一種基于全基因組str建立動(dòng)物親權(quán)鑒定系統(tǒng)的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及種質(zhì)資源保護(hù)領(lǐng)域，特別涉及動(dòng)物親權(quán)鑒定領(lǐng)域，公開(kāi)了一種基于全基因組STR建立動(dòng)物親權(quán)鑒定系統(tǒng)的方法，包括：1)全基因組STR位點(diǎn)查找；2)STR位點(diǎn)的初步篩選；3)引物設(shè)計(jì)；4)動(dòng)物群體隨機(jī)抽樣并提取基因組DNA；5)STR位點(diǎn)群體多態(tài)性驗(yàn)證；6)對(duì)具有遺傳多態(tài)性的STR位點(diǎn)進(jìn)行哈迪-溫伯格平衡檢驗(yàn)，篩選出基因型頻率分布滿足哈迪-溫伯格平衡的STR位點(diǎn)；7)STR位點(diǎn)的法醫(yī)學(xué)學(xué)應(yīng)用價(jià)值評(píng)價(jià)；8)建立STR親權(quán)鑒定系統(tǒng)。該方法具有操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，所構(gòu)建親權(quán)鑒定系統(tǒng)的非父排除率可達(dá)0.99以上，能準(zhǔn)確進(jìn)行動(dòng)物親權(quán)鑒定從而可用于指導(dǎo)珍稀物種的繁育及經(jīng)濟(jì)類物種的鑒別及育種。
【專利說(shuō)明】一種基于全基因組STR建立動(dòng)物親權(quán)鑒定系統(tǒng)的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種親權(quán)鑒定系統(tǒng)的建立方法，特別涉及一種基于全基因組序列中 STR位點(diǎn)建立用于動(dòng)物親權(quán)鑒定系統(tǒng)的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 無(wú)論是對(duì)珍稀動(dòng)物種質(zhì)資源的保護(hù)，還是對(duì)具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值動(dòng)物的繁育，要求 對(duì)動(dòng)物個(gè)體識(shí)別與親權(quán)鑒定的事件越來(lái)越多。例如，對(duì)大熊貓進(jìn)行親子鑒定和個(gè)體識(shí)別，有 助于避免人工飼養(yǎng)繁殖中近親繁殖的難題，對(duì)拯救大熊貓物種有重要意義。又如，在現(xiàn)代育 馬業(yè)及賽馬業(yè)中，對(duì)一些優(yōu)秀品種的馬匹進(jìn)行出生來(lái)源鑒定也備受重視。
[0003] DNA分子標(biāo)記由于能直接反映遺傳物質(zhì)本身或基因組的變化差異等，且大多數(shù)呈 中性突變，遺傳較為穩(wěn)定，符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，不受生理期和環(huán)境的影響，并在群體中具 有高度多態(tài)性和較高的雜合度等，因此在動(dòng)物個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定方面有重要的應(yīng)用前 景。DNA分子標(biāo)記主要包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性、隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性、DNA指紋圖、小衛(wèi) 星DNA、微衛(wèi)星DNA標(biāo)記和單核苷酸多態(tài)性分析等。
[0004] 微衛(wèi)星DNA，又稱短串聯(lián)重復(fù)序列（Short Tandem Repeat，STR)，是以1?6個(gè)喊基 為核心而組成的短串聯(lián)重復(fù)序列，廣泛隨機(jī)地分布于真核生物基因組中，在動(dòng)物基因組DNA 序列中，平均6?IOkb就可能出現(xiàn)一個(gè)，其一般大小為100?350堿基。微衛(wèi)星DNA比其 他標(biāo)記更具有檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、快速，分析材料廣泛，重復(fù)性好，結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，因此被認(rèn)為 是進(jìn)行個(gè)體識(shí)別與親權(quán)鑒定的絕佳分子標(biāo)記。
[0005] 親權(quán)鑒定的基本原理有兩點(diǎn)：
[0006] 1，在肯定子代的某個(gè)標(biāo)記基因是來(lái)自生父，而假設(shè)父親并不帶有這個(gè)基因的情況 下，可以排除它是該子代的父親。由此可知，被檢查的血型系統(tǒng)或DNA分子標(biāo)記個(gè)數(shù)越多， 假設(shè)父親被排除的幾率越大；
[0007] 2,在肯定子代的某些標(biāo)記基因是來(lái)自生父，而假定父親也帶有這些基因的情況 下，不能排除它是該子代的生父。這時(shí)可以計(jì)算出它是該子代生父的概率，在使用多個(gè)遺 傳標(biāo)記時(shí)，通常計(jì)算其累積排除概率：假設(shè)若干相互獨(dú)立的標(biāo)記個(gè)數(shù)排除概率分別為P n P2……Pn，則η個(gè)相互獨(dú)立的標(biāo)記個(gè)數(shù)的累積排除概率為：
[0008] Pc= (ι-p D (I-P2)……（I-Pn)
[0009] 在動(dòng)物育種及家畜問(wèn)題引起的民事糾紛中，STR分型技術(shù)已經(jīng)被用于多種動(dòng)物的 親子鑒定，但是由于傳統(tǒng)方法在開(kāi)發(fā)和利用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的同時(shí)，必須首先通過(guò)克隆STR 位點(diǎn)，測(cè)序得到其兩側(cè)特異的保守序列，并以此設(shè)計(jì)引物。該方法整個(gè)過(guò)程周期長(zhǎng)，并且篩 選通量低，從而給STR的應(yīng)用帶來(lái)了一定的困難和障礙。目前隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和測(cè)序 通量的不斷提高，越來(lái)越多的全新物種基因組得到解碼，可以通過(guò)STR查找軟件非常方便 的查找STR位點(diǎn)及其兩側(cè)序列?；诖?，本發(fā)明開(kāi)發(fā)了從基因組參考序列出發(fā)，建立動(dòng)物 STR親權(quán)鑒定系統(tǒng)的方法。
[0010] 經(jīng)過(guò)文獻(xiàn)檢索，未見(jiàn)與本發(fā)明相同的公開(kāi)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的在于提供一種在動(dòng)物全基因組序列中篩選STR位點(diǎn)進(jìn)而建立STR親 權(quán)鑒定系統(tǒng)的方法。
[0012] 本發(fā)明建立了一套基于全基因組參考序列信息建立該物種STR親權(quán)鑒定系統(tǒng)的 整套方法。依據(jù)本發(fā)明中的方法，能夠快速建立目標(biāo)物種的STR親權(quán)鑒定系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠 有效鑒定動(dòng)物個(gè)體間的親子關(guān)系及親緣關(guān)系，因此能夠?yàn)閯?dòng)物育種提供有力指導(dǎo)。
[0013] 一種基于全基因組STR建立動(dòng)物親權(quán)鑒定系統(tǒng)的方法，包括以下步驟：
[0014] 1)全基因組STR位點(diǎn)查找：通過(guò)串聯(lián)重復(fù)序列查找軟件Tandem R印eat Finder(TRF)在所研宄物種全基因組尋找所有STR位點(diǎn)；
[0015] 2)STR位點(diǎn)的初步篩選：統(tǒng)計(jì)出該物種全基因組參考序列中重復(fù)單位為4個(gè)堿基 的STR位點(diǎn)，參考該物種群體遺傳多態(tài)性高低情況，并從中隨機(jī)選取50?300個(gè)STR位點(diǎn)；
[0016] 3)引物設(shè)計(jì)：對(duì)于步驟2)中所選取的每一個(gè)STR位點(diǎn)，在串聯(lián)重復(fù)序列前后兩端 200堿基長(zhǎng)度的保守序列內(nèi)，分別設(shè)計(jì)用于多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)的正向引物和反向引物；
[0017] 4)動(dòng)物群體隨機(jī)抽樣并提取基因組DNA :在所研宄的動(dòng)物群體中通過(guò)隨機(jī)抽樣的 方式獲得樣本，并提取樣本中所有個(gè)體的基因組DNA ;
[0018] 5) STR位點(diǎn)群體多態(tài)性驗(yàn)證：
[0019] ①使用步驟3)中的引物分別擴(kuò)增樣本中所有個(gè)體的基因組DNA目標(biāo)基因組區(qū) 域；
[0020] ②擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)分離后進(jìn)行基因分型；
[0021] ③對(duì)于具有遺傳多態(tài)性的STR位點(diǎn)，估算各等位基因頻率；
[0022] 6)采用皮爾森卡方檢驗(yàn)對(duì)步驟5)中各STR位點(diǎn)的基因型分布頻率進(jìn)行哈迪-溫 伯格平衡檢驗(yàn)，篩選出符合哈迪-溫伯格平衡的STR位點(diǎn)；
[0023] ①計(jì)算基因型分布頻率的觀察值；
[0024] ②計(jì)算基因型分布頻率的理論值；
[0025] ③用皮爾森卡方檢驗(yàn)判斷每個(gè)STR位點(diǎn)基因型頻率分布的觀察值和理論值是否 具有顯著差異，如果二者具有顯著差異P〈〇. 05,則該位點(diǎn)不符合哈迪-溫伯格平衡，在后 續(xù)步驟中將該位點(diǎn)剔除；如果二者不具有顯著差異P>〇. 05,則該位點(diǎn)符合哈迪-溫伯格平 衡；
[0026] 7) STR位點(diǎn)的法醫(yī)學(xué)學(xué)應(yīng)用價(jià)值評(píng)價(jià)：對(duì)步驟6)中篩選出的各STR位點(diǎn)分別計(jì)算 其法醫(yī)學(xué)參數(shù)，如雜合度、個(gè)體識(shí)別率、多態(tài)信息量、非父排除率等；
[0027] 8)建立STR親權(quán)鑒定系統(tǒng)：綜合以上參數(shù)，選取法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值高的若干獨(dú)立位 點(diǎn)，使得累積排除概率大于〇. 99,由這些位點(diǎn)及對(duì)應(yīng)的引物組成該物種的STR親權(quán)鑒定系 統(tǒng)。
[0028] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0029] 1)從全基因參考序列中篩選STR位點(diǎn)，與傳統(tǒng)分子克隆方法相比，該方法周期短， 篩選通量高；具有方便快速，成本低廉的優(yōu)點(diǎn)。
[0030] 2)該方法也可用于其他重復(fù)單元長(zhǎng)度的STR。
[0031] 3)該方法也可用于建立動(dòng)物的STR個(gè)體識(shí)別系統(tǒng)。
[0032] 4)該方法可以根據(jù)鑒定的精度需求，增加 STR檢測(cè)位點(diǎn)。
[0033] 該方法具有操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，所構(gòu)建親權(quán)鑒定系統(tǒng)的非父排除率可達(dá)0. 99以上， 能準(zhǔn)確進(jìn)行動(dòng)物親權(quán)鑒定從而可用于指導(dǎo)珍稀物種的繁育及經(jīng)濟(jì)類物種的鑒別及育種。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0034] 圖1是用STR親權(quán)鑒定系統(tǒng)鑒定的一個(gè)四代家系家譜，以及家系中所有個(gè)體在各 STR位點(diǎn)的基因型。

【具體實(shí)施方式】
[0035] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0036] 實(shí)施例：朱鹮STR親權(quán)鑒定系統(tǒng)的建立
[0037] 具體步驟：
[0038] 1)定義重復(fù)單元為1?6bp并且總長(zhǎng)度不少于15bp的串聯(lián)重復(fù)序列為STR。
[0039] 用串聯(lián)重復(fù)序列查找軟件Tandem R印eat Finder(TRF)在朱鹮基因組中尋找STR。 查找程序參數(shù)設(shè)定如下："Match = 2，Mismatch = 7，Delta = 7，PM = 80，PI = 10，Minscore =30，Maxperiod = 6"。在朱鶴基因組中共發(fā)現(xiàn)至少82萬(wàn)個(gè)STR位點(diǎn)，其中4堿基重復(fù)的 STR位點(diǎn)數(shù)約5萬(wàn)個(gè)。
[0040] 2)從重復(fù)單元為4bp的STR位點(diǎn)中選取300個(gè)STR位點(diǎn)。
[0041] 選取原則：i )該位點(diǎn)為非簡(jiǎn)并性STR位點(diǎn)；ii )各位點(diǎn)獨(dú)立遺傳。
[0042] 3)使用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5. 0在STR兩端200bp以內(nèi)的保守序列中 分別設(shè)計(jì)上游和下游引物。設(shè)計(jì)引物參數(shù)設(shè)定如下：引物長(zhǎng)度18?22bp，產(chǎn)物長(zhǎng)度160? 400bp〇
[0043] 4)在陜西洋縣4個(gè)不同的朱鹮亞群中，隨機(jī)抽取105個(gè)個(gè)體構(gòu)成樣本，其中包括 48個(gè)雄性和57個(gè)雌性。采用血液DNA抽提試劑盒E. Z. N. A. ? Blood DNA Kit從朱鹮血液 中提取基因組DNA。所得的DNA樣本用試劑盒TIANamp Genemic DNA Kit進(jìn)行定量。所有 步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。
[0044] 5)對(duì)于步驟2)中選取的位點(diǎn)，在步驟4)中抽取的樣本中進(jìn)行遺傳多態(tài)性驗(yàn)證。 具體操作方法包括：
[0045] ①通過(guò)多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)方法對(duì)基因組中包含重復(fù)序列的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。反 應(yīng)在GeneAmp 9700多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)儀上進(jìn)行。多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)程序：
[0046] 95°C /5 分鐘
[0047] 95 °C /30 秒-52 °C /30 秒-72 °C /30 秒，30 個(gè)循環(huán)
[0048] 72°C /10 分鐘
[0049] 對(duì)上述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小挑選出等位基 因數(shù)目最高的50個(gè)STR位點(diǎn)，對(duì)于長(zhǎng)度重疊的位點(diǎn)使用不同的熒光標(biāo)記，第一組用FAM(藍(lán) 色）標(biāo)記，第二組用HEX (綠色）標(biāo)記，第三組用TMR (黃色）標(biāo)記。
[0050] ②擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò) ABI3730DNA Genetic Analyzer48_capillary array system 分 離后，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小用軟件Genemapperf. 5進(jìn)行基因分型；
[0051] ③以片段大小作為等位基因，計(jì)算各位點(diǎn)等位基因頻率，即計(jì)算各等位基因數(shù)量 占該基因座全部等位基因總數(shù)的比率。
[0052] 6)采用皮爾森卡方檢驗(yàn)對(duì)各STR位點(diǎn)的基因型分布頻率進(jìn)行哈迪-溫伯格平衡檢 驗(yàn)?；蛐皖l率是指群體中某特定基因型個(gè)體數(shù)占全部個(gè)體數(shù)的比率，哈迪-溫伯格平衡 是指基因型頻率分布的觀察值和理論值無(wú)顯著差異（P>〇. 05)。
[0053] ①計(jì)算基因型分布頻率的觀察值：觀察到的特定基因型個(gè)體數(shù)除以全部個(gè)體數(shù)。
[0054] ②計(jì)算基因型分布頻率的理論值：對(duì)于一個(gè)STR位點(diǎn)，假設(shè)有η個(gè)等位基因，用Xi 代表該第i個(gè)等位基因的頻率，則該位點(diǎn)的基因型分布頻率的理論值計(jì)算公式為：
[0055]

【權(quán)利要求】
1. 一種基于全基因組STR建立動(dòng)物親權(quán)鑒定系統(tǒng)的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 全基因組STR位點(diǎn)查找：通過(guò)串聯(lián)重復(fù)序列查找軟件TandemR印eatFinder(TRF) 在所研宄物種全基因組參考序列中尋找所有STR位點(diǎn)； 2. STR位點(diǎn)的初步篩選：統(tǒng)計(jì)出該物種全基因組參考序列中重復(fù)單位為4個(gè)堿基的STR 位點(diǎn)，并從中隨機(jī)選取50?300個(gè)STR位點(diǎn)； 3) 引物設(shè)計(jì)：對(duì)于步驟2)中所選取的每一個(gè)STR位點(diǎn)，在串聯(lián)重復(fù)序列前后兩端200 堿基長(zhǎng)度的保守序列內(nèi)，分別設(shè)計(jì)用于多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)的正向引物和反向引物； 4) 動(dòng)物群體隨機(jī)抽樣并提取基因組DNA:在所研宄的動(dòng)物群體中通過(guò)隨機(jī)抽樣的方式 獲得樣本，并提取樣本中所有個(gè)體的基因組DNA; 5. STR位點(diǎn)群體多態(tài)性驗(yàn)證： ① 使用步驟3)中的引物分別擴(kuò)增樣本中所有個(gè)體的基因組DNA目標(biāo)基因組區(qū)域； ② 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)分離后進(jìn)行基因分型； ③ 以片段大小作為等位基因，計(jì)算各STR位點(diǎn)等位基因分布頻率； 6) 采用皮爾森卡方檢驗(yàn)對(duì)步驟5)中各STR位點(diǎn)的基因型分布頻率進(jìn)行哈迪-溫伯格 平衡檢驗(yàn)，篩選出符合哈迪-溫伯格平衡的STR位點(diǎn)； 7)STR位點(diǎn)的法醫(yī)學(xué)學(xué)應(yīng)用價(jià)值評(píng)價(jià)：對(duì)步驟6)中篩選出的符合哈迪-溫伯格平衡的 STR位點(diǎn)分別計(jì)算其法醫(yī)學(xué)參數(shù)； 8) 建立STR親權(quán)鑒定系統(tǒng)：根據(jù)法醫(yī)學(xué)參數(shù)，選取若干獨(dú)立位點(diǎn)，使得累積排除概率大 于0. 99,由這些位點(diǎn)及對(duì)應(yīng)的引物組成該物種的STR親權(quán)鑒定系統(tǒng)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于全基因組STR建立動(dòng)物親權(quán)鑒定系統(tǒng)的方法，其特征在 于，所述步驟5)-②中，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)分離后根據(jù)片段大小，利用軟件GenemappeU. 5進(jìn)行基 因分型。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于全基因組STR建立動(dòng)物親權(quán)鑒定系統(tǒng)的方法，其特征在 于，所述步驟5)-③中，計(jì)算各位點(diǎn)等位基因頻率，即計(jì)算各等位基因數(shù)量占該基因座全部 等位基因總數(shù)的比率。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于全基因組STR建立動(dòng)物親權(quán)鑒定系統(tǒng)的方法，其特征在 于，步驟6)中，采用皮爾森卡方檢驗(yàn)對(duì)各STR位點(diǎn)的基因型分布頻率進(jìn)行哈迪-溫伯格平 衡檢驗(yàn)，哈迪-溫伯格平衡是指基因型頻率分布的觀察值和理論值無(wú)顯著差異，具體為： ① 計(jì)算基因型分布頻率的觀察值：觀察到的特定基因型個(gè)體數(shù)除以全部個(gè)體數(shù)； ② 計(jì)算基因型分布頻率的理論值：對(duì)于一個(gè)STR位點(diǎn)，假設(shè)有n個(gè)等位基因，用Xi代表 該第i個(gè)等位基因的頻率，則該位點(diǎn)的基因型分布頻率的理論值計(jì)算公式為：
③ 用皮爾森卡方檢驗(yàn)判斷每個(gè)STR位點(diǎn)基因型頻率分布的觀察值和理論值是否具有 顯著差異，如果二者具有顯著差異P〈〇. 05,則該位點(diǎn)不符合哈迪-溫伯格平衡，在后續(xù)步驟 中將該位點(diǎn)剔除；如果二者不具有顯著差異P>〇. 05,則該位點(diǎn)符合哈迪-溫伯格平衡。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于全基因組STR建立動(dòng)物親權(quán)鑒定系統(tǒng)的方法，其特征在 于，基因型頻率分布的觀察值是觀察到的特定基因型個(gè)體數(shù)除以全部個(gè)體數(shù)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于全基因組STR建立動(dòng)物親權(quán)鑒定系統(tǒng)的方法，其特征 在于，步驟7)中，分別計(jì)算其法醫(yī)學(xué)參數(shù)包括雜合度、個(gè)體識(shí)別率、多態(tài)信息量和非父排除 率。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104480205SQ201410757128
【公開(kāi)日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月10日
【發(fā)明者】李生斌, 李波, 劉清波, 常遼, 熊子軍 申請(qǐng)人:西安交通大學(xué)