一種飼用嗜酸小球菌液體生料發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵方法
【專利摘要】一種飼用嗜酸小球菌液體生料發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵方法，屬于微生物工程發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】，該發(fā)酵方法是將保藏的嗜酸小球菌接種到MRS固體斜面培養(yǎng)基上，37-40℃恒溫培養(yǎng)3-5d，得固體斜面菌種；將培養(yǎng)成熟的固體斜面菌種接種到MRS液體種子培養(yǎng)基中，37-40℃恒溫靜置培養(yǎng)24-36h，得液體菌種；再按2-5%的接種量（V/V）將培養(yǎng)好的液體菌種接種到制備的飼用嗜酸小球菌液體生料發(fā)酵培養(yǎng)基中，37-40℃恒溫靜置培養(yǎng)18-26h。本方法生產(chǎn)工藝簡單，對設(shè)備的要求低、投資小，生產(chǎn)成本低，獲得的嗜酸小球菌制劑質(zhì)量穩(wěn)定，產(chǎn)品活性高，有利于嗜酸小球菌液在動物養(yǎng)殖業(yè)中的推廣應(yīng)用，對提高我國的動物產(chǎn)品質(zhì)量具有重要的現(xiàn)實意義，同時具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。
【專利說明】一種飼用嗜酸小球菌液體生料發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物工程發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種飼用嗜酸小球菌液體生料發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵方法。

【背景技術(shù)】
[0002]乳酸菌是被各國批準(zhǔn)使用的最大一類和最早使用的益生菌。該菌作為人和動物的有益菌(或稱為益生菌)廣泛用于發(fā)酵乳制品(如益生菌酸奶、益生菌發(fā)酵乳飲料、益生菌奶酪)、發(fā)酵豆乳制品、功能性食品配料和食品添加劑(如在嬰兒配方乳粉、中老年乳粉、果蔬汁等中的添加等)、膳食補充劑(片劑、膠囊等)以及飼料微生態(tài)制劑中。
[0003]嗜酸小球菌(Ped1coccus acidilactici)是一種乳酸菌,屬于革蘭氏陽性菌,不運動，兼性厭氧。目前，嗜酸小球菌能賦予食品柔和的酸味及香氣，改進(jìn)食品的品質(zhì)和營養(yǎng)，還具有抗菌、降低膽固醇、維持微生態(tài)環(huán)境、抗腫瘤、抗變異和增強(qiáng)免疫力等重要生物學(xué)功能。其作為發(fā)酵菌種已經(jīng)大量的在多國的食品中使用，是備受人們喜愛和接受的有益菌群。此外，其顯著的抑菌效果，使得嗜酸小球菌潛藏著巨大的應(yīng)用價值和廣闊的應(yīng)用前景。
[0004]嗜酸小球菌作為一種新型的微生態(tài)制劑，除了具有益生素的功能外，還同時具有保健功能，尤其對人及動物無毒無病原性，對酸有很強(qiáng)的抵抗力，可順利地通過胃，并在腸道內(nèi)迅速增殖，調(diào)解腸道菌群，分泌類殺菌因子，刺激免疫系統(tǒng)提高免疫能力，促進(jìn)動物全群健康水平等方面，是飼料業(yè)中的綠色添加劑。
[0005]生料發(fā)酵是指微生物在培養(yǎng)基中不經(jīng)過高溫高壓條件下生長、繁殖和代謝的一種發(fā)酵方式。該發(fā)酵法起源于國外，最早應(yīng)用于釀酒工業(yè)，以酒精發(fā)酵為切入點。到了 20世紀(jì)90年代后期，隨著我國生物技術(shù)水平地不斷提高，使生料發(fā)酵有了新的進(jìn)步，技術(shù)逐漸成熟，并很快在全國各地和其它行業(yè)迅速發(fā)展。與熟料發(fā)酵相比，生料發(fā)酵減少了能耗和培養(yǎng)基中的營養(yǎng)損失。
[0006]目前關(guān)于嗜酸小球菌生料發(fā)酵及制劑應(yīng)用于動物養(yǎng)殖的公開文獻(xiàn)不多，主要集中在片球菌素的發(fā)酵生產(chǎn)和在香腸發(fā)酵中的應(yīng)用，如CN101050437和CN102115720A分別公開了生產(chǎn)片球菌素的方法；CN102127578A公開了一種積累片球菌素的方法，可以增加片球菌素的生產(chǎn)量；CN101289647公開的一株片球菌能夠在發(fā)酵香腸中作為發(fā)酵劑的應(yīng)用，改善發(fā)酵香腸的風(fēng)味；CN103283950A公開了嗜酸小球菌活菌制劑(作為畜禽飼料添加劑)的生產(chǎn)方法，但該方法是采用傳統(tǒng)的發(fā)酵技術(shù)，存在生產(chǎn)成本高、工藝復(fù)雜、設(shè)備投資大等缺點。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是:針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種飼用嗜酸小球菌液體生料發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵方法，該方法具有生產(chǎn)工藝簡單、設(shè)備投資少、生產(chǎn)成本和能耗低、易于推廣和應(yīng)用、產(chǎn)品活菌數(shù)高且活性高、無三廢排放等特點，解決了目前嗜酸小球菌特別是嗜酸小球菌生產(chǎn)工藝上存在的生產(chǎn)工藝復(fù)雜，生產(chǎn)成本高，設(shè)備投資大等問題。
[0008]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:一種飼用嗜酸小球菌液體生料發(fā)酵培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基按重量百分比由下列物質(zhì)組成:葡萄糖2-5%、蛋白胨0.5-0.8%、牛肉膏0.3-0.5%、酵母膏0.2-0.4%、無水乙酸鈉0.8-1.2%、磷酸氫二鉀0.1-0.2%、無水硫酸鎂 0.05-0.1%、熱保護(hù)劑 7-11%、雜菌抑制劑 0.1-3% 及水 80-88%，ρΗ5.5-7.0。
[0009]上述熱保護(hù)劑為海藻糖或甘油中的一種或兩種。上述雜菌抑制劑為雙乙酸鈉或NaCl中的一種或兩種。
[0010]上述發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法:按比例取葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、無水乙酸鈉、磷酸氫二鉀、無水硫酸鎂、熱保護(hù)劑及雜菌抑制劑加入水中，攪拌，使葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、無水乙酸鈉、磷酸氫二鉀、無水硫酸鎂、熱保護(hù)劑及雜菌抑制劑充分溶解，再調(diào)節(jié)PH值為5.5-7.0。pH值的調(diào)節(jié)為常規(guī)技術(shù)，如采用稀NaOH溶液、稀HCl溶液調(diào)節(jié)。
[0011]一種飼用嗜酸小球菌液體生料發(fā)酵方法，該方法步驟如下:
(1)固體斜面菌種制備:將嗜酸小球菌斜面菌種(保藏于4°c環(huán)境中)接種于新鮮MRS固體斜面培養(yǎng)基上，37-40°C恒溫培養(yǎng)3-5d ；
(2)液體菌種制備:將培養(yǎng)好的固體斜面菌種，在無菌條件下，挑取一接種環(huán)細(xì)胞接種于經(jīng)滅菌(115-1211:滅菌25-301^11)并冷卻至室溫的1--液體種子培養(yǎng)基中，37-401:恒溫靜置培養(yǎng)24-36h ；
(3)發(fā)酵:按2-5%的接種量(V/V)將培養(yǎng)好的液體菌種接種到上述飼用嗜酸小球菌液體生料發(fā)酵培養(yǎng)基中，37-40°C恒溫靜置培養(yǎng)18-26h，即得飼用嗜酸小球菌發(fā)酵液。
[0012]本發(fā)明中用到的嗜酸小球菌為現(xiàn)有技術(shù)，保藏號為:嗜酸小球菌acidilactici ) CGMCC1.4、CICC10344、CCAM080049 或 CICMB1355。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
(I)本方法使用的嗜酸小球菌熱保護(hù)劑直接加入液體生料發(fā)酵培養(yǎng)基中，增加了嗜酸小球菌對保護(hù)劑的適應(yīng)性，避免了保護(hù)劑對菌體的刺激而降低菌體的活性。
[0014](2)本方法采用的液體生料發(fā)酵，培養(yǎng)基不需要經(jīng)過高溫滅菌環(huán)節(jié)，極大地降低了嗜酸小球菌生產(chǎn)過程中的能耗，同時也避免了高溫滅菌過程中營養(yǎng)物質(zhì)的損失。
[0015](3)本方法具有生產(chǎn)工藝簡單、設(shè)備投資少、生產(chǎn)成本低、易于推廣和應(yīng)用、產(chǎn)品活菌數(shù)高且活性高、無三廢排放等特點。

【具體實施方式】
[0016]以下實施例僅對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0017]實施例1
1、發(fā)酵培養(yǎng)基制備:取葡萄糖35kg、蛋白胨7kg、牛肉膏3.5kg、酵母膏3kg、無水乙酸鈉10kg、磷酸氫二鉀1.2kg、無水硫酸鎂0.7kg、海藻糖85kg、NaC121kg及雙乙酸鈉9kg置于盛有824.6kg水的容器中，攪拌，使各物質(zhì)充分溶解，用稀NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為7.0。
[0018]2、固體斜面菌種制備:將保藏于4°C冰箱的嗜酸小球菌斜面菌種接種于新鮮MRS固體斜面培養(yǎng)基上，37 °C恒溫培養(yǎng)5d。
[0019]3、液體菌種制備:將培養(yǎng)好的固體斜面菌種，在無菌條件下，挑取一接種環(huán)細(xì)胞接種于經(jīng)滅菌(121°C滅菌25min)并冷卻至室溫的MRS液體種子培養(yǎng)基中，40°C恒溫靜置培養(yǎng)24h。
[0020]4、發(fā)酵:按4%的接種量(V/V)將培養(yǎng)好的液體菌種接種到前述制備好的發(fā)酵培養(yǎng)基中，40°C恒溫靜置培養(yǎng)18h，即得飼用嗜酸小球菌發(fā)酵液。
[0021]實施例2
1、發(fā)酵培養(yǎng)基制備:取葡萄糖50kg、蛋白胨5kg、牛肉膏3kg、酵母膏4kg、無水乙酸鈉8kg、磷酸氫二鉀2kg、無水硫酸鎂0.5kg、海藻糖60kg、甘油50kg、NaCl 17.5kg置于盛有800kg水的容器中，攪拌，使各物質(zhì)充分溶解，用稀HCl溶液調(diào)節(jié)pH值為5.5。
[0022]2、固體斜面菌種制備:將保藏于4°C冰箱的嗜酸小球菌斜面菌種接種于新鮮MRS固體斜面培養(yǎng)基上，40°C恒溫培養(yǎng)3d。
[0023]3、液體菌種制備:將培養(yǎng)好的固體斜面菌種，在無菌條件下，挑取一接種環(huán)細(xì)胞接種于經(jīng)滅菌(115°C滅菌30min)并冷卻至室溫的MRS液體種子培養(yǎng)基中，38°C恒溫靜置培養(yǎng)30h。
[0024]4、發(fā)酵:按2%的接種量(V/V)將培養(yǎng)好的液體菌種接種到前述制備好的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C恒溫靜置培養(yǎng)26h，即得飼用嗜酸小球菌發(fā)酵液。
[0025]實施例3
1、發(fā)酵培養(yǎng)基制備:取葡萄糖20kg、蛋白胨8kg、牛肉膏5kg、酵母膏2kg、無水乙酸鈉12kg、磷酸氫二鉀1kg、無水硫酸鎂1kg、甘油70kg及雙乙酸鈉Ikg置于盛有880kg水的容器中，攪拌，使各物質(zhì)充分溶解，用稀HCl溶液調(diào)節(jié)pH值為6.0。
[0026]2、固體斜面菌種制備:將保藏于4°C冰箱的嗜酸小球菌斜面菌種接種于新鮮MRS固體斜面培養(yǎng)基上，38 °C恒溫培養(yǎng)4d。
[0027]3、液體菌種制備:將培養(yǎng)好的固體斜面菌種，在無菌條件下，挑取一接種環(huán)細(xì)胞接種于經(jīng)滅菌(118°C滅菌28min)并冷卻至室溫的MRS液體種子培養(yǎng)基中，37°C恒溫靜置培養(yǎng) 36h。
[0028]4、發(fā)酵:按5%的接種量(V/V)將培養(yǎng)好的液體菌種接種到前述制備的發(fā)酵培養(yǎng)基中，39°C恒溫靜置培養(yǎng)22h，即得飼用嗜酸小球菌發(fā)酵液。
【權(quán)利要求】
1.一種飼用嗜酸小球菌液體生料發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，該培養(yǎng)基按重量百分比由下列物質(zhì)組成:葡萄糖2-5%、蛋白胨0.5-0.8%、牛肉膏0.3-0.5%、酵母膏0.2-0.4%、無水乙酸鈉0.8-1.2%、磷酸氫二鉀0.1-0.2%、無水硫酸鎂0.05-0.1%、熱保護(hù)劑7_11%、雜菌抑制劑0.1-3% 及水 80-88%, ρΗ5.5-7.0。
2.如權(quán)利要求1所述的一種飼用嗜酸小球菌液體生料發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述熱保護(hù)劑為海藻糖或甘油中的一種或兩種。
3.如權(quán)利要求1所述的一種飼用嗜酸小球菌液體生料發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述雜菌抑制劑為雙乙酸鈉或NaCl中的一種或兩種。
4.一種飼用嗜酸小球菌液體生料發(fā)酵方法，其特征在于:該方法步驟如下: (O固體斜面菌種制備:將嗜酸小球菌斜面菌種接種于新鮮MRS固體斜面培養(yǎng)基上，37-40°C恒溫培養(yǎng)3-5d ； (2)液體菌種制備:將培養(yǎng)好的固體斜面菌種，在無菌條件下，挑取一接種環(huán)細(xì)胞接種于已滅菌的MRS液體種子培養(yǎng)基中，37-40°C恒溫靜置培養(yǎng)24-36h ； (3)發(fā)酵:按2-5%的接種量(V/V)將培養(yǎng)好的液體菌種接種到權(quán)利要求1-3中任一項所述的飼用嗜酸小球菌液體生料發(fā)酵培養(yǎng)基中，37-40°C恒溫靜置培養(yǎng)18-26h，即得飼用嗜酸小球菌發(fā)酵液。
5.如權(quán)利要求4所述的一種飼用嗜酸小球菌液體生料發(fā)酵方法，其特征在于:步驟(2)中的滅菌是指于115-121°C滅菌25-30min，并冷卻至室溫。
【文檔編號】C12N1/20GK104357360SQ201410643050
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月14日
【發(fā)明者】蘭時樂, 周芳如, 肖調(diào)義, 李玥, 厲大偉, 王紅權(quán) 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)