一種織紋螺科線粒體coi基因的擴增引物、方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學領(lǐng)域，提供一種織紋螺科線粒體COI基因的擴增引物，利用該引物擴增織紋螺科物種線粒體COI基因的方法?？椉y螺科線粒體COI基因的擴增引物，序列是ZLCO1490F：5’-TTTCTACAAATCATAAAGACATTGG-3’和ZHCO2198R：5’-TATACCTCCGGGTGACCAAAAAATCA-3’，采用本發(fā)明的織紋螺科線粒體COI基因擴增引物，可以有效的擴增出織紋螺科不同物種的COI序列，對于利用COI序列研究織紋螺科的物種分類、系統(tǒng)發(fā)育、系統(tǒng)地理學、毒素耐受性和保護織紋螺科種質(zhì)資源具有重要意義。
【專利說明】一種織紋螺科線粒體COI基因的擴增引物、方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學領(lǐng)域，涉及一種織紋螺科線粒體COI [細胞色素c氧化酶亞基I (cytochrome c oxidase subunit I)]基因的擴增引物,利用該引物擴增織紋螺科線粒體COI基因的方法。
[0002]

【背景技術(shù)】
[0003]織紋螺科(Tfe1S1Sariw1S)隸屬于腹足綱{Gastropoda),前觸亞綱{Prosobranchia),新腹足目iNeogastropoda),在世界各地海域均有分布,其種類繁多,在維持海洋潮間帶生態(tài)平衡具有重要作用，部分物種還可以作為檢測海洋有毒污染物tributyltin (TBT)的指示工具。其中大部分織紋螺物種肉食鮮美，廣受中國消費者的喜愛，具有重要的經(jīng)濟價值。然而近幾年來，由于食用織紋螺而中毒的事件屢有報道，全國沿海已有多例食用織紋螺而中毒死亡的事件。因此織紋螺物種存在著嚴重的食品安全問題。導致織紋螺有毒的原因目前還尚不清楚，可能與其從海水中獲取的食物有關(guān)。相關(guān)研究指出織紋螺的毒性與種類相關(guān)，比如，一些織紋螺有毒性，一些織紋螺無毒，而某些織紋螺的毒性隨著季節(jié)的變化而改變。因此，正確的物種鑒定是研究織紋螺毒性的基礎(chǔ)。然而由于外部環(huán)境因素的影響，織紋螺同一種內(nèi)和不同種間的貝殼外部形態(tài)具有高度的可變性，齒舌結(jié)構(gòu)也極具復雜性，使得利用形態(tài)特征對織紋螺進行物種分類和系統(tǒng)發(fā)育的分析變得異常困難，特別對于一些親緣物種，單利用形態(tài)特征很難區(qū)分開來。
[0004]近年來，利用分子技術(shù)對物種進行分類和系統(tǒng)發(fā)育分析已成為一種有效的方法，其中線粒體COI基因成為區(qū)分物種和研究物種進化關(guān)系的理想基因，并對許多物種得到了成功的應用。因此，利用COI基因?qū)椉y螺科進行物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析是一種很好的方法。
[0005]然而織紋螺科物種COI序列變異度較高，不同物種的序列差異較大，使得COI通用引物的擴增效率低下，有些物種根本無法擴出，以致阻礙了分子技術(shù)的使用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對紋螺科物種COI序列變異度較高，COI通用引物擴增效率低下的問題，本發(fā)明通過大量的試驗，獲得一對織紋螺科線粒體COI基因的擴增引物，同時，以該擴增引物為基礎(chǔ)，提供織紋螺科線粒體COI基因的擴增方法和紋螺科物種的檢測方法。
[0007]本發(fā)明的目的具體通過以下技術(shù)手段獲得:
1.本發(fā)明提供一種織紋螺科線粒體COI基因的擴增引物，其序列是ZIX01490F:5’ -TTTCT ACAAATCATAAAGACATTGG-3’ 和 ZH⑶2198R:5’ -TATACCTCCGGGTGACCAAAAAATCA-3’。
[0008]2.本發(fā)明還提供一種織紋螺科線粒體COI基因的擴增方法，其以上述I提供的擴增引物擴增待檢測織紋螺科物種DNA，獲得680bp的擴增DNA片段，即為所獲得的該織紋螺科物種線粒體COI基因。
[0009]3.上述2提供的擴增方法，其中，擴增反應過程為=1yL PCR反應體系為:I μ LlOXbuffer Mg2+，I μ L DNTP (2mM), 0.6 μ L Mgcl2 (25mM)，I μ L 弓I 物 MLC01490F(10 μ Μ), I μ L 引物 MHC02198R (10μΜ)，0.08μ L r-Taq (5u/y L), I μ L DNA 模板，
4.32 μ L雙蒸水，PCR熱循環(huán)的退火溫度為49°C。
[0010]本發(fā)明提供的織紋螺科線粒體COI基因的擴增引物通過以下方案獲得:a、用COI通用擴增引物擴增出部分織紋螺科物種的COI序列；b、將所述的COI通用擴增引物序列與已獲得的部分織紋螺科物種的COI序列進行比對，找出織紋螺科線粒體COI序列在COI通用擴增引物序列段的所有突變堿基，重新合成不同的織紋螺科COI擴增引物；c、從新合成的不同COI擴增引物中篩選出擴增織紋螺科物種效果最好的一對引物。
[0011]有益效果:
1.本發(fā)明根據(jù)織紋螺科物種COI序列變異度極高和COI通用擴增引物擴增效率低的特性，通過重復試驗篩選出織紋螺科COI基因的擴增引物。采用本發(fā)明的織紋螺科線粒體COI基因的擴增引物，可以有效的擴增出織紋螺科不同物種的COI序列，大大提高了擴增效率和正確性。
[0012]2.由于線粒體COI基因是區(qū)分物種和研究物種進化關(guān)系的理想基因，利用本發(fā)明提供的擴增引物快速、高效擴增出織紋螺科不同物種的COI序列，對于利用分子鑒定研究織紋螺科的物種分類、系統(tǒng)發(fā)育分析具有重要的意義，同時也能為利用COI基因研究織紋螺系統(tǒng)地理學、毒素耐受性和保護織紋螺科種質(zhì)資源具有重要意義。
[0013]

【具體實施方式】
[0014]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明，下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照本領(lǐng)域的公知手段。
[0015]實施例1.1.樣品采集:于2008年?2012年，從中國南北沿海共采集織紋螺科15個種類的150個個體。
[0016]2.DNA提取:用CTAB法對所采集樣品進行DNA提取。
[0017]3.COI通用擴增引物擴增:利用Folmer等人1994年設(shè)計的COI通用擴增引物 LC01490F:5’ -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’、HC02198R:5’ -TTAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’對上述采集的織紋螺科150個個體進行PCR擴增。不同物種的PCR熱循環(huán)退火溫度不同，退火溫度范圍為43 oC?50擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5倍的瓊脂糖電泳檢測后，送往測序公司進行雙向測序。最終獲得4個種類35個個體的COI序列，其長度約為678bp，其余個體均未擴增出。
[0018]4.下載序列:從Genbank下載織紋螺科物種Tfe1S1Sariw1S reticulatus的線粒體全序列。
[0019]5.序列比對:利用CLUSTALW軟件將上述獲得的4個種類35個個體的COI序列和I個線粒體全序列與COI通用擴增引物序列進行比對，找出織紋螺科COI序列在COI通用擴增引物序列段的所有突變堿基。上述獲得的35個COI序列和I個線粒體全序列中，共有8個序列分別在COI通用擴增引物序列段的不同位置產(chǎn)生堿基突變，突變位點主要集中于5’端。
[0020]6.引物合成:根據(jù)上述的堿基突變結(jié)果，重新合成8對與COI通用擴增引物LC01490F和HC02198R同區(qū)域的織紋螺COI擴增引物。
[0021]7.引物擴增:將上述設(shè)計的8對織紋螺COI擴增引物分別應用于擴增所采集的織紋螺科15個種類的150個個體。8對織紋螺COI擴增引物PCR熱循環(huán)退火溫度范圍為 43。。?51' 1yL PCR 反應體系為:I μ LlOXbuffer Mg2+，I μ L DNTP (2mM),0.6 μ LMgcl2(25mM),lyL 正向引物(ΙΟμΜ)，IyL 反向引物(10 μ Μ)，0.08 μ L r-Taq (5u/μ L)，I μ L DNA模板，4.32 μ L雙蒸水。擴增產(chǎn)物用1.5倍的瓊脂糖電泳進行檢測。8對擴增引物中，5對引物無法擴增出任何織紋螺個體，2對引物分別能擴增出10個織紋螺個體，只有一對引物能夠擴增出所試驗的3/4織紋螺個體，擴增效果最好。
[0022]8.特異性擴增引物序列:最終篩選出上述擴增織紋螺科線粒體COI基因效果最好的一對引物為 ZLC01490F (5’-TTTCTACAAATCATAAAGACATTGG-3’)、ZHC02198R (5’_TATACCTCCGGGTGACCAAAAAATCA-3’)。利用此對引物擴增的DNA片段長度約為680bp。
[0023]9.特異性擴增引物ZLC01490擴增條件，10 μ L PCR反應體系為:1 μ LlOXbufferMg2+, I μ L DNTP (2mM), 0.6 μ L Mgcl2 (25mM)，I μ L 引物 MLC01490F (ΙΟμΜ), IyL 弓I物MHC02198R (ΙΟμΜ),0.08 μ L r-Taq (5u/y L), I μ L DNA 模板，4.32 μ L 雙蒸水，PCR 熱循環(huán)的退火溫度為49°C。
[0024]實施例2
2008年-2012年分別采集東南沿海織紋螺科物種:光織紋螺il'kissai'ius rutiIans),縱肋織紋螺(^eissaTius variciferus)、方格織紋螺、Nassarius clathratus)、西格織紋螺(JVassarius、半裙織紋螺 iJ'hssaTius5個物種的幼體、成體共25個個體，以苯酚-氯仿法對所采集樣品進行DNA提取，共獲得25份樣品，其中，幼體5份。利用實施例1中獲得的特異性引物對ZLC01490擴增25份DNA樣品，擴增條件為:10 μ L PCR反應體系為:1 μ LlOXbuffer Mg2+，I μ L DNTP (2mM), 0.6 μ L Mgcl2 (25mM)，I μ L引物 MLC01490F (ΙΟμΜ), I μ L 引物 MHC02198RC10 μ Μ), 0.08 μ L r-Taq (5u/y L), I μ LDNA模板，4.32 μ L雙蒸水，PCR熱循環(huán)的退火溫度為49°C。擴增產(chǎn)物以1.5倍的瓊脂糖電泳進行檢測，結(jié)果顯示，25個DNA樣品中均在680bp處具有明顯條帶?；厥赵揇NA片段，送往測序公司進行測序。從Genbank下載上述5種織紋螺科物種線粒體全序列，與測序結(jié)果進行比對，確定DNA片段對應的紋螺科物種，驗證本發(fā)明提供的特異性引物對ZLC01490的可行性。說明利用本發(fā)明提供的特異性引物對可以用在織紋螺科物種鑒定上。
[0025]可以知道，上述實施例僅為了說明發(fā)明原理而采用的示例性實施方式，然而本發(fā)明不僅限于此，本領(lǐng)域技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明實質(zhì)情況下，可以做出各種改進和變更，這些改進和變更也屬于本發(fā)明的保護范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種織紋螺科線粒體COI基因的擴增引物，其特征在于:序列是ZLC01490F:5 ’ -TTTCTACAAATCATAAAGACATTGG-3，和 ZHC02198R: 5，-TATACCTCCGG GTGACCAAAAAATCA-3 ’。
2.一種織紋螺科線粒體COI基因的擴增方法，其特征在于:合成權(quán)利要求1所述的擴增引物，擴增待鑒定織紋螺科物種DNA，獲得680bp的DNA片段，即為該待鑒定織紋螺科物種線粒體COI基因。
3.權(quán)利要求2所述的擴增方法，其特征在于，擴增反應體系與條件為JOyLPCR反應體系為:IyLlOXbuffer Mg2+，ly L DNTP (2mM)，0.6 μ L Mgcl2 (25mM)，I μ L 引物MLC01490F (10 μ Μ), I μ L 引物 MHC02198R (10 μ Μ)，0.08 μ L r-Taq (5u/yL)，lyL DNA模板，4.32 μ L雙蒸水；PCR反應條件為:PCR熱循環(huán)的退火溫度為49°C。
【文檔編號】C12Q1/68GK104388571SQ201410744684
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月9日
【發(fā)明者】鄒山梅, 王長海 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學