豬流行性腹瀉病毒強(qiáng)毒株和弱毒株鑒別診斷用引物及其檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及豬流行性腹瀉病毒強(qiáng)毒株和弱毒株鑒別診斷用引物及其檢測試劑盒，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。以總RNA為模板，利用鑒別診斷豬流行性腹瀉病毒強(qiáng)毒株和弱毒株的檢測引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增片段的數(shù)量和分子量大小判定結(jié)果。本發(fā)明的引物特異性好，檢測方法快速簡單，準(zhǔn)確性高，為豬流行性腹瀉病毒強(qiáng)毒株和弱毒株的鑒別診斷提供了保證。
【專利說明】豬流行性腹瀉病毒強(qiáng)毒株和弱毒株鑒別診斷用引物及其檢 測試劑盒
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及豬流行性腹瀉病毒強(qiáng)毒株和弱毒株鑒別診斷用引物及其檢測試劑盒， 屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0003] 豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)是冠狀病毒科冠 狀病毒屬的成員。PEDV在臨床上可以引起豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea, PED)，此病以腹瀉、嘔吐、脫水和對哺乳仔豬高致死率為主要特征。1978年，比利時和英國首 次報道PED(Pensaert M B，de Bouck P. A new coronavirus-like particle associated with diarrhea in swine. Arch Virol，1978,58:243_247)。其基因組為單分子線狀正鏈單 股RNA，大小為28kb左右，其5'端加帽，3'端為聚A尾，具有感染性。基因組包含有5' -UTR、 3'-UTR和至少7個0RF。這7個ORF中有4個編碼結(jié)構(gòu)蛋白：纖突蛋白（S)、小膜蛋白（E)、 囊膜蛋白（M)和核衣殼蛋白（N)，另3個編碼非結(jié)構(gòu)蛋白：復(fù)制酶（replicase ) la、復(fù)制酶 Ib 和 0RF3 蛋白，其順序?yàn)椋?'-r印licase (la/lb)-S-0RF3-E-M-N-3，。0RF3 蛋白編 碼一種離子通道蛋白，可調(diào)節(jié)病毒產(chǎn)生，與病毒的毒力有關(guān)；強(qiáng)毒株的0RF3基因長675bp， 而弱毒株的 0RF3 基因都缺少 49nt 或 51nt (Park ST，Moon H.T, Luo Y, et al. Cloning and further sequence analysis of the ORF3 gene of wild- and attenuated-type porcine epidemic diarrhea viruses. Virus Genes. 2008,36(1) :95-104 ； Kai Wang, Wei Lu, Jianfei Chen,et al. PEDV ORF3 encodes an ion channel protein and regulates virus production. FEBS Letters, 2012, 586 (4) :384 - 391)。M 基因不管在弱毒株中，還是在強(qiáng) 毒株中，都很保守。
[0004] 此前，我國尚無鑒別診斷豬流行性腹瀉病毒強(qiáng)毒株和弱毒株的二重RT-PCR方法。 常規(guī)單重RT-PCR技術(shù)僅能鑒定是否是豬流行性腹瀉病毒，不能區(qū)分強(qiáng)毒株和弱毒株。對豬 流行性腹瀉病毒強(qiáng)毒株和弱毒株的檢測只能通過0RF3基因測序來確定是否缺少49 nt或 51nt，操作繁雜、耗時長、成本較高。
[0005] 因此，基于以上的研究和當(dāng)前的需求， 申請人:根據(jù)豬流行性腹瀉病毒弱毒株0RF3 基因缺少49nt或51nt的特征，設(shè)計(jì)并合成了 2對檢測豬流行性腹瀉病毒的引物，采用 RT-PCR方法擴(kuò)增M基因和0RF3基因，通過擴(kuò)增片段的數(shù)量和分子量大小，判斷是豬流行性 腹瀉病毒強(qiáng)毒株還是豬流行腹瀉病毒弱毒株，從而特異、敏感、省時、省力、低成本地鑒別診 斷豬流行性腹瀉病毒強(qiáng)毒株和弱毒株。目前其他RT-PCR方法不能解決該問題；基因測序技 術(shù)需要時間較長，且費(fèi)時、費(fèi)力、成本高。因此，該技術(shù)可對豬流行性腹瀉病毒強(qiáng)毒株和弱毒 株的鑒別診斷和監(jiān)測起到重要作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 技術(shù)問題 本發(fā)明的目的在于提供豬流行性腹瀉病毒強(qiáng)毒株和弱毒株鑒別診斷用引物及其檢測 試劑盒。
[0007] 技術(shù)方案 本發(fā)明通過分析豬流行性腹瀉病毒強(qiáng)毒株和弱毒株的M基因和0RF3基因的序列，在M 基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物和在0RF3基因發(fā)生缺失的序列處設(shè)計(jì)引物。所述的引物對有2對。 第1對是PEDV-M正向引物和反向引物，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2。第2對是TODV-0RF3正向引物和反向引物，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4。
[0008] SEQ ID NO. 1 :5' -TATTCCCGTTGATGAGGTGATTG-3' SEQ ID NO. 2 : 5' -GCTGAATAGTCGCCGTGTTTTG-3' 該對引物從感染豬流行性腹瀉病毒強(qiáng)毒株或弱毒株的病料提取的總RNA中都可擴(kuò)增 出609bp DNA片段。
[0009] SEQ ID NO. 3 :5' -GGGTCCTAGACTTCAACCTTACG-3' SEQ ID N0.4 :5' -ATAGTTGCATCTAAAAGTGCACCAC-3' 該對引物從感染豬流行性腹瀉病毒強(qiáng)毒株的病料提取的總RNA中可擴(kuò)增出341bp DNA 片段。
[0010] 該引物不能從感染豬流行性腹瀉病毒弱毒株的病料提取的總RNA中擴(kuò)增出341 bp DNA片段。
[0011] 所述強(qiáng)毒株為豬流行性腹瀉病毒強(qiáng)毒株P(guān)EDV AH2012 ;所述弱毒株為豬流行性腹 瀉病毒弱毒株P(guān)EDV JS2008。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種用于鑒別檢測豬流行性腹瀉病毒強(qiáng)毒株和弱毒株的試劑盒， 該試劑盒含有上述引物 SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 3。
[0013] 具體的，該試劑盒包括： (1) 陰性對照：取滅菌的DEPC水，置-20°c冰箱保存； (2) RT反應(yīng)液： 5 XqRT Super Mix 4. 0 μ L 無菌DEPC水 6. 0 μ L 混勻后-20°C保存； (3) PCR反應(yīng)液： 2XHS PCR Mix 12. 5μ L 1〇μΜ SEQ ID NO. I 2. 〇μ? 1〇μΜ SEQ ID NO. 2 2. 〇μ? 1〇μΜ SEQ ID NO. 3 0. 5μ? 1〇μΜ SEQ ID NO. 1 0. 5μ? 無菌DEPC水 5. 5 μ L 混勻后-20°C保存。
[0014] 所述的試劑盒，還包括：強(qiáng)毒株陽性對照為豬流行性腹瀉病毒強(qiáng)毒株P(guān)EDV AH2012 發(fā)生腹瀉的糞便樣品、弱毒株陽性對照為豬流行性腹瀉病毒弱毒株P(guān)EDV JS2008的細(xì)胞毒。
[0015] 所述試劑盒用于檢測豬流行性腹瀉病毒強(qiáng)毒株和弱毒株的方法包括： 1) 樣品處理：采集疑似豬流行性腹瀉發(fā)病豬的糞便樣品，在糞便中按1 :1〇加入DEPC 水，劇烈震蕩使其混和均勻，8000rpm離心5 min，取20〇μ?上清液，置1.5mL滅菌離心管中 待用； 強(qiáng)毒株陽性對照樣品：取強(qiáng)毒株陽性對照樣品200 μ L，置I. 5mL滅菌離心管中待用； 弱毒株陽性對照樣品：取弱毒株陽性對照樣品200 μ L，置I. 5mL滅菌離心管中待用； 陰性對照樣品：取陰性對照樣品200 μ L，直I. 5mL滅囷尚心管中待用； 2) 總RNA的提?。喝∫烟幚淼拇龣z樣品、強(qiáng)毒株陽性對照樣品、弱毒株陽性對照樣品、 陰性對照樣品，加80〇μ? Trizol，振蕩混勻后，室溫放置5 min，加入氯仿200 μ?，劇烈振 蕩后，室溫放置5min，4°C 12000rpm，離心lOmin，取上清，加入0· 5mL異丙醇，混勻，室溫放 置20min，4°C 12000rpm離心15min，去上清，沉淀用ImL無 RNA酶的75%乙醇溶液洗滌， 4°C 7500rpm離心5min，去上清，室溫干燥RNA沉淀20min，加入DEPC水1〇μ?，使充分溶 解，-20°C凍存?zhèn)溆茫?3) RT反應(yīng)：在2〇μ?反應(yīng)體系中加入5 XqRT Super Mix 4.0 μ L，無菌DEPC水6.0 μ L， 總 RNA 10. 〇μ?。瞬間離心混勻，25°C反應(yīng) 15min，42°C孵育 60 min，95°C 5min; 4) PCR擴(kuò)增：在25μL反應(yīng)體系中加入2XPCRMIX12·5μL，SEQIDN0·12·0μL，SEQ ID NO. 2 2· 〇μ?，SEQ ID NO. 3 0· 5μ?，SEQ ID NO. 4 0· 5μ?，cDNA 2· 〇μ?，DEPC 水 5· 5μ?。 PCR 反應(yīng)條件：95°C 5min 預(yù)變性后，95°C 30s，55°C 30s，72°C 458,40個循環(huán)后，721：延伸 IOmin ； 5) 判定豬流行性腹瀉病毒強(qiáng)毒株和弱毒株 被檢樣品電泳出現(xiàn)二條與強(qiáng)毒株陽性對照大小相同的擴(kuò)增片段609 bp和341bp，判定 為豬流行性腹瀉病毒強(qiáng)毒株陽性； 被檢樣品電泳出現(xiàn)一條與弱毒株陽性對照大小相同的擴(kuò)增片段609 bp，判定為豬流行 性腹瀉病毒弱毒株陽性； 被檢樣品電泳不出現(xiàn)擴(kuò)增片段，判定為豬流行性腹瀉病毒陰性。
[0016] 有益效果 PEDV在臨床上可以引起豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea, PED)，此病以腹 瀉、嘔吐、脫水和對哺乳仔豬高致死率為主要特征。0RF3蛋白編碼一種離子通道蛋白，可調(diào) 節(jié)病毒產(chǎn)生，與病毒的毒力有關(guān)；強(qiáng)毒株的0RF3基因長675bp，而弱毒株的0RF3基因都缺 少49nt或51nt。目前，我國尚無鑒別診斷豬流行性腹瀉病毒強(qiáng)毒株和弱毒株的二重RT-PCR 方法。常規(guī)單重RT-PCR技術(shù)僅能鑒定是否是豬流行性腹瀉病毒，不能區(qū)分強(qiáng)毒株和弱毒 株。對豬流行性腹瀉病毒強(qiáng)毒株和弱毒株的檢測只能通過0RF3基因測序來確定是否缺少 49 nt或51nt，操作繁雜、耗時長、成本較高。
[0017] 本發(fā)明是根據(jù)豬流行性腹瀉病毒弱毒株0RF3基因缺少49nt或51nt的特征而設(shè) 計(jì)的引物，本發(fā)明的引物是經(jīng)過大量PEDV的0RF3基因序列比對和篩選得到的，而且應(yīng)用該 引物及本發(fā)明中的檢測試劑盒能夠快速判斷樣品中是否含有豬流行性腹瀉病毒強(qiáng)毒株和 弱毒株，為豬的腹瀉病提供檢測工具。
[0018] 同時，進(jìn)行過大量的臨床檢測和測序分析比對，都證實(shí)本發(fā)明的檢測引物和檢測 試劑盒能夠準(zhǔn)確無誤地檢測豬流行性腹瀉病毒強(qiáng)毒株和弱毒株，能夠達(dá)到區(qū)分強(qiáng)毒株和弱 毒株的目的，而以往檢測方法無法區(qū)分強(qiáng)毒株和弱毒株。本發(fā)明方法用于檢測豬流行性腹 瀉病毒強(qiáng)毒株靈敏度高，最小檢測量為100fg/yL樣品RNA，效果非常好。本發(fā)明的引物和 檢測試劑盒為臨床上檢測豬腹瀉病提供有效的工具。
[0019] 經(jīng)檢測，華東地區(qū)58份疑似豬流行性腹瀉發(fā)病豬的糞便樣品有41份為豬流行性 腹瀉病毒強(qiáng)毒株陽性，其RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與強(qiáng)毒株陽性對照的擴(kuò)增片段數(shù)量和大小一致， 有二條帶，分別為609 bp和341bp。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1是豬流行性腹瀉病毒強(qiáng)毒株和弱毒株的RT-PCR檢測結(jié)果，其中M :DL2000 DNA Ladder5L豬流行性腹瀉病毒強(qiáng)毒株；2.豬流行性腹瀉病毒弱毒株；3.豬傳染性胃腸炎 病毒（TGEV) ;4.豬輪狀病毒（PRV) ;5.陰性對照 圖2是本發(fā)明檢測方法的靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中M :DL2000 DNA Ladder ; 1-5表示反轉(zhuǎn) 錄反應(yīng)體系中加入的連續(xù)10倍稀釋的RNA模板。

【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面實(shí)施例用于對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0022] 實(shí)施例1 1、引物的設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)豬流行性腹瀉病毒M基因的核苷酸序列，采用Primer 5. 0設(shè)計(jì)引物，經(jīng)過大量篩 選得到如下序列的引物序列： M基因正向引物（PEDV-MF)的序列為SEQ ID NO. 1，M基因反向引物（PEDV-MR)序列為 SEQ ID NO. 2,具體序列的組成如下： SEQ ID NO. 1 :5' -TATTCCCGTTGATGAGGTGATTG-3' SEQ ID NO. 2 :5' -GCTGAATAGTCGCCGTGTTTTG-3' 根據(jù)豬流行性腹瀉病毒弱毒株0RF3基因缺少49nt或51nt的特征，針對0RF3基因及 其相鄰的基因序列，采用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，經(jīng)過大量篩選得到如下序列的引物序列： 0RF3基因正向引物（PEDV-0RF3F)的序列為SEQ ID NO. 3,0RF3反向引物（PEDV-0RF3R) 序列為SEQ ID NO. 4,具體序列的組成如下： SEQ ID NO. 3 :5' -GGGTCCTAGACTTCAACCTTACG-3' SEQ ID N0.4 :5' -ATAGTTGCATCTAAAAGTGCACCAC-3'。
[0023] 其中SEQ ID NO. 4引物是針對豬流行性腹瀉病毒弱毒株缺失的51nt或49nt序列， 即與下述缺失序列中畫線部分互補(bǔ)。
[0024] 缺失的 5 Int 序列為：ATTGCCCACTTTTATATTATT GTGGTGCATTTTTAGATGCAA CTATTATTT 缺失的 49nt 序列為：ATTGCCCACTTTTATATTACTGTGGTGCACTTTTAGATGCAA CTATTAT 在針對缺失序列的引物設(shè)計(jì)過程中，既要按照一般引物設(shè)計(jì)的要求，同時又只能在缺 失的51nt或49nt序列上進(jìn)行設(shè)計(jì)，所以難度較大。中間設(shè)計(jì)過如下幾對引物都沒有獲得 過成功： (1) Pl :5, -GCCCACTTTTATATTACTGTGGTGC-3，與 P2 :5, -CAGCTTC TTGCCGC CCAC-3， (2) P3 :5, -GCCCACTTTTATATTACTGTGGTGC-3，與 P4 :5，-AGCAGGAAAAAGAG TACGAAAAGCC-3， (3) P5 :5, - GTGGTGCACTTTTAGATGCAACTAT-3,與 P6 :5, -CAGCTTCTTGCCGC CCAC-3， (4) P7 :5, - GCCCACTTTTATATTACTGTGGTGC-3' 與 P8 :5，-CAGTTCGCAACAGAT GTAGGTCAG-3, (5) P9 :5, - GTGGTGCACTTTTAGATGCAACTAT-3，與 PlO :5, - CAGTTCGCAACAG ATGTAGGTCAG-3， 根據(jù)上述核苷酸序列信息合成M基因正向引物（PEDV-MF)、M基因反向引物（PEDV-MR)、 ORF3正向引物（PEDV-ORF3F)和ORF3反向引物（PEDV-ORF3R)。將上述引物各配置成濃度為 lOymol/L的溶液，備用。
[0025] 2、一種鑒別診斷豬流行性腹瀉病毒強(qiáng)毒株和弱毒株的試劑盒，按下表組裝： 表1試劑盒組成 3、陰性對照樣品的制備

【權(quán)利要求】
1. 豬流行性腹瀉病毒強(qiáng)毒株和弱毒株鑒別診斷用引物，包括 M 基因正向引物 PEDV-MF (SEQ ID N0.1):5'-TAITCCCGITGATGAGGTGAITG-3' 和反向 引物 PEDV-MR (SEQ ID N0.2) :5, -GCTGAATAGTCGCCGTGTTTTG-3， 該引物從感染豬流行性腹瀉病毒強(qiáng)毒株或弱毒株的病料提取的總RNA中都可擴(kuò)增出 609bp DNA 片段； 0RF3 基因正向引物 PEDV-0RF3F (SEQ ID N0.3):5'-GGGTCCTAGACTTCAACCT TACG-3' 和反向引物 PEDV- 0RF3R (SEQ ID N0.4) : 5' -ATAGTTGCATCTAAAAGTGCA CCAC-3' 該引物從感染豬流行性腹瀉病毒強(qiáng)毒株的病料提取的總RNA中可擴(kuò)增出341bp DNA片 段； 該引物不能從感染豬流行性腹瀉病毒弱毒株的病料提取的總RNA中擴(kuò)增出341 bp DNA 片段。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述豬流行性腹瀉病毒強(qiáng)毒株和弱毒株鑒別診斷用引物，其特征在 于，所述強(qiáng)毒株為豬流行性腹瀉病毒強(qiáng)毒株P(guān)EDV AH2012 ;所述弱毒株為豬流行性腹瀉病毒 弱毒株 PEDV JS2008。
3. -種用于檢測豬流行性腹瀉病毒強(qiáng)毒株和弱毒株的試劑盒，該試劑盒含有權(quán)利要求 1 或 2 所述的引物 SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4。
4. 如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，包括： (1) 陰性對照：取滅菌的DEPC水，置-20°C冰箱保存； (2) RT反應(yīng)液： 5XqRT Super Mix 4. 0 u L 無菌 DEPC 水 6. 0 ii L 混勻后-20°C保存； (3) PCR反應(yīng)液： 2XHS PCR Mix 12. 5u L 10剛 SEQ ID NO. 1 2. OML 10剛 SEQ ID NO. 2 2. OML 10剛 SEQ ID NO. 3 0. 5ML 10剛 SEQ ID NO. 4 0. 5ML 無菌 DEPC 水 5. 5 ii L 混勻后-20°C保存。
5. 如權(quán)利要求3或4所述的試劑盒，還包括：強(qiáng)毒株陽性對照為豬流行性腹瀉病毒強(qiáng) 毒株P(guān)EDV AH2012發(fā)生腹瀉的糞便樣品和弱毒株陽性對照為豬流行性腹瀉病毒弱毒株P(guān)EDV JS2008的細(xì)胞毒。
6. 如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，試劑盒用于檢測豬流行性腹瀉病毒強(qiáng)毒 株和弱毒株的方法包括： 1)樣品處理：采集疑似豬流行性腹瀉發(fā)病豬的糞便樣品，在糞便中按1 :1〇加入DEPC 水，劇烈震蕩使其混和均勻，8000rpm離心5 min，取200ML上清液，置1.5mL滅菌離心管中 待用； 強(qiáng)毒株陽性對照樣品：取強(qiáng)毒株陽性對照樣品200 y L，置1. 5mL滅菌離心管中待用； 弱毒株陽性對照樣品：取弱毒株陽性對照樣品200 y L，置1. 5mL滅菌離心管中待用； 陰性對照樣品：取陰性對照樣品200 y L，直1. 5mL滅囷尚心管中待用； 2) 總RNA的提取：取已處理的待檢樣品、強(qiáng)毒株陽性對照樣品、弱毒株陽性對照樣品、 陰性對照樣品，加800ML Trizol，振蕩混勻后，室溫放置5 min，加入氯仿200 ML，劇烈振 蕩后，室溫放置5min，4°C 12000rpm，離心lOmin，取上清，加入0? 5mL異丙醇，混勻，室溫放 置20min，4°C 12000rpm離心15min，去上清，沉淀用lmL無 RNA酶的75%乙醇溶液洗滌， 4°C 7500rpm離心5min，去上清，室溫干燥RNA沉淀20min，加入DEPC水10ML，使充分溶 解，-20°C凍存?zhèn)溆茫? 3. RT 反應(yīng)：在 20ML 反應(yīng)體系中加入 5XqRT Super Mix 4.0iiL，無菌 DEPC 水 6.0iiL， 總 RNA 10. OML ; 瞬間離心混勻，25°C反應(yīng)15min，42°C孵育60 min，95°C 5min; 4. PCR 擴(kuò)增：在 25ML 反應(yīng)體系中加入 2XPCR MIX 12.5ML，SEQ ID N0.1 2.0ML，SEQ ID NO. 2 2. OML，SEQ ID NO. 3 0? 5ML，SEQ ID NO. 4 0? 5ML，cDNA 2. OML，DEPC 水 5. 5ML ; PCR 反應(yīng)條件：95°C 5min 預(yù)變性后，95°C 30s，55°C 30s，72°C 45s，40 個循環(huán)后，72°C 延伸lOmin ; 5) 判定豬流行性腹瀉病毒強(qiáng)毒株和弱毒株 被檢樣品電泳出現(xiàn)二條與強(qiáng)毒株陽性對照大小相同的擴(kuò)增片段609 bp和341bp，判定 為豬流行性腹瀉病毒強(qiáng)毒株陽性； 被檢樣品電泳出現(xiàn)一條與弱毒株陽性對照大小相同的擴(kuò)增片段609 bp，判定為豬流行 性腹瀉病毒弱毒株陽性； 被檢樣品電泳不出現(xiàn)擴(kuò)增片段，判定為豬流行性腹瀉病毒陰性。
【文檔編號】C12Q1/68GK104498623SQ201410696032
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年11月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月26日
【發(fā)明者】倪艷秀, 何孔旺, 郭容利, 李彬, 俞正玉, 茅愛華, 呂立新, 祝昊丹, 周俊明, 溫立斌, 張雪寒, 王小敏, 汪偉, 胡屹屹 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院