一種融合蛋白及其載體的構(gòu)建方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種融合蛋白及其載體的構(gòu)建方法和應用，旨在建立一種使TALEN技術(shù)作為細胞株更加科學有效的融合載體的構(gòu)建方法；其技術(shù)要點：該融合蛋白結(jié)構(gòu)為EGFP-_mODC_NLS；其表達載體包含一個EGFP-_mODC_NLS融合蛋白及其一對切割NLS的TALEN質(zhì)粒對；該融合蛋白用于切割NLS信號的TALEN質(zhì)粒對以及原核表達EGFP_mODC_NLS_TALEN_R蛋白和EGFP_mODC_NLS_TALEN_R蛋白，也可以用于驗證TALEN質(zhì)粒對的轉(zhuǎn)染效率以及在細胞中的活性；屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【專利說明】一種融合蛋白及其載體的構(gòu)建方法和應用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開了一種融合蛋白，具體地說，是一種用于驗證TALEN質(zhì)粒對的轉(zhuǎn)染效率以及在細胞中的活性及其驗證其它質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率的融合蛋白，本發(fā)明還公開了該融合蛋白的構(gòu)建方法和應用。

【背景技術(shù)】
[0002]小鼠鳥氨酸脫羧酶(MODC)的中部和C-末端的氨基酸包含兩個PEST序列的降解域，這兩個降解域促進該蛋白的降解，使蛋白的半衰期很短，該特點在基因功能研究上有很大的應用。
[0003]類轉(zhuǎn)錄激活因子效應物核酸酶(transcript1n act ivator-like effectornuclease, TALEN)技術(shù)是一種嶄新的分子生物學工具。TALEN技術(shù)目前已經(jīng)廣泛應用于基因修飾。
[0004]尤其是動物模型和細胞模型的建立。但是，在制作細胞模型，或者敲除細胞某一個基因的時候。都需要把TALEN質(zhì)粒對通過Lipo2000或者病毒的形式轉(zhuǎn)到細胞中去，但是由于缺乏一個對照，TALEN的轉(zhuǎn)染效率和切割活性存在一個未知數(shù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對上述問題，本發(fā)明的目的在于建立一種使TALEN技術(shù)作為細胞株更加科學有效的融合蛋白及其載體的構(gòu)建方法。
[0006]為此，本發(fā)明提供的前一個技術(shù)方案是這樣的:該融合蛋白結(jié)構(gòu)為EGFP__mODC_NLS。
[0007]本發(fā)明提供的另一個技術(shù)方案是這樣的:該融合蛋白的表達載體包含一個EGFP-_mODC_NLS融合蛋白及其一對切割NLS的TALEN質(zhì)粒對。
[0008]進一步的，上述的融合蛋白載體的結(jié)構(gòu)為CMV-EGFP_mODC_NLS。
[0009]本發(fā)明的另一個目的是提供該融合蛋白的表達載體的制備方法，該方法依次包括下述步驟:
[0010]A)構(gòu)建 CMV-EGFP_mODC_NLS 表達載體:
[0011]I)用引物 GFP_F: ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA 和引物 Gfp_R:GGCTCAGCTATGATTCTCACTCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGA 去擴展 EGFP，回收 PCR 片段；
[0012]2)用引物 mODC_F: TCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGAGTGAGAATCATAGCTGAGCCA 和引物mODC_R:TCAATCAATTAGACTTTTCTCTTTTTCTTTGGTACCTTCCTCTTCTTTTTGGGCACATTGATCCTAGCAGAAGCAC擴展mODC片段；
[0013]3)融合步驟I)制備的PCR片段和步驟2)制備的mODC片段后，克隆到慢病毒表達載體上。
[0014]B)用Gold gate的方法構(gòu)建針對NLS的TALEN質(zhì)粒對
[0015]I) TALEN_F 識別的序列是:TCTGCTAGGATCAATGTGCC ；
[0016]2)識別的序列是
[0017]0慢病毒載體的制備
[0018]將沾慢病毒表達載體和輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293細胞，然后制備汕慢病毒；同時制備表達I'釓冊」7和I'釓冊」?的慢病毒。
[0019]0)穩(wěn)定表達細胞系的制備
[0020]汕慢病毒感染細胞?:5786胚胎干細胞；
[0021〕 ￡) 05786.26？？穩(wěn)定表達2即？的細胞株感染I從冊」7和I從冊」?質(zhì)粒對。
[0022]本發(fā)明提供的融合蛋白用于切割13信號的質(zhì)粒對以及原核表達郎--—
蛋白和蛋白。
[0023]本發(fā)明提供的融合蛋白用于驗證1^12^質(zhì)粒對的轉(zhuǎn)染效率以及在細胞中的活性。
[0024]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的技術(shù)方案制備方法簡單，使用該方法或者制備的穩(wěn)定表達的細胞株可以很好的用于對照實驗，使得I'從別技術(shù)做細胞株更加科學有效，該方法不僅可以用于基因功能研究的對照實驗，也可以用于藥物靶點篩選。
具體實施例
[0025]下面結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明的權(quán)利要求做進一步的詳細說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制，任何在本發(fā)明權(quán)利要求保護范圍內(nèi)所做的有限次的修改，仍在本發(fā)明的權(quán)利要求保護范圍之內(nèi)。
[0026]實施例1
[0027]本發(fā)明提供的一種融合蛋白結(jié)構(gòu)為￡(
[0028]其制備方法是:
[0029]將帶有重組質(zhì)粒的大腸桿菌8121菌種擴大培養(yǎng)，在12-181經(jīng)1？16過夜誘導，收集所得到的蛋白菌體，經(jīng)過高壓破碎后離心獲得可溶性的上清，進行附柱親和層析；待目的蛋白與附柱結(jié)合之后，先用漂洗液洗滌，在用洗脫緩沖液洗滌，在用脫鹽柱將洗脫組分中的高鹽緩沖液置換成含有20%甘油的？83溶液，之后進行的檢測，所得即為純化的蛋白。
[0030]本發(fā)明提供的一種融合蛋白的表達載體，包含一個融合蛋白及其一對切割13的I'釓別質(zhì)粒對；其結(jié)構(gòu)為
[0031]上述的融合蛋白的表達載體的制備方法，依次包括下述步驟:
[0032]八)構(gòu)建表達載體:
[0033]1)用引物即?」7: ^166X6^60^66606^66^ 和引物: 66010^601^16^11010^010001X6X^0^60X06X00^X6006^ 去擴展 2即？，回收？邙片段；
[0034]2)用引物 11100(:3: 10660^X66^06^60X6X^0^666^6X6^6^X0^X^60X6^600^ 和引物111000,^:10^10^11^6^01111010111110111661^00110010110111116660^0^116^1001^60^6^60^0擴展000(:片段；
[0035]3)融合步驟1)制備的？⑶片段和步驟2)制備的000(:片段后，克隆到慢病毒表達載體上。
[0036]8)用職仏的方法構(gòu)建針對13的I從冊質(zhì)粒對
[0037]1)其中I從冊」7識別的序列是； 1^120識別的序列是:
[0038]0汕慢病毒載體的制備
[0039]將沾慢病毒表達載體和輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293細胞，然后制備汕慢病毒；同時制備表達I'釓冊」7和I'釓冊」?的慢病毒。
[0040]0)汕穩(wěn)定表達細胞系的制備
[0041〕 汕慢病毒感染細胞?:5786胚胎干細胞；
[0042]￡) 05786.26？？穩(wěn)定表達2即？的細胞株感染I從冊」7和I從冊」?質(zhì)粒對。
[0043]穩(wěn)定表達26？？的單克隆挑選出來后，擴大培養(yǎng)制備成穩(wěn)定表達(^?的05786細胞株，然后感染和質(zhì)粒對。6個小時后，觀察發(fā)現(xiàn)定位在細胞質(zhì)里面，而細胞核沒有(^--。
[0044]該融合蛋白用于切割13信號的I從冊質(zhì)粒對以及原核表達
I'八[冊」?蛋白和蛋白或者用于驗證I'釓別質(zhì)粒對的轉(zhuǎn)染效率以及在細胞中的活性。
[0045]具體方法為:
[0046]對細胞內(nèi)源性基因以0？4與(1^5的敲除，用的05786細胞株作為對照。
[0047]首先設(shè)計細胞內(nèi)源性基因(1^5的I從別質(zhì)粒對，I從冊-?:0？5」？。
[0048]制備I從冊立，1^12^-001^5^ 慢病毒。
[0049]用打靶13序列的I從冊慢病毒感染穩(wěn)定表達的05786細胞；用I從冊立，1^12^-001^5^慢病毒感染另外的05786細胞。感染24小時后，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達的05786細胞⑶？從細胞核轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)。同時收集細胞，提取轉(zhuǎn)染I從冊立，1^12^-001^5^慢病毒的細胞基因組，利用引物
？1: 0X600X0060X0X^0X0^0X661 與(^咫―1？1:^11001666^6^6^060^0^0)擴增含有打靶位點的片段，作測序驗證，結(jié)果顯示，使用該方法從冊-(05立，1^12^-001^5^對細胞內(nèi)源基因001？5有切割活性，該方法可以成功用于對照實驗。
【權(quán)利要求】
1.一種融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白結(jié)構(gòu)為EGFP-_mODC_NLS。
2.一種融合蛋白的表達載體，其特征在于，該表達載體包含一個權(quán)利要求1所述的EGFP-_mODC_NLS融合蛋白及其一對切割NLS的TALEN質(zhì)粒對。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的融合蛋白載體，其特征在于，所述的表達載體結(jié)構(gòu)為CMV-EGFP_mODC_NLS。
4.制備權(quán)利要求2所述的融合蛋白的表達載體的方法，其特征在于，依次包括下述步驟: A)構(gòu)建CMV-EGFP_mODC_NLS 表達載體: 1)用引物GFP_F:ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA 和引物 Gfp_R:GGCTCAGCTATGATTCTCACTCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGA 擴展 EGFP，回收 PCR 片段； 2)用引物mODC_F:TCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGAGTGAGAATCATAGCTGAGCCA 和引物mODC_R:TCAATCAATTAGACTTTTCTCTTTTTCTTTGGTACCTTCCTCTTCTTTTTGGGCACATTGATCCTAGCAGAAGCAC擴展mODC片段； 3)融合步驟I)制備的PCR片段和步驟2)制備的mODC片段后，克隆到慢病毒表達載體上。 B)用Goldgate的方法構(gòu)建針對NLS的TALEN質(zhì)粒對: 1)TALEN_F識別的序列是:TCTGCTAGGATCAATGTGCC ； 2)TALEN_R 識別的序列是:TTTTCTCTTTTTCTTTGGTA。 C)pLV_CMV-EGFP_mODC_NLS慢病毒載體的制備 將pLV_CMV-EGFP_mODC_NLS慢病毒表達載體和輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293細胞，然后制備pLV_CMV-EGFP_mODC_NLS慢病毒；同時制備表達TALEN_F和TALEN_R的慢病毒。 D)pLV_CMV-EGFP_mODC_NLS穩(wěn)定表達細胞系的制備 pLV_CMV-EGFP_mODC_NLS慢病毒感染細胞C57B6胚胎干細胞； E)C57B6_EGFP穩(wěn)定表達EGFP的細胞株感染TALEN_F和TALEN_R質(zhì)粒對。
5.權(quán)利要求1所述的融合蛋白用于切割NLS信號的TALEN質(zhì)粒對以及原核表達EGFP_mODC_NLS_TALEN_R 蛋白和 EGFP_mODC_NLS_TALEN_R 蛋白。
6.權(quán)利要求1所述的融合蛋白用于驗證TALEN質(zhì)粒對的轉(zhuǎn)染效率以及在細胞中的活性。
【文檔編號】C12N15/867GK104497146SQ201410719532
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月1日
【發(fā)明者】霍依然, 李紅梅, 覃啟紅, 黃龍 申請人:廣州古藤蘭生物科技有限公司