠟油滅菌備用。
[0036]所述步驟A中，暗培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為23°C，干爽環(huán)境下培養(yǎng)3天。
[0037]所述步驟A中，光培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為24°C，光照強(qiáng)度為5501ux，培養(yǎng)時(shí)間為2天。
[0038]上述一種長(zhǎng)期保存蛹蟲草菌種的方法得到的蛹蟲草菌種，所述蛹蟲草菌種的保存時(shí)間為3.5年。
[0039]實(shí)施例5
一種長(zhǎng)期保存蛹蟲草菌種的方法，包括如下步驟:
A、菌種培養(yǎng):在無菌條件下，將蛹蟲草健康菌種接種到滅菌好的PDA斜面培養(yǎng)基上，進(jìn)行暗培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿斜面60%后，進(jìn)行光培養(yǎng)；
B、培養(yǎng)基脫水:將裝有培養(yǎng)物的試管放入干燥皿，再將干燥皿置于冰箱中，待斜面培養(yǎng)基脫水至體積剩下30%時(shí)，取出試管；
C、菌種保存:在超凈工作臺(tái)上往試管中緩慢注入滅菌好的石蠟油至淹沒培養(yǎng)物3cm，用小型漩渦振蕩器去除培養(yǎng)物表面氣泡，塞入滅菌好的脫脂棉花，用滅菌好的石蠟封口后加蓋滅菌好的PP薄膜，垂直擺放于0°C冰箱保存。
[0040]所述步驟A之前還包括步驟A0、材料準(zhǔn)備:將裝有PDA斜面培養(yǎng)基的試管用4層報(bào)紙封口，滅菌前在試管的內(nèi)外各加I層pp薄膜，高溫高壓滅菌后去掉外層的pp薄膜，在超凈臺(tái)上晾至常溫，接種后去掉內(nèi)層的PP薄膜；將脫脂棉花、石蠟和石蠟油滅菌備用。
[0041]所述步驟A中，暗培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為25°C，干爽環(huán)境下培養(yǎng)2天。
[0042]所述步驟A中，光培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為25°C，光照強(qiáng)度為6001ux，培養(yǎng)時(shí)間為I天。
[0043]上述一種長(zhǎng)期保存蛹蟲草菌種的方法得到的蛹蟲草菌種，所述蛹蟲草菌種的保存時(shí)間為3年。
[0044]本發(fā)明的方法采用培養(yǎng)基脫水步驟，能抑制菌種的生理活性，并配合低溫保存，進(jìn)一步抑制菌種的生理代謝，延長(zhǎng)保存時(shí)間。本發(fā)明的方法能更好地抑制菌種的生理活動(dòng)，相比現(xiàn)有的液體石蠟保存法，經(jīng)本發(fā)明的方法保存的蛹蟲草菌種能保存3年以上，且保存后的菌種活力依然較好。
[0045]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)現(xiàn)方案，除此之外，本發(fā)明還可以其它方式實(shí)現(xiàn)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下任何顯而易見的替換均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種長(zhǎng)期保存蛹蟲草菌種的方法，其特征在于:包括如下步驟: A、菌種培養(yǎng):在無菌條件下，將蛹蟲草健康菌種接種到滅菌好的PDA斜面培養(yǎng)基上，進(jìn)行暗培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿斜面40%-60%后，進(jìn)行光培養(yǎng)； B、培養(yǎng)基脫水:將裝有培養(yǎng)物的試管放入干燥皿，再將干燥皿置于冰箱中，待斜面培養(yǎng)基脫水至體積剩下20%-30%時(shí)，取出試管； C、菌種保存:往試管中緩慢注入滅菌好的石蠟油至淹沒培養(yǎng)物Icm以上，震蕩去除培養(yǎng)物表面氣泡，塞入滅菌好的脫脂棉花，用滅菌好的石蠟封口后加蓋滅菌好的pp薄膜，垂直擺放于O °C冰箱保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種長(zhǎng)期保存蛹蟲草菌種的方法，其特征在于:所述步驟A之前還包括步驟A0、材料準(zhǔn)備:將裝有PDA斜面培養(yǎng)基的試管用4層報(bào)紙封口，滅菌前在試管的內(nèi)外各加I層PP薄膜，高溫高壓滅菌后去掉外層的PP薄膜，在超凈臺(tái)上瞭至常溫，接種后去掉內(nèi)層的PP薄膜；將脫脂棉花、石蠟和石蠟油滅菌備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種長(zhǎng)期保存蛹蟲草菌種的方法，其特征在于:所述步驟A中，暗培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為24°C ± I °C，培養(yǎng)時(shí)間為2-3天。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種長(zhǎng)期保存蛹蟲草菌種的方法，其特征在于:所述步驟A中，暗培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為24°C，培養(yǎng)時(shí)間為2天。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種長(zhǎng)期保存蛹蟲草菌種的方法，其特征在于:所述步驟A中，光培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為24°C ±1°C，光照強(qiáng)度為400-6001ux，培養(yǎng)時(shí)間為1_2天。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種長(zhǎng)期保存蛹蟲草菌種的方法，其特征在于:所述步驟A中，光培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為24°C，光照強(qiáng)度為5001ux，培養(yǎng)時(shí)間為I天。
7.如權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的一種長(zhǎng)期保存蛹蟲草菌種的方法得到的蛹蟲草菌種，其特征在于:所述蛹蟲草菌種的保存時(shí)間為3-4年。
【文檔編號(hào)】C12N1/04GK104450521SQ201410800709
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月22日
【發(fā)明者】鄭貴朝, 葉錦泉, 喻孟君 申請(qǐng)人:東莞市生物技術(shù)研究所