一種鑒定水稻品種駿優(yōu)522及其親本的特異引物組合的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于鑒定三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其親本的特異引物組合，包括JU01、JU02、JU03和JU04，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～8所示，本發(fā)明同時還提供了根據(jù)上述引物組合來鑒定三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其親本的方法，步驟如下：首先提取目標植物基因組，然后以基因組為模板，用權利要求1所述的特異引物組合進行PCR檢測。本發(fā)明根據(jù)能鑒定三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其親本的ISSR引物擴增序列設計引物，通過PCR擴增，可以快速從其他水稻品種中鑒定三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其親本。本發(fā)明提供的三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其親本的鑒定方法，可用于上述水稻品種的純度鑒定，進而在輔助其育種中進行應用。
【專利說明】-種鑒定水稻品種駿優(yōu)522及其親本的特異引物組合

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測【技術領域】，特別涉及一種用于檢測三系雜交水稻品種駿優(yōu) 522及其親本的特異引物組合。

【背景技術】
[0002] 我國是世界上最大的雜交水稻種子生產(chǎn)國和消費國，具有龐大的雜交水稻種子市 場。目前國內(nèi)雜交水稻年種植面積約占水稻年種植總面積的59%以上，使水稻產(chǎn)量大幅度 提高，為保障我國的糧食安全做出了重要貢獻。獲得高純度的雜交種子是充分發(fā)揮雜種優(yōu) 勢增產(chǎn)潛力的基礎。機械混雜和生物學混雜是三系雜交水稻親本雜株的主要來源。種子純 度是衡量雜交水稻種子質量的主要指標，純度的下降將導致作物產(chǎn)量和質量的明顯降低。 低純度、真實性差的雜交水稻種子給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來極大損失，是種子質檢部門、育種研究單 位、制種單位和種子公司共同關心的問題。
[0003] 三系雜交水稻不育系"駿1A"為本 申請人:自主培育的，不育系"駿1A"與恢復系 "R0172"配組育成的三系雜交中稻品種"駿優(yōu)172"，以及不育系"駿1A"與恢復系"R522"配 組育成的三系雜交早熟中稻品種"駿優(yōu)522"，均已通過湖北省品種審定，抗稻瘟病，米質優(yōu)， 是適合湖北省恩施州種植的農(nóng)作物新品種。
[0004] 在實現(xiàn)上述研發(fā)的過程中，本申請的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術至少存在以下問題：
[0005] 沒有鑒定三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其親本的特異引物，無法將上述水稻品種 與其親本區(qū)分開，不能對其進行快速的種子純度分子標記鑒定和相關的分子標記輔助育種 等工作。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種用于鑒定三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其親本的特異引物組 合，解決了【背景技術】中的問題，采用該引物組合能夠快速、準確的對三系雜交水稻品種駿優(yōu) 522及其親本進行鑒定。
[0007] 實現(xiàn)本發(fā)明上述目的所采用的技術方案為：
[0008] -種用于鑒定三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其親本的特異引物組合，包 括包括JU01、JU02、JU03和JU04,其中JUOl正向引物如序列表中SEQIDNO. 1 : CACACACACACACACAGAGAACAG；
[0009]JU 01 反向引物如序列表中 SEQIDNO. 2:CACACACACAGAGAGGGAAAGA;
[0010]JU 02 正向引物如序列表中 SEQIDNO. 3:GGATAATCCGCATCAAGAAGAT;
[0011]JU 02 反向引物如序列表中 SEQIDNO. 4:GGTCACCCGAGAATTGCATT;
[0012] JU 03 正向引物如序列表中 SEQIDNO. 5:TGAGGCAACAATGCCTATTGCGGA ;
[0013]JU 03 反向引物如序列表中 SEQIDNO. 6:TATGAGTTCACTATGTGGAGGCTC;
[0014]JU 04 正向引物如序列表中 SEQIDNO. 7:AACAATGCCCAAACTTGAGAG;
[0015]JU 04 反向引物如序列表中 SEQIDNO. 8 :CGGGTCCACATGTCAGTGAG。
[0016] 本發(fā)明同時還提供了根據(jù)上述引物組合來鑒定三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其 親本的方法，步驟如下：首先提取目標植物基因組，然后以基因組為模板，用權利要求1所 述的特異引物組合進行PCR檢測。
[0017] 所述的PCR反應條件為：95°C5min;95°C變性30s，65°C退火40s，其中每個循環(huán)降 低 0.7°C，72°C延伸lmin30s，15 個循環(huán)；
[0018] 94°C變性 30s，55°C退火 45s，72°C延伸 2min，25 個循環(huán)；72°C后延伸 10min。
[0019]所述的PCR反應體系為：50ng/ μ1的DNA模板0.8μ1，10 XPCR緩沖液1μ1， 2. 5mMdNTPs(λ8μ1，10μM正、反向引物各(λ2μ1，DNA聚合酶(λ5U，CldH2O補足至 10μ1。
[0020] 本發(fā)明還提供了一種含有上述特異引物組合的檢測試劑盒。
[0021] 上述試劑盒能夠在鑒定三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其親本的純度以及輔助其 育種中進行應用。
[0022] 本發(fā)明根據(jù)能鑒定三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其親本的ISSR引物擴增序列設 計引物，通過PCR擴增，可以快速從其他水稻品種中鑒定三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其親 本。本發(fā)明提供的三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其親本的鑒定方法，可用于上述水稻品種 的純度鑒定，進而在輔助其育種中進行應用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1為本實施例中通過PCR反應在水稻中的擴增結果圖A ;
[0024] 圖2為本實施例中通過PCR反應在水稻中的擴增結果圖Β。

【具體實施方式】
[0025] 下面結合附圖以及具體實施例對本發(fā)明做詳細具體的說明，但是本發(fā)明的保護范 圍并不局限于以下實施例。
[0026] 以下實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等 的《分子克?。簩嶒炇沂謨浴罚∟ewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress，2001)中 所述的條件，或按照儀器或試劑制造廠商所建議的條件。所用試劑均為市售商品。
[0027] 本實施例提供的用于鑒定三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其親本的特異引物 組合，包括JU01、JU02、JU03和JU04,其中JUOl正向引物如序列表中SEQIDNO. 1: CACACACACACACACAGAGAACAG；
[0028]JU 01 反向引物如序列表中SEQIDNO. 2 :CACACACACAGAGAGGGAAAGA;
[0029]JU 02 正向引物如序列表中SEQIDNO. 3 :GGATAATCCGCATCAAGAAGAT;
[0030]JU 02 反向引物如序列表中SEQIDNO. 4 :GGTCACCCGAGAATTGCATT;
[0031]JU 03 正向引物如序列表中SEQIDNO. 5 :TGAGGCAACAATGCCTATTGCGGA;
[0032]JU 03 反向引物如序列表中SEQIDNO. 6 :TATGAGTTCACTATGTGGAGGCTC;
[0033]JU 04 正向引物如序列表中SEQIDNO. 7 :AACAATGCCCAAACTTGAGAG;
[0034]JU04反向引物如序列表中SEQIDNO. 8 :CGGGTCCACATGTCAGTGAG。本實施例中采 用上述引物組合來鑒定三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其親本的方法，步驟如下：
[0035] 1.實驗材料
[0036] I. 1植物材料
[0037] 中駿優(yōu)1及其親本不育系418A、保持系418B和恢復系R964,中駿優(yōu)1的相似來源 不育系中九A和保持系中九B;駿優(yōu)522及其未本不育系駿1A、保持系駿IB和恢復系R522， 駿優(yōu)522的的相似來源不育系福伊A和保持系福伊B。
[0038] 1. 2酶與試劑
[0039] 分子生物學試劑，TAKARArTaqDNA聚合酶，10XPCR緩沖液，dNTP Mixture(2. 5mM)購自大連寶生物公司。
[0040] 其它生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司 合成。
[0041] 1.3實驗儀器
[0042]振蕩破碎儀（Geno/grinder, USA);
[0043]PCR擴增儀：PTC-1OOTM(MJ,USA);
[0044] 核酸電泳儀：DYYIII型ΥΥ0115_94(北京六一儀器廠）；
[0045] DNA電泳分析系統(tǒng)：GeneSnap凝膠成像分析系統(tǒng)；
[0046] 其它儀器包括：恒溫水浴鍋、電子天平、離心機、渦旋儀、純水儀、恒溫培養(yǎng)箱等。
[0047] 2.實驗方法
[0048] 2. 1水稻基因組DNA的提取
[0049] 水稻單粒種植，取幼嫩葉片作為DNA提取材料，依照參照冷泉港實驗室出版社 (Cold Spring Harbor Laboratory Press)出版、Nina Irwin和Kaaren A. Janssen編著的 《分子克隆》一書提取水稻材料的總DNA。
[0050] 2. 2PCR擴增
[0051] 根據(jù)能鑒定三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其親本的ISSR引物擴增序列設計的特 異引物，利用該4對引物組合，以水稻基因組DNA為模板進行PCR擴增.
[0052]PCR擴增體系為：10XPCR緩沖液 1μl，2.5mMdNTPs0·6μ1，10μΜ正、反向引物 各 0· 2μ1，DNA聚合酶 0· 5U，50ng/yIDNA模板 0· 5μ1，ddH2 0 補足至 10μ1。
[0053]PCR擴增程序：95°C5min;95°C變性30s，65°C退火40s，（其中每個循環(huán)降低 0. 7°C) 72°C延伸lmin30s，15 個循環(huán)；94°C變性 30s，55°C退火 45s，72°C延伸 2min，25 個循 環(huán)；72°C后延伸10min。
[0054] 3.實驗結果
[0055] 擴增均以無菌水為陰性對照，只有當陰性對照擴增無任何帶型，則說明PCR結果 可靠。統(tǒng)計被檢測材料的擴增帶，陰性計為〇,陽性計為1。統(tǒng)計結果和聚類分析結果如下 表以及圖1和圖2所示。結果表明，本發(fā)明的4對分子標記組合可以將三系雜交水稻品種 駿優(yōu)522及其親本區(qū)分開。
[0056] 4對分子標記引物組合擴增2個三系雜交水稻組合的指紋圖譜統(tǒng)計
[0057]

【權利要求】
1. 一種用于鑒定三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其親本的特異引物組合，其特征 在于：包括JU01、JU02、JU03和JU04,其中JU01正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1 : CACACACACACACACAGAGAACAG ； JU 01 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 2 :CACACACACAGAGAGGGAAAGA ; JU 02 正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 3 :GGATAATCCGCATCAAGAAGAT ; JU 02 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 4 :GGTCACCCGAGAATTGCAIT ; JU 03 正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 5 :TGAGGCAACAATGCCTAITGCGGA ; JU 03 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 6 :TATGAGITCACTATGTGGAGGCTC ; JU 04 正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 7 :AACAATGCCCAAACTTGAGAG ; JU 04 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 8 :CGGGTCCACATGTCAGTGAG。
2. -種基于權利要求1所述的引物組合的鑒定三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其親本的 方法，其特征在于步驟如下：首先提取目標植物基因組，然后以基因組為模板，用權利要求 1所述的特異引物組合進行PCR檢測。
3. 根據(jù)權利要求2所述的鑒定三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其親本的方法，其特征 在于：所述的PCR反應條件為：95°C 5min ;95°C變性30s，65°C退火40s，其中每個循環(huán)降低 0? 7°C，72°C延伸 lmin30s，15 個循環(huán)； 94°C變性 30s，55°C退火 45s，72°C延伸 2min，25 個循環(huán)；72°C后延伸 10min。
4. 根據(jù)權利要求2或3所述的鑒定三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其親本的方法，其特 征在于：所述的PCR反應體系為：50ng/iil的DNA模板0. 8iil，10XPCI^^4^1ia，2.5mM dNTPs 0. l，10iiM 正、反向引物各 0. 1，DNA 聚合酶 0. 5U，ddH20 補足至 10ii 1。
5. -種含有權利要求1所述特異引物組合的檢測試劑盒。
6. 權利要求5所述試劑盒在鑒定三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其親本的純度以及輔助 其育種中的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK104357576SQ201410693416
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月26日 優(yōu)先權日:2014年11月26日
【發(fā)明者】徐鑫, 劉學群, 譚艷平, 王春臺, 熊杰 申請人:中南民族大學