一種抗單核細胞增生李斯特菌的枯草芽孢桿菌c3活菌制劑的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種抗單核細胞增生李斯特菌的枯草芽孢桿菌((Bacillus subtilis))C3(CGMCC No.9713)活菌制劑的制備方法，適用于畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中飼用功能性活菌制劑等飼料添加劑及微生態(tài)制劑的生產(chǎn)。本發(fā)明利用篩選自果園土壤中的抗單核細胞增生李斯特菌的枯草芽孢桿菌C3菌株，經(jīng)過活化、擴大培養(yǎng)、高密度發(fā)酵、離心濃縮和冷凍干燥等工序制備而成的高活菌數(shù)的活菌制劑。本發(fā)明通過對發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化，利用全自動發(fā)酵罐發(fā)酵，使C3菌株的活菌數(shù)量達7.9×1010CFU/mL以上。本發(fā)明制備的活菌制劑價格低廉，活菌含量高，可作為禽畜飼料添加劑，具有提高生長速度、節(jié)省飼料用量、減少生病率等特點。CGMCC No.971320130712
【專利說明】一種抗單核細胞増生李斯特菌的枯草芽孢桿菌C3活菌制 劑的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及抗單核細胞增生李斯特菌的枯草芽孢桿菌C3活菌制劑的制備方法， 適用于畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)功能性微生態(tài)制劑和食品防腐劑的生產(chǎn)。

【背景技術(shù)】
[0002] 微生物飼料添加劑，作為一種"綠色"添加劑，對促進動物生長發(fā)育，提高免疫力、 防病治病，逐漸替代農(nóng)用化學物質(zhì)，取代激素和抗生素，可解除大量抗生素使用和濫用所造 成的對人體嚴重的毒副作用，生產(chǎn)出綠色食品。
[0003] 枯草芽孢桿菌為農(nóng)業(yè)部發(fā)布《飼料添加劑品種目錄（2013)》（中華人民共和國農(nóng) 業(yè)部公告第2045號）中可以直接飼喂動物的飼料級微生物添加劑菌種之一?？莶菅挎邨U 菌（Bacillus subtilis)廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中。在枯草芽孢桿菌菌體生長過 程中，產(chǎn)生枯草菌素等活性物質(zhì)對致病菌或內(nèi)源性感染的條件致病菌有明顯的抑制作用； 枯草芽孢桿菌迅速消耗環(huán)境中的游離氧，造成腸道低氧，促進腸道菌群生長，并產(chǎn)生有機酸 類，降低腸道PH，間接抑制其他致病菌生長；枯草芽孢桿菌菌體自身合成α -淀粉酶、蛋白 酶、脂肪酶、纖維素酶等酶類，在消化道中與動物體內(nèi)的消化酶類共同發(fā)揮作用；枯草芽孢 桿菌能合成維生素 Bl、Β2、Β6、煙酸等多種B族維生素，提高動物體內(nèi)干擾素和巨噬細胞的 活性；刺激動物免疫器官生長發(fā)育，激活T、B淋巴細胞，提高免疫球蛋白和抗體水平，增強 細胞免疫和體液免疫功能，提高群體免疫力。可作為飼料添加劑廣泛應(yīng)用于禽畜飼料中，是 一種較理想的具有廣大開發(fā)前景的微生態(tài)制劑。
[0004] 本發(fā)明涉及的枯草芽孢桿菌C3對單核細胞增生李斯特菌、糞腸球菌、金黃色葡萄 球菌、黑曲霉、白邊青霉生長有抑制作用，其中對單核細胞增生李斯特菌有較強的抑菌活 性，效價為640AU/mL。將枯草芽孢桿菌C3添加到家禽畜牧飼料中，可提高禽畜對單核細胞 增生李斯特菌的抗性。此外，試驗研宄表明，該菌還能分泌淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等 酶類，在消化道中與動物體內(nèi)的消化酶類共同發(fā)揮作用，提高飼料利用率。
[0005] 微生態(tài)制劑是采用有益微生物，經(jīng)培養(yǎng)、發(fā)酵、干燥、加工等工藝制成含有活菌的 活菌制劑或包含菌體及其代謝產(chǎn)物的制劑。在枯草芽孢桿菌活菌制劑的制備過程中，高產(chǎn) 活菌量的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方是關(guān)鍵，直接影響枯草芽孢桿菌的發(fā)酵時間、活菌數(shù)量和生產(chǎn) 成本。
[0006] 目前，國內(nèi)申請枯草芽孢桿菌活菌制劑制各方法的專利較多，大多用于生物防治 領(lǐng)域，如發(fā)明專利CN103421722A公開了 "一株荔枝內(nèi)生枯草芽孢桿菌及其生物制劑與應(yīng) 用"，該專利報道枯草芽孢桿菌對荔枝霜疫霉病的優(yōu)異生防作用；如發(fā)明專利CN103352020A 公開了 "一種枯草芽孢桿菌的微生物制劑制備方法及其應(yīng)用"，該專利報道了一種枯草芽 孢桿菌（Bacillus sp.)EDR4的菌株能夠應(yīng)用在油菜菌核病的防治中。
[0007] 枯草芽孢桿菌在動物飼料領(lǐng)域的微生態(tài)制劑相關(guān)專利報道不多，且主要集中在 飼料營養(yǎng)方面。專利CN104012756A公開了"禽用高表達蛋白酶枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑 及其制備方法"，該發(fā)明是由吐溫80、豆油、聚丙烯酸鈉、水和枯草芽孢桿菌制備而成，枯草 芽孢桿菌在上述溶液中的濃度為IO6?10 12個/ml，該制劑在禽類腸道體內(nèi)有效降解飼料 中的蛋白質(zhì)，大幅度提高禽類生長速度和肉料比，防止出現(xiàn)過料拉稀等現(xiàn)象。另一篇專利 CN103911323A公開了"地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌制劑及制備"，該發(fā)明以 豆柏、麩皮和玉米粉為基質(zhì)，以益生菌地衣芽孢桿菌BL-09、枯草芽孢桿菌HM-66和植物乳 桿菌HM-10混合分階段進行固態(tài)發(fā)酵制備的益生菌制劑。CN102660534A公開了"枯草芽孢 桿菌制劑及其制備方法與應(yīng)用"，該發(fā)明是枯草芽孢桿菌發(fā)酵后與載體混合后經(jīng)離心噴霧 干燥即制成枯草芽孢桿菌制劑，經(jīng)口服途徑（飲水或拌料）飼喂肉禽后，具有改善消化功 能，提高飼料轉(zhuǎn)化率，促進生長的作用。
[0008] 但關(guān)于抗單核細胞增生李斯特菌的枯草芽孢桿菌的活菌制劑制備方法尚未見國 內(nèi)外相關(guān)文獻報道和專利報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一種抗單核細胞增生李斯特菌的枯草芽孢桿菌C3活菌制 劑的方法。
[0010] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0011] 所述方法中，所提供的枯草芽孢桿菌是：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)C3， 分離篩選自北京農(nóng)學院果園土壤，已于2013年7月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC)，位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號的中國科學 院微生物研宄所內(nèi)，保藏號為：CGMCC No. 7913。在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)C3的菌落大小為3?5mm，灰白色、不透明、表面干燥、邊緣不整齊，菌 體細胞呈長桿狀，短鏈狀排列，中生芽孢，G +好氧菌。
[0012] 所述方法中，將甘油冷凍管保種的枯草芽孢桿菌C3菌株接種于5mL的C3菌株種 子培養(yǎng)基中，于37°C，160r/min搖床培養(yǎng)16?20h，如此活化2?3代，得到種子液；將活化 好的種子液以2%的接種量接種至盛有50mL種子培養(yǎng)基250mL的三角瓶中，于37°C，160r/ min搖床培養(yǎng)12h，得到擴大培養(yǎng)液。
[0013] 上述方法中，枯草芽孢桿菌C3種子培養(yǎng)基配方為（質(zhì)量體積濃度，W/V) :1%葡萄 糖，1%蛋白胨，1% NaCl，0. 15% ΚΗ2Ρ04,0· 15% MgSO4 · 7H20，pH 自然。
[0014] 所述方法中，在上述試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，采用單因素多水平試驗進行發(fā)酵條件的優(yōu) 化，優(yōu)化后的發(fā)酵條件為：pH自然，發(fā)酵時裝液量50mL/250mL三角瓶，接種量3%，溫度 37°C，160r/min，培養(yǎng) 12h。
[0015] 所述方法中，在上述試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，采用正交試驗對發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)進行進一 步優(yōu)化，優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：1%葡萄糖，1 %酵母浸粉，0. 5% NaCl，0. 2% KH2PO4, 0· 2% MgSO4 · 7H20,蒸餾水 lOOOmL，pH 自然。
[0016] 所述方法中，將上述優(yōu)化后的2L發(fā)酵培養(yǎng)基裝入5L自動發(fā)酵罐進行高密度發(fā)酵， 接種量為3%，控制發(fā)酵溫度37°C，發(fā)酵液pH自然，攪拌轉(zhuǎn)速190r/min，發(fā)酵時間12h，得到 枯草芽孢桿菌C3發(fā)酵液。
[0017] 上述方法中，5L自動發(fā)酵罐由上海高機生物工程有限公司生產(chǎn)，其型號為 BI0F6005GBN。
[0018] 所述方法中，在上述試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，利用立式高速冷凍離心機將2L發(fā)酵液于 4°C條件下，5000r/min離心15?20min，棄上清液，收集得到菌泥。
[0019] 所述方法中，立式高速冷凍離心機由湘儀離心機儀器有限公司提供，型號為 GL-21M〇
[0020] 所述方法中，在上述試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，將收集的菌泥加入到發(fā)酵液原體積1/10的 含有11%?13%麥芽糊精和4%?2%脫脂奶粉凍干保護劑中，混合均勻后，得到枯草芽孢 桿菌C3菌泥與凍干保護劑的混合物。
[0021] 所述方法中，將上述混合物于_30°C低溫冰箱中預(yù)凍13h至完全凍結(jié)狀態(tài)，得到預(yù) 凍活菌制劑。
[0022] 所述方法中，在上述試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，利用6L LABCONCO真空冷凍干燥機（美國） 將預(yù)凍活菌制劑于凍干溫度_55°C、真空度0. HmBar的條件下，凍干48h至完全干燥狀態(tài)， 得到凍干活菌制劑。
[0023] 所述方法中，采用小試發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)和凍干工藝所得到的抗單核細胞增生李斯特 菌的枯草芽孢桿菌C3活菌制劑的活菌數(shù)量可達到10 nCFU/g以上，菌種存活率可達85%以 上。
[0024] 上述方法得到的抗單增李斯特菌的枯草芽孢桿菌C3活菌制劑的制備方法，以及 專用生產(chǎn)菌株屬于本發(fā)明保護范圍。

【具體實施方式】
[0025] 下述實施例對本發(fā)明作進一步說明而不限制本發(fā)明的保護范圍。
[0026] 下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
[0027] 下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為體積分數(shù)。
[0028] 實施例1、抗單增李斯特菌的枯草芽孢桿菌C3活菌制劑的制備
[0029] 1、菌種的活化和擴大培養(yǎng)
[0030] 將甘油冷凍管保種的枯草芽孢桿菌C3菌株接種于5mL的C3菌株種子培養(yǎng)基中， 于37°C，160r/min搖床培養(yǎng)16?20h，如此活化2?3代，得到種子液；將活化好的種子液 以2%的接種量接種至盛有50mL種子培養(yǎng)基250mL的三角瓶中，于37°C，160r/min搖床培 養(yǎng)12h，得到擴大培養(yǎng)液。
[0031] 枯草芽孢桿菌C3種子培養(yǎng)基配方為（W/V) :1%葡萄糖，1%蛋白胨，1% NaCl， 0· 15% KH2PO4,0· 15% MgSO4 · 7H20, pH 自然。
[0032] 2、發(fā)酵條件和發(fā)酵培養(yǎng)基配方的單因素試驗
[0033] (1)發(fā)酵條件的確定
[0034] I) pH 的確定
[0035] 將種子培養(yǎng)基的pH分別調(diào)為6. 5, 7. 0, 7. 5和自然（不調(diào)pH)，經(jīng)121°C滅菌后，將 擴大培養(yǎng)液按2%的接種量分別移種至上述不同pH的種子培養(yǎng)基中，于37°C發(fā)酵12h后， 采用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基以傾注平板培養(yǎng)法檢測發(fā)酵液中的活菌數(shù)量，每個稀釋度設(shè)3次重 復(fù)，結(jié)果見表1。
[0036] 表1不同pH對枯草芽孢桿菌C3活菌數(shù)量的影響
[0037]

【權(quán)利要求】
1. 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtili)C3 CGMCC No. 7913。
2. -種抗單核細胞增生李斯特菌的枯草芽孢桿菌C3活菌制劑的制備方法，其特 征在于：發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：1%葡萄糖、1%酵母浸粉、0. 5% NaCl、0. 2% KH2P04、0. 2% MgS04 *7H20,蒸餾水1000mL，pH自然；將活化、擴大培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌C3以3%接種量移 種到2L發(fā)酵培養(yǎng)基中，利用5L自動發(fā)酵罐進行高密度發(fā)酵，控制發(fā)酵溫度37°C，發(fā)酵液pH 自然，攪拌轉(zhuǎn)速190r/min，發(fā)酵時間12h，得到枯草芽孢桿菌C3發(fā)酵液；將2L發(fā)酵液于4°C 條件下，5000r/min離心15?20min，棄上清液，收集得到菌泥；將收集的菌泥加入到發(fā)酵 液原體積1/10的含有11%?13%麥芽糊精和4%?2%脫脂奶粉凍干保護劑中，混合均勻 后，得到枯草芽孢桿菌C3菌泥與凍干保護劑的混合物；將上述混合物于-30°C低溫冰箱中 預(yù)凍13h至完全凍結(jié)狀態(tài)，得到預(yù)凍活菌制劑；利用6LLABC0NC0真空冷凍干燥機將預(yù)凍活 菌制劑于凍干溫度_55°C、真空度0. 14mBar的條件下，凍干48h至完全干燥狀態(tài)，得到抗單 核細胞增生李斯特菌的枯草芽孢桿菌C3活菌制劑。
【文檔編號】C12R1/125GK104480042SQ201410751989
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月11日
【發(fā)明者】熊利霞, 劉慧 , 謝遠紅, 張紅星, 高秀芝, 金君華, 董牧群, 劉寬博 申請人:北京農(nóng)學院