專利名稱：分析人類基因組短串聯(lián)重復(fù)順序多態(tài)性的電泳系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分析人類基因組短串聯(lián)重復(fù)順序多態(tài)性的電泳系統(tǒng)，它屬于用電泳法測試的材料。
目前，人類基因組遺傳連鎖分析、疾病基因分析、染色體圖分析及法醫(yī)學(xué)個(gè)人識(shí)別與親權(quán)鑒定，大多都采用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR)擴(kuò)增所檢血樣中DNA中短串聯(lián)重復(fù)順序后，用聚丙烯酰胺測序膠電泳分析法對(duì)其進(jìn)行檢測分析。在這種方法中使用的測序膠尺寸大(為400mm×300mm×0.5mm)，不便于工業(yè)化成批生產(chǎn)、因此在檢測中，制膠工作量大，電泳及染色操作復(fù)雜，不便于臨床醫(yī)學(xué)及法醫(yī)學(xué)常規(guī)檢驗(yàn)。為了解決上述難題，1995年，Buzas，Z.及Varga，L.用Wlltfang，J.等人創(chuàng)建的分析蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物的微型膠多相電泳緩沖系統(tǒng)對(duì)DNA片段長度多態(tài)性進(jìn)行了分析。該電泳系統(tǒng)可使DNA片段按其片段大小加以分離，同時(shí)亦可區(qū)分出擴(kuò)增產(chǎn)物主帶與附加帶，然而在其電泳系統(tǒng)中220bp至75bp之間的相對(duì)遷移率為39～40％(見

圖1中的c5％、T8％曲線)。因此，該系統(tǒng)也難以在有限的微型膠上有效地分離人類基因組短串聯(lián)重復(fù)順序。
本發(fā)明的目的是提供一種能擴(kuò)大聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)所擴(kuò)增的短串聯(lián)重復(fù)順序產(chǎn)物的相對(duì)分離距離，獲得清晰、可靠的分型結(jié)果的分析人類基因組短串聯(lián)重復(fù)順序多態(tài)性的電泳系統(tǒng)。
為完成上述任務(wù)，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是該電泳系統(tǒng)由聚丙烯酰胺微型膠與電極緩沖液組成，聚丙烯酰胺微型膠由分離區(qū)和成層區(qū)構(gòu)成，分離區(qū)在膠濃度T為8％、交聯(lián)度C為6.5～8％的情況下，由丙烯酰胺、NN′-次甲基雙丙烯酰胺、雙蒸餾水、三羥甲基氨基甲烷0.4摩爾、硫酸0.1摩爾、甘油0.87摩爾、四甲基乙二胺8.6毫摩爾和過硫酸銨1.75毫摩爾組成，該分離區(qū)的PH值為8.1；成層區(qū)在膠濃度T為5％、交聯(lián)度C為2.6％的情況下，由丙烯酰胺、NN′-次甲基雙丙烯酰胺、雙蒸餾水、雙[2-羥乙基]亞氨基三羥甲基氨基甲烷(Bistrls)0.4摩爾、硫酸0.1摩爾、甘油0.87摩爾、四甲基乙二胺8.6毫摩爾和過硫酸銨1.75毫摩爾組成，該成層區(qū)的PH值為6.7；前述丙烯酰胺、NN′-次甲基雙丙烯酰胺的重量和雙蒸餾水的容量由膠濃度T和交聯(lián)度C的計(jì)算公式確定；電極緩沖液為正極緩沖液和負(fù)極緩沖液，正極緩沖液由三羥甲基氨基甲烷0.4摩爾、硫酸0.1摩爾組成，該P(yáng)H值為8.1；負(fù)極緩沖液由NN′-雙[2-羥乙基]甘氨酸(Blc-lne)0.4摩爾、氫氧化鈉0.1摩爾組成，該P(yáng)H值為8.2。
上述聚丙烯酰胺微型膠的尺寸為50×45×0.5mm，其中分離區(qū)為37mm，成層區(qū)為13mm。
本發(fā)明由于采用了上述技術(shù)方案，因此與背景技術(shù)相比，具有下列優(yōu)點(diǎn)1、能擴(kuò)大聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)所擴(kuò)增的短串聯(lián)重復(fù)順序產(chǎn)物的相對(duì)分離距離，能獲得清晰、可靠的分型結(jié)果，并且檢測速度快，特別適合于基層法院物證及臨床醫(yī)學(xué)常規(guī)檢驗(yàn)；2、聚丙烯酰胺微型膠的尺寸小，有利于成批生產(chǎn)并且運(yùn)輸和保存方便；3、聚丙烯酰胺微型膠的制作成本低，只為測序膠的十五分之一；4、檢測時(shí)間縮短，整個(gè)檢測過程可在2.5小時(shí)內(nèi)完成；5、所需檢測樣品少，只需0.2～0.5μl。
為檢驗(yàn)本發(fā)明分型的可靠性，本發(fā)明選取了50個(gè)樣品，對(duì)人類von Wllleb-rand因子基因內(nèi)含子40中兩個(gè)短串聯(lián)重復(fù)順序(STR)區(qū)域(STRlnt 31/1880～1982，STR2nt 31/2215～2380)的聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了盲測分型。盲測分型結(jié)果如下表
圖1是用本發(fā)明測得的人類von Wlllebrand因子基因內(nèi)含子40中短串聯(lián)重復(fù)順序1(SRT1)A和短串聯(lián)重復(fù)順序2(STR2)B的電泳圖譜。圖1中左側(cè)所標(biāo)符號(hào)為等位基因標(biāo)準(zhǔn)片段的編號(hào)及片段大小。圖1中右側(cè)所標(biāo)AB為附加帶，MB為主帶。
圖2是膠濃度T固定(8％)時(shí)，改變交聯(lián)度C對(duì)不同DNA片段相對(duì)遷移率的影響。圖中縱軸為相對(duì)遷移率，橫軸為千鹼基對(duì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(lkb ladder)。三條曲線代表在膠濃度T為8％時(shí)，交聯(lián)度C為1.6％、5％、7％時(shí)DNA片段的相對(duì)遷移率。從圖中可知，本發(fā)明交聯(lián)度C為7％時(shí)75bp～220bp之間的相對(duì)遷移率為59～60％。
實(shí)施例本發(fā)明的電泳系統(tǒng)，由聚丙烯酰胺微型膠與電極緩沖液組成。聚丙烯酰胺微型膠由分離區(qū)和成層區(qū)構(gòu)成，分離區(qū)在膠濃度T為8％、交聯(lián)度C為7％的情況下，由丙烯酰胺74.4g、NN′-次甲基雙丙烯酰胺5.6g、雙蒸餾水、三羥甲基氨基甲烷0.4摩爾、硫酸0.1摩爾、甘油0.87摩爾、四甲基乙二胺8.6毫摩爾和過硫酸銨1.75毫摩爾組成，總體積為1000ml，該分離區(qū)的PH值為8.1；成層區(qū)在膠濃度T為5％、交聯(lián)度C為2.6％的情況下，由丙烯酰胺77.92g、NN′-次甲基雙丙烯酰胺2.08g、雙蒸餾水、雙[2-羥乙基]亞氨基三羥甲基氨基甲烷(Blstr-ls)0.4摩爾、硫酸0.1摩爾、甘油0.87摩爾、四甲基乙二胺8.6毫摩爾和過硫酸銨1.75毫摩爾組成，總體積為1000ml，該成層區(qū)的PH值為6.7；前述丙烯酰胺的重量、NN′-次甲基雙丙烯酰胺的重量和雙蒸餾水的容量由膠濃度T和交聯(lián)度C的計(jì)算公式確定。膠濃度T和交聯(lián)度C的計(jì)算公式為 電極緩沖液為正極緩沖液和負(fù)極緩沖液，正極緩沖液由三羥甲基氨基甲烷0.4摩爾、硫酸0.1摩爾組成，該P(yáng)H值為8.1；負(fù)極緩沖液由NN′-雙[2-羥乙基]甘氨酸(Biclne)0.4摩爾、氫氧化鈉0.1摩爾組成，該P(yáng)H值為8.2。本實(shí)施例的微型膠尺寸為50×45×0.5mm，分離區(qū)為37mm，成層區(qū)為13mm。本實(shí)施例的聚丙烯酰胺微型膠的制作方法與常規(guī)聚丙烯酰胺的凝膠的制作相同。
本發(fā)明分離區(qū)的丙烯酰胺的重量、NN′-次甲基雙丙烯酰胺的重量和雙蒸餾水的容量還可在膠濃度T為8％、交聯(lián)度C為6.5％或膠濃度T為8％、交聯(lián)度C為8％的情況下由膠濃度T和交聯(lián)度C的計(jì)算分式確定。
本發(fā)明的使用方法是該電泳系統(tǒng)在Phastsystem電泳儀上進(jìn)行，電泳條件為最大電壓100V、最大電流6mA。對(duì)于STR1需電泳80～100伏特·小時(shí)，對(duì)于STR2需電泳140～160伏特·小時(shí)。銀染方法根據(jù)Phstsystem手冊(cè)說明用該機(jī)自動(dòng)染色。整個(gè)操作可在2.5小時(shí)內(nèi)完成。
權(quán)利要求
1.一種分析人類基因組短串聯(lián)重復(fù)順序多態(tài)性的電泳系統(tǒng)，由聚丙烯酰胺微型膠與電極緩沖液組成，其特征是聚丙烯酰胺微型膠由分離區(qū)和成層區(qū)構(gòu)成，分離區(qū)在膠濃度T為8％、交聯(lián)度C為6.5～8％的情況下，由丙烯酰胺、NN′-次甲基雙丙烯酰胺、雙蒸餾水、三羥甲基氨基甲烷0.4摩爾、硫酸0.1摩爾、甘油0.87摩爾、四甲基乙二胺8.6毫摩爾和過硫酸銨1.75毫摩爾組成，該分離區(qū)的PH值為8.1；成層區(qū)在膠濃度T為5％、交聯(lián)度C為2.6％的情況下，由丙烯酰胺、NN′-次甲基雙丙烯酰胺、雙蒸餾水、雙[2-羥乙基]亞氨基三羥甲基氨基甲烷(Blstrls)0.4摩爾、硫酸0.1摩爾、甘油0.87摩爾、四甲基乙二胺8.6毫摩爾和過硫酸銨1.75毫摩爾組成，該成層區(qū)的PH值為6.7；前述丙烯酰胺、NN′-次甲基雙丙烯酰胺的重量和雙蒸餾水的容量由膠濃度T和交聯(lián)度C的計(jì)算公式確定；電極緩沖液為正極緩沖液和負(fù)極緩沖液，正極緩沖液由三羥甲基氨基甲烷0.4摩爾、硫酸0.1摩爾組成，該P(yáng)H值為8.1；負(fù)極緩沖液由NN′-雙[2-羥乙基]甘氨酸(Blclne)0.4摩爾、氫氧化鈉0.1摩爾組成，該P(yáng)H值為8.2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析人類基因組短串聯(lián)重復(fù)順序多態(tài)性的電泳系統(tǒng)，其特征是所述聚丙烯酰胺微型膠的尺寸為50×45×0.5mm，其中分離區(qū)為37mm，成層區(qū)為13mm。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分析人類基因組短串聯(lián)重復(fù)順序多態(tài)性的電泳系統(tǒng)，它屬于用電泳法測試的材料。該電泳系統(tǒng)由聚丙烯酰胺微型膠與電極緩沖液組成，聚丙烯酰胺微型膠由分離區(qū)和成層區(qū)構(gòu)成，分離區(qū)由丙烯酰胺，NN′-次甲基雙丙烯酰胺、雙蒸餾水、三羥甲基氨基甲烷、硫酸、甘油、四甲基乙二胺和過硫酸銨組成。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)是能擴(kuò)大聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)所擴(kuò)增的短串聯(lián)重復(fù)順序產(chǎn)物的相對(duì)分離距離，獲得清晰、可靠的分型結(jié)果。
文檔編號(hào)G01N27/447GK1145957SQ96110169
公開日1997年3月26日 申請(qǐng)日期1996年7月24日 優(yōu)先權(quán)日1996年7月24日
發(fā)明者郭大瑋 申請(qǐng)人:郭大瑋