一種黃連木種子產(chǎn)脂肪酶內(nèi)生菌pc1及其分離方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種黃連木種子產(chǎn)脂肪酶內(nèi)生菌PC1及其分離方法，通過(guò)將種子用酒精、氯化汞處理后，接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)得到內(nèi)生菌，用液體LB發(fā)酵菌種，將菌液接種于三丁酸甘油酯固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，選取透明圈的菌種接種于液體LB培養(yǎng)基發(fā)酵，取發(fā)酵液離心分離過(guò)濾后，將濾液用三丁酸甘油酯固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，篩選得到菌株P(guān)C1。菌株P(guān)C1平板劃線得到單菌落，外觀呈白色，生長(zhǎng)初期表明濕潤(rùn)光滑，隨后邊緣出現(xiàn)褶皺并變干；革蘭氏染色呈陽(yáng)性，在電子顯微鏡下觀察菌體呈桿狀。CCTCC NO：M201446120141009
【專利說(shuō)明】一種黃連木種子產(chǎn)脂肪酶內(nèi)生菌PC1及其分罔方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種黃連木種子產(chǎn)脂肪酶內(nèi)生菌PCI及其分 離方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 黃連木（Pistacia chinensis Bunge)又名偕木、黃楝、藥木等，系漆樹(shù)科黃連木屬 落葉喬木。黃連木籽含油49. 3%，不飽和脂肪酸高達(dá)82. 4%，是一種優(yōu)良的野生油料資源， 特別是生產(chǎn)生物柴油的理想木本油料。
[0003] 植物內(nèi)生菌（endophyte)是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健 康植物的各種組織和器官內(nèi)部或細(xì)胞間隙的真菌、細(xì)菌或放線菌，被感染的宿主植物（至 少是暫時(shí)）不表現(xiàn)出外在癥狀。植物內(nèi)生菌廣泛存在于已研究過(guò)的所有植物中，已在農(nóng)業(yè)、 醫(yī)藥和環(huán)境保護(hù)等方面有著重大應(yīng)用價(jià)值。但至今未見(jiàn)有關(guān)于黃連木內(nèi)生菌的報(bào)道。
[0004] 脂肪酶（Lipase，EC3. I. 1. 3)即三?；视王；饷?，是一類能在水-油界面催 化甘油三酯水解，而且在非水相介質(zhì)中可催化酯合成反應(yīng)的酶。脂肪酶普遍存在于動(dòng)植物 和微生物體內(nèi)，但微生物源脂肪酶具有更寬的反應(yīng)pH、適宜溫度范圍和更強(qiáng)的底物專一性 和立體選擇性，因而在酶學(xué)理論研究和實(shí)際應(yīng)用中具有更加突出的地位。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明旨在提供一種黃連木種子產(chǎn)脂肪酶內(nèi)生菌PCl及其分離方法，通過(guò)對(duì)其中 產(chǎn)脂肪酶的菌株進(jìn)行的選育，得到優(yōu)勢(shì)菌株，并對(duì)其酶學(xué)性進(jìn)行研究。
[0006] 本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] -種黃連木種子產(chǎn)脂肪酶內(nèi)生菌PCl，該菌株已進(jìn)行保藏，保藏單位：中國(guó)典型培 養(yǎng)物保藏中心，地址：湖北省武漢市洪山區(qū)八一路，武漢大學(xué)，中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心； 保藏日期：2014年10月9日；保藏編號(hào)為：CCTCC M 2014461。
[0008] 所述的黃連木種子產(chǎn)脂肪酶內(nèi)生菌PCl脂肪酶的核苷酸全長(zhǎng)序列如SEQ ID NO. 1 所示。
[0009] 所述的PCl菌株平板劃線得到單菌落，外觀呈白色，生長(zhǎng)初期表明濕潤(rùn)光滑，隨后 邊緣出現(xiàn)褶皺并變干；革蘭氏染色呈陽(yáng)性，在電子顯微鏡下觀察菌體呈桿狀。
[0010] 一種黃連木種子產(chǎn)脂肪酶內(nèi)生菌PCI及其分離方法，具體通過(guò)以下步驟完成：
[0011] 1)選取新鮮健康的黃連木果實(shí)，物理去除堅(jiān)硬的果皮后，從中挑選出完好無(wú)損的 種子在至少20倍體積的75%酒精中浸泡10min，0. 1%氯化汞中浸泡lOmin，用無(wú)菌水清洗 5次，每次Imin ;
[0012] 2)將5枚經(jīng)消毒的黃連木種子放入無(wú)菌研缽中，加入500 μ L無(wú)菌水研磨成糊狀， 加入無(wú)菌水稀釋至5mL，取100 μ L稀釋液接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，在28°C條件下培 養(yǎng)3?7天，得到內(nèi)生細(xì)菌，平板劃線純化后4°C穿刺保存；
[0013] 3)將獲得的菌株接種于5mL液體LB，28°C，150rpm培養(yǎng)過(guò)夜，取2 μ L菌液點(diǎn)于三 丁酸甘油酯固體培養(yǎng)基，48h后選取菌落周圍有明顯透明圈的菌株，再次接種于5mL液體LB 培養(yǎng)基中，28°C，150rpm震蕩發(fā)酵48h ;
[0014] 4)取ImL發(fā)酵液于IOOOOrpm離心Imin后，將上清液過(guò)濾，取濾液于打好孔的三丁 酸甘油酯固體培養(yǎng)基的孔內(nèi)，28°C培養(yǎng)48h后依據(jù)透明圈的直徑大小，篩選得到一株產(chǎn)脂 肪酶的優(yōu)勢(shì)菌株P(guān)Cl。
[0015] 所述的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基為：牛肉膏38/1，似(：158/1，蛋白胨1(^/1，？!17.4? 7. 6。
[0016] 所述的三丁酸甘油酯固體培養(yǎng)基為：蛋白胨l〇g/L，酵母浸膏5g/L，NaCl 5g/L，瓊 脂18g/L，pH 8. 0,三丁酸甘油酯乳化液2%，所述的三丁酸甘油酯乳化液：三丁酸甘油酯與 4%阿拉伯樹(shù)膠溶液體積比1:3在無(wú)菌條件下乳化至少5min。
[0017] 本發(fā)明方法得到的菌株P(guān)Cl可以分泌產(chǎn)脂肪酶，該酶對(duì)多種有機(jī)溶劑有耐受性， 其中甲醇和丙酮對(duì)該酶有明顯促進(jìn)作用，最適PH為8. 0,且有廣譜的pH穩(wěn)定性；最適作用 溫度為35°C，但不耐高溫，在50°C時(shí)基本失活；與短小芽孢桿菌L5脂肪酶有最近的親緣關(guān) 系。
[0018] 本發(fā)明的有益效果為首次從黃連木種子里分離得到內(nèi)生菌，通過(guò)對(duì)其中產(chǎn)脂肪酶 的菌株進(jìn)行的選育，得到一優(yōu)勢(shì)菌株P(guān)C1，為其酶學(xué)性質(zhì)的研究提供了技術(shù)支持。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1是本發(fā)明菌株P(guān)Cl的革蘭氏染色圖；
[0020] 圖2是本發(fā)明菌株P(guān)Cl的16S rDNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析；
[0021] 圖3是本發(fā)明菌株P(guān)Cl所產(chǎn)脂肪酶的最適pH和pH穩(wěn)定性；
[0022] 圖4是本發(fā)明菌株P(guān)Cl所產(chǎn)脂肪酶的最適溫度和熱溫定性；
[0023] 圖5是表面活性劑對(duì)本發(fā)明菌株P(guān)Cl所產(chǎn)脂肪酶活性的影響；
[0024] 圖6是有機(jī)溶劑對(duì)本發(fā)明菌株P(guān)Cl所產(chǎn)脂肪酶活性的影響；
[0025] 圖7是本發(fā)明菌株P(guān)Cl脂肪酶的核苷酸和推測(cè)的氨基酸序列；

【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步的說(shuō)明，以下所述，僅是對(duì)本發(fā)明的 較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用 上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為同等變化的等效實(shí)施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi) 容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所做的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與改型，均落在本 發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0027] 實(shí)施例1
[0028] -種黃連木種子產(chǎn)脂肪酶內(nèi)生菌PCl及其分離方法，具體通過(guò)以下步驟完成：
[0029] 1)選取新鮮健康的黃連木果實(shí)，物理去除堅(jiān)硬的果皮后，從中挑選出完好無(wú)損的 種子在至少20倍體積的75%酒精中浸泡1〇11^11，0.1%氯化汞中浸泡1〇1^11，中間不時(shí)搖動(dòng)， 然后用無(wú)菌水清洗5次，每次Imin ;
[0030] 2)將5枚經(jīng)消毒的黃連木種子放入無(wú)菌研缽中，加入500 μ L無(wú)菌水研磨成糊狀， 然后加入無(wú)菌水稀釋到5mL，取IOOyL稀釋液接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（牛肉膏3g， NaCl 5g，蛋白胨10g，水1L，PH 7. 4?7. 6)上，同時(shí)取最后一次清洗的無(wú)菌水和未研磨的 種子作為負(fù)對(duì)照，在28°C條件下培養(yǎng)3?7天，得到內(nèi)生細(xì)菌，平板劃線純化后4°C穿刺保 存；試驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)置3個(gè)平行組；
[0031] 3)將獲得的菌株接種于5mL液體LB，28°C，150rpm培養(yǎng)過(guò)夜，取2 μ L菌液點(diǎn)于三 丁酸甘油酯固體培養(yǎng)基上，48h后選取菌落周圍有明顯透明圈的菌株，再次接種于5mL液體 LB培養(yǎng)基中，28°C，150rpm震蕩發(fā)酵48h ;
[0032] 4)取ImL發(fā)酵液于IOOOOrpm離心Imin后，將上清液用無(wú)菌濾膜過(guò)濾，取濾液于打 好孔的三丁酸甘油酯固體培養(yǎng)基的孔內(nèi)，28°C培養(yǎng)48h后依據(jù)透明圈的直徑大小，篩選得 到一株產(chǎn)脂肪酶的優(yōu)勢(shì)菌株，暫命名為PCl。
[0033] 獲得的PCl菌株平板劃線得到單菌落，外觀呈白色，生長(zhǎng)初期表明濕潤(rùn)光滑，隨后 邊緣出現(xiàn)褶皺并變干；革蘭氏染色呈陽(yáng)性，在電子顯微鏡下觀察菌體呈桿狀（圖1)。
[0034] 該P(yáng)Cl菌株已進(jìn)行保藏，保藏單位：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：湖北省武漢 市洪山區(qū)八一路，武漢大學(xué)，中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏日期：2014年10月9日；保藏 號(hào)為：CCTCC M 2014461。
[0035] 通過(guò)利用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序得到PCl菌株的16S rDNA 的部分核苷酸序列，借助Clustalw和MEGA5. 1軟件對(duì)PCl菌株的16S rDNA序列進(jìn)化系統(tǒng) 分析（圖2)，顯示其與Bacillus pumilus S7具有最近的親緣關(guān)系，表明該菌屬于短小芽孢 桿菌 Bacillus pumilus，因此將該菌命名為 Bacillus pumilus PC1。
[0036] 實(shí)施例2利用對(duì)硝基苯酚法測(cè)定PCl所產(chǎn)脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì) [0037] L利用對(duì)硝基苯酚法測(cè)定脂肪酶活力
[0038] 分別配制溶液A [30mg對(duì)硝基苯棕櫚酸酯（p-NPP)溶于IOmL異丙醇]和溶液 B[50mmol/L Tris-HCl (pH 8. 0)]。將溶液A與B按1:18比例混勻并取I. 9mL于試管中，力口 入上清粗酶液〇. ImL (設(shè)高溫滅活的粗酶液為負(fù)對(duì)照），于28°C準(zhǔn)確反應(yīng)IOmin后，加入ImL 10 %的SDS溶液終止反應(yīng)。分光光度計(jì)0D410nm下測(cè)定催化產(chǎn)生的對(duì)硝基酚（pNP)的吸收 值。
[0039] 脂肪酶1個(gè)酶活單位定義：在pH8. 0, 28°C條件下，以每分鐘釋放1 μ mol pNP所需 的酶量，酶活計(jì)算公式：
[0040] A= ([A1 - A0] X K+C〇) XV1XnZ(V2Xt)
[0041] 式中，A:樣品酶活（U/mL) ;A1:樣品酶液的吸光度OD值；Atl:對(duì)應(yīng)酶液的空白吸光 度OD值；K:對(duì)硝基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；C tl:對(duì)硝基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距；η:稀釋倍數(shù)W1:反 應(yīng)液的體積/mL ;V2:酶液的體積/mL ;t:反應(yīng)時(shí)間/min。
[0042] 2.脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)
[0043] 把過(guò)夜培養(yǎng)的PCl菌液按1%接種量接種在50mL液體LB培養(yǎng)基中，150rpm發(fā)酵 48h。將發(fā)酵液經(jīng)5000rpm離心15min，取上清液在不同的pH環(huán)境下反應(yīng)IOmin后測(cè)酶的最 適pH，讓粗酶液與等體積的不同pH的緩沖液混合，4°C放置24h后測(cè)剩余酶活，確定酶的pH 穩(wěn)定性。將粗酶液在不同的溫度下反應(yīng)IOmin后測(cè)酶的最適作用溫度；讓粗酶液在不同的 溫度下放置Ih后測(cè)剩余酶活，確定酶的溫度穩(wěn)定性。將粗酶液與等體積的不同表面活性劑 或有機(jī)溶劑混勻，28°C，150rpm搖動(dòng)30min后檢測(cè)剩余酶活。
[0044] 結(jié)果表明，通過(guò)利用對(duì)硝基苯酚法測(cè)定PCl菌株所產(chǎn)脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)，表明該 PCl菌株所產(chǎn)脂肪酶的最適pH為8. O且有廣譜的pH穩(wěn)定性（圖3);最適作用溫度為35°C， 但不耐高溫，在50°C時(shí)基本失活（圖4)。表面活性劑顯著抑制該酶活性（圖5)。該酶對(duì)多 種有機(jī)溶劑有耐受性，其中甲醇和丙酮對(duì)該酶有明顯促進(jìn)作用（圖6)。
[0045] 實(shí)施例3PC1脂肪酶基因的克隆
[0046] 通過(guò)對(duì)NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布的部分短小芽孢桿菌脂肪酶的核苷酸序 列使用Clustalw軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)分析，確定嚴(yán)格保守的區(qū)段用于設(shè)計(jì)擴(kuò)增脂肪酶 基因全長(zhǎng)的正反向引物（P 1 :TAG AGTCGTATAAGATGAATAAGG 和 P2 :TTAATTCGTATTCTGTCCT CCG)。PCR 擴(kuò)增體系（50 μ L) :5 X PHmerSTAR(S)BufTer 10 μ L、d NTP Mixture (2. 5mM each)4y L、PrimeSTAR?HS (2. 5U/y L)0. 5μ L、ddH2032. 5μ L、引物 P1 和卩2(1(^]\〇 各 14 1^、？(：1基因組0嫩1以1^。？0?反應(yīng)條件：941：預(yù)變性41^11;951：變性2〇8,581：退火3〇8， 72°C延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物送往公司測(cè)序。
[0047] 結(jié)果表明：通過(guò)同源克隆得到PCl脂肪酶的核苷酸全長(zhǎng)序列，如SEQ ID NO. 1所 示，經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)化分析進(jìn)一步表明本發(fā)明鑒定的短小芽孢桿菌PCl脂肪酶與NCBI公布的短小 芽孢桿菌L5脂肪酶有最近的親緣關(guān)系（圖7)，但序列仍有區(qū)別。
[0048]

【權(quán)利要求】
1. 一種黃連木種子產(chǎn)脂肪酶內(nèi)生菌PC1，其特征在于：該菌株已于2014年10月9日保 藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為：CCTCC M 201446。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃連木種子產(chǎn)脂肪酶內(nèi)生菌PC1，其特征在于：所述的黃連木 種子產(chǎn)脂肪酶內(nèi)生菌PC1脂肪酶的核苷酸全長(zhǎng)序列如SEQ ID NO. 1所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃連木種子產(chǎn)脂肪酶內(nèi)生菌PC1，其特征在于：所述的PCI菌 株平板劃線得到單菌落，外觀呈白色，生長(zhǎng)初期表明濕潤(rùn)光滑，隨后邊緣出現(xiàn)褶皺并變干； 革蘭氏染色呈陽(yáng)性，在電子顯微鏡下觀察菌體呈桿狀。
4. 權(quán)利要求1所述的黃連木種子產(chǎn)脂肪酶內(nèi)生菌PC1的分離方法，其特征在于：包含 以下步驟： 1) 選取新鮮健康的黃連木果實(shí)，物理去除堅(jiān)硬的果皮后，從中挑選出完好無(wú)損的種子 在至少20倍體積的75%酒精中浸泡lOmin，0. 1 %氯化汞中浸泡lOmin，用無(wú)菌水清洗5次， 每次lmin ; 2) 將5枚經(jīng)消毒的黃連木種子放入無(wú)菌研缽中，加入500 y L無(wú)菌水研磨成糊狀，力口 入無(wú)菌水稀釋至5mL，取lOOy L稀釋液接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，在28°C條件下培養(yǎng) 3?7天，得到內(nèi)生細(xì)菌，平板劃線純化后4°C穿刺保存； 3) 將獲得的菌株接種于5mL液體LB，28°C，150rpm培養(yǎng)過(guò)夜，取2 y L菌液點(diǎn)于三丁酸 甘油酯固體培養(yǎng)基，48h后選取菌落周圍有明顯透明圈的菌株，再次接種于5mL液體LB培養(yǎng) 基中，28°C，150rpm震蕩發(fā)酵48h ; 4) 取lmL發(fā)酵液于lOOOOrpm離心lmin后，將上清液過(guò)濾，取濾液于打好孔的三丁酸甘 油酯固體培養(yǎng)基的孔內(nèi)，28°C培養(yǎng)48h后依據(jù)透明圈的直徑大小，篩選得到一株產(chǎn)脂肪酶 的優(yōu)勢(shì)菌株P(guān)C1。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的分離方法，其特征在于：所述的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基為：牛肉 膏38，恥(：158，蛋白胨1(^，水比，？117.4?7.6。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的分離方法，其特征在于：所述的三丁酸甘油酯固體培養(yǎng)基為： 蛋白胨l〇g/L，酵母浸膏5g/L，NaCl 5g/L，瓊脂18g/L，pH 8. 0,三丁酸甘油酯乳化液2%。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的分離方法，其特征在于：所述的三丁酸甘油酯乳化液為三丁 酸甘油酯與4%阿拉伯樹(shù)膠溶液體積比1:3在無(wú)菌條件下乳化至少5min。
【文檔編號(hào)】C12R1/07GK104388353SQ201410696261
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年11月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月26日
【發(fā)明者】陳東紅, 宋春竹, 阮穎, 黃勇, 劉春林 申請(qǐng)人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)