一種致病疫霉的lamp檢測引物組合物及其lamp檢測試劑盒和lamp檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種致病疫霉菌的LAMP檢測引物組合物及其LAMP檢測試劑盒和LAMP檢測方法。該LAMP檢測引物組合物由正向內(nèi)引物FIP、反向內(nèi)引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向環(huán)引物L(fēng)B組成。本發(fā)明的檢測方法準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)、操作方便、實(shí)用性好、實(shí)現(xiàn)了恒溫?cái)U(kuò)增，同時(shí)還為致病疫霉菌的檢測提供了新的技術(shù)平臺(tái)，可用于致病疫霉菌的高靈敏度快速檢測，同時(shí)在病害侵染初期鑒定出病原物，能夠?qū)μ镩g土壤中的病原物進(jìn)行檢測，本發(fā)明對(duì)馬鈴薯、番茄的晚疫病防治和對(duì)減少農(nóng)藥盲目使用，降低生產(chǎn)成本，減少農(nóng)藥的環(huán)境污染也具有重要意義。
【專利說明】-種致病疫霉的LAMP檢測引物組合物及其LAMP檢測試劑 盒和LAMP檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種致病疫霉的LAMP檢測引物組合物及其 LAMP檢測試劑盒和LAMP檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 致病疫霉（Phytophthora infetans)是疫霉屬發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)種，能夠引起馬鈴薯 晚疫病，主要侵染馬鈴薯、番茄等多種農(nóng)作物，造成嚴(yán)重減產(chǎn)甚至絕收。馬鈴薯晚疫病是導(dǎo) 致馬鈴薯塊莖腐爛和莖葉死亡的一種毀滅性卵菌病害，是嚴(yán)重影響馬鈴薯產(chǎn)量、品質(zhì)和產(chǎn) 業(yè)化發(fā)展的世界性病害，1847年在愛爾蘭曾因該病的大發(fā)生使馬鈴薯歉收而導(dǎo)致大饑荒。 致病疫霉一直是馬鈴薯和番茄生產(chǎn)上的最嚴(yán)重的病害之一，近年來，馬鈴薯晚疫病在我國 有逐年加重的趨勢(shì)，其危害性、防治難度及對(duì)社會(huì)造成的影響已經(jīng)超過了水稻稻瘟病和小 麥條銹病，被視為世界第一大作物病害，特別是近年來由于抗病品種的推廣、交配型的出現(xiàn) 以及病菌的遷移，新的基因型群體取代了舊的基因型群體，形成了更具侵染力和適合度更 高的生理小種，使得晚疫病的控制異常困難，其危害也越來越嚴(yán)重，因此應(yīng)該引起高度重 視。為了阻止致病疫霉傳播范圍的不斷擴(kuò)大，使致病疫霉引起的晚疫病得到控制，需要對(duì)其 進(jìn)行快速、準(zhǔn)確地檢測。
[0003] 傳統(tǒng)的致病疫霉的分類鑒定主要是基于形態(tài)學(xué)特征、致病性測定、生理生化特征 等。傳統(tǒng)方法在致病疫霉檢測中發(fā)揮了重要作用，但是費(fèi)時(shí)費(fèi)力而且要求操作者具備專業(yè) 的疫霉分離、形態(tài)學(xué)鑒定知識(shí)和豐富的經(jīng)驗(yàn)。隨著核酸相關(guān)的鑒定方法的發(fā)展，PCR技術(shù)為 植物病原診斷提供了快速、靈敏、準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)，雖然PCR法在特異性和敏感性上有較大的提 高，但是檢測時(shí)間仍然比較長，大概4?5h，同時(shí)PCR方法依賴精密的溫度循環(huán)裝置。其檢 測靈敏度比較高，但是檢測過程復(fù)雜，不能滿足快速檢測的需求。
[0004] 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是日本 的榮研株式會(huì)發(fā)明的一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，因?yàn)槠洳僮骱唵?、快速、特異性高、成本低?優(yōu)點(diǎn)，成為可以替代PCR的新的核酸擴(kuò)增技術(shù)。它是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異 的引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循環(huán)鏈置換反應(yīng)，60?65°C范圍80min內(nèi)，大 量合成目標(biāo)DNA的同時(shí)伴隨有副產(chǎn)物--白色的焦磷酸鎂沉淀產(chǎn)生。由于LAMP擴(kuò)增過程 依賴識(shí)別靶序列6個(gè)獨(dú)立區(qū)域，所以反應(yīng)特異性很強(qiáng)，并且核酸擴(kuò)增過程是在恒溫條件下 進(jìn)行，普通水浴鍋或者有穩(wěn)定熱源的設(shè)備就能滿足反應(yīng)要求，檢測成本大大降低。由于LAMP 反應(yīng)簡單、快速、高效、經(jīng)濟(jì)等特征，因而具有極為廣泛的應(yīng)用前景。自LAMP檢測技術(shù)建立 14年以來，該技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于對(duì)病毒、細(xì)菌、寄生蟲、真菌等病原菌的檢測研究，但在植 物病原卵菌的檢測報(bào)道很少，致病疫霉菌的檢測國內(nèi)外均未見報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 發(fā)明目的：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中致病疫霉生物學(xué)檢測方法所需周期長、檢測方法特異 性差、靈敏度低的問題，本發(fā)明的目的是提供一種致病疫霉菌的LAMP檢測引物組合物。本 發(fā)明的另一目的是提供上述致病疫霉菌的LAMP檢測試劑盒。本發(fā)明還有一目的是提供上 述致病疫霉菌的LAMP檢測方法。
[0006] 技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0007] -種用于檢測致病疫霉菌的LAMP檢測引物組合物：由正向內(nèi)引物FIP、反向內(nèi)引 物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向環(huán)引物L(fēng)B組成；各引物序列具體如下：
[0008] FIP:5， -AATCGCGAAAGCCATGTGAGCCAAACGACCTTTTGTAAGG-3，；
[0009] BIPiSi -TTGCTTAGAAAATCCGTACGATCGGACAAATGTTTTTTTAGCGGC-3/ ；
[0010] F3:5， -TGTGAGTGTCTAACATATTTTACG-3';
[0011] B3 :5，-GTTAGTTAAATAGGAAATCACGC-3，；
[0012] LB:5，-GGCAAGACCATCAAGCTCCAA-S，。
[0013] 所述的LAMP檢測引物組合物在檢測致病疫霉菌的中的應(yīng)用。
[0014] 一種檢測致病疫霉菌的LAMP檢測試劑盒：包含ImL檢測溶液，所述的檢測溶液包 括：32mM正向內(nèi)引物FIP、32mM反向內(nèi)引物BIP、8mM正向外引物F3、8mM反向外引物B3、8mM 環(huán)引物 LF、8mM 環(huán)引物 LB、56mM dNTPs、0. 8M Tris-HC、0. 4mMKCl、0. 4mM(NH4) 2S04、0. 24mM MgS04、4% Triton X-100、Bst DNA polymerase 320 單位，180mM 羥基萘酚藍(lán)；其中，各引物 序列具體如下：
[0015] FIP:5， -AATCGCGAAAGCCATGTGAGCCAAACGACCTTTTGTAAGG-3，；
[0016] BIPiSi -TTGCTTAGAAAATCCGTACGATCGGACAAATGTTTTTTTAGCGGC-3/ ；
[0017] F3:5，-TGTGAGTGTCTAACATATTTTACG-3';
[0018] B3:5，-GTTAGTTAAATAGGAAATCACGC-3，；
[0019] LB:5，-GGCAAGACCATCAAGCTCCAA-S，。
[0020] 所述的檢測致病疫霉菌的LAMP試劑盒在檢測致病疫霉菌的中的應(yīng)用。
[0021] 一種檢測致病疫霉菌的LAMP檢測方法：包括提取待檢微生物的DNA，以提取的DNA 為模板，利用LAMP檢測引物組合物或LAMP檢測試劑盒進(jìn)行LAMP ;擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝 膠電泳，在紫外光下檢測結(jié)果，如果存在特征性階梯狀條帶，則證明所檢測樣品中存在致病 疫霉菌；無特征性階梯狀條帶，則所檢測樣品中無致病疫霉菌；或觀察LAMP反應(yīng)溶液顏色 變化，天藍(lán)色表示檢測為陽性，存在致病疫霉菌；紫色表示檢測結(jié)果為陰性，不存在致病疫 霉菌。
[0022] 所述的檢測致病疫霉菌的LAMP檢測方法：提取待檢微生物的DNA，取1 μ L DNA溶 液，加入23 μ LLAMP試劑盒中的檢測溶液和1 μ L滅菌去離子水進(jìn)行LAMP，LAMP反應(yīng)程序 為：6(TC?65°C，55 ?85min。
[0023] 本發(fā)明的檢測致病疫霉菌的方法，包括提取待檢微生物的DNA，以提取的DNA為模 板，利用所述的LAMP引物組合物進(jìn)行LAMP ;擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外光下檢 測結(jié)果（羥基萘酚藍(lán)不會(huì)影響電泳結(jié)果），如果存在特征性階梯狀條帶，則證明所檢測樣品 中存在致病疫霉菌；輕基萘酚藍(lán)（hydroxylnaphthol blue，HNB)屬于金屬離子指示劑的一 種。HNB是Mg2+的滴定劑，其顏色隨溶液pH變化而改變，因此可以通過監(jiān)測LAMP反應(yīng)體系 中Mg 2+濃度的變化及溶液pH而起到顏色指示劑的作用。反應(yīng)前將HNB加入到反應(yīng)液中，反 應(yīng)體系呈紫色，反應(yīng)過程中Mg 2+與LAMP反應(yīng)的副產(chǎn)物P2 074_結(jié)合產(chǎn)生大量沉淀，溶液中Mg2+ 濃度降低，pH發(fā)生變化,從而使HNB的顏色由紫色變?yōu)樘焖{(lán)色。因此，反應(yīng)結(jié)束后通過反應(yīng) 體系的顏色變化，來判斷致病疫霉的有無：天藍(lán)色表示檢測為陽性，存在致病疫霉菌；紫色 表示檢測結(jié)果為陰性，不存在致病疫霉菌。
[0024] 本發(fā)明的關(guān)鍵性技術(shù)之一是致病疫霉的高效特異擴(kuò)增的引物序列及其擴(kuò)增方法。 為了驗(yàn)證致病疫霉的特異性引物序列，本發(fā)明以我國江蘇、山東和福建等省份的30株致病 疫霉菌株和13種其它卵菌以及19種病原真菌為供試材料（表1)，采用CTAB法提取發(fā)病組 織中致病疫霉的DNA。具體方法如下：取少量菌絲粉，加900 μ L 2% CTAB提取液和90 μ L 10% SDS，漩渦混勻，于55°C水浴lh，中間每IOmin上下顛倒幾次。12000rpm離心lOmin，取 上清加等體積酚/氯仿/異戊醇（25 :24 :1)，顛倒混勻，12000rpm離心IOmin ;將上清轉(zhuǎn)移 至新管，加等體積氯仿，輕輕顛倒混勻，12000rpm離心5min。上清轉(zhuǎn)移至新管中，加2倍體積 的無水乙醇和 1/10 體積的 3M NaAc (pH 5. 2)，-20°C沉淀（>lh)。12000rpm 離心 IOminJtIi 去上清，沉淀用70%乙醇洗滌兩次，室溫晾干。加適量滅菌超純水或TE (pH 8.0)溶解沉淀 (含20μ8/ιΛ RNase)，37°C處理Ih后，-20°C保存?zhèn)溆?。所有的土壤樣品采用FastDNAw SPIN試劑盒（Q-Biogene Ltd, USA)進(jìn)行DNA的提取。土壤DNA提取步驟參見試劑盒說明 書。這一商用土壤微生物DNA提取試劑盒可以在0. 5h內(nèi)提取到土壤中的微生物。
[0025] 當(dāng)發(fā)生LAMP擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，產(chǎn)生大量的焦磷酸鎂白色沉淀導(dǎo)致反應(yīng)液的濁度上升， 通過HNB的顯色反應(yīng)結(jié)果所示，致病疫霉菌的反應(yīng)管均呈天藍(lán)色，其為陽性結(jié)果，而其它疫 霉種、真菌、腐霉和陰性對(duì)照菌反應(yīng)管均呈紫色，為陰性結(jié)果，證明所設(shè)計(jì)的LAMP特異性引 物具有種的特異性。同時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，成像觀察擴(kuò)增的反應(yīng)產(chǎn)物，致 病疫霉菌的反應(yīng)管中的反應(yīng)液出現(xiàn)了典型階梯形狀條帶，而其它疫霉種、真菌、腐霉和陰性 對(duì)照菌反應(yīng)管沒有出現(xiàn)梯形條帶。這說明該引物組可被用于生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)病組織及土壤中 致病疫霉菌的快速可靠的檢測盒鑒定。當(dāng)用于發(fā)病組織中存在致病疫霉菌時(shí)，采用NaOH快 速裂解法提取致病疫霉菌的DNA，具體過程如下：取一段發(fā)病的植株組織，每毫克組織加入 IOyL 0. 5M NaOH，在研缽中充分研磨后轉(zhuǎn)移至1.5mL的EP管中，12000rpm離心5min，取 5yL上清液加入495yL 0. ImM Tris(pH8. 0)，混勻后取IyL直接用于PCR反應(yīng)。每個(gè)反 應(yīng)至少重復(fù)三次，同時(shí)為確定植株中無 PCR抑制物存在。
[0026] 表1用于檢測致病疫霉特異性的真菌和卵菌菌株
[0027]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于檢測致病疫霉菌的LAMP引物組合物，其特征在于：由正向內(nèi)引物FIP、反向 內(nèi)引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向環(huán)引物L(fēng)B組成；各引物序列具體如下 ： FIP:5, -AATCGCGAAAGCCATGTGAGCCAAACGACCTTTTGTAAGG-3,; BIP:5' -TTGCTTAGAAAATCCGTACGATCGGACAAATGTTTTTTTAGCGGC-3'; F3:5' -TGTGAGTGTCTAACATATTTTACG-3'; B3:5' -GTTAGTTAAATAGGAAATCACGC-3^ ; LB:5, -GGCAAGACCATCAAGCTCCAA-3,。
2. 權(quán)利要求I所述的LAMP引物組合物在檢測致病疫霉菌的中的應(yīng)用。
3. -種檢測致病疫霉菌的LAMP試劑盒，其特征在于：包含ImL檢測溶液，所述的檢測 溶液包括：32 mM正向內(nèi)引物FIP、32 mM反向內(nèi)引物BIP、8 mM正向外引物F3、8 mM反向外 引物B3、8 mM環(huán)引物L(fēng)B、56 mM dNTPs、0.8 M Tris-HC、0.4 mM KC1、0.4 mM (NH4)2S04、0.24 mM MgS04、4%Triton X-100、Bst DNA polymerase 320 單位，180mM 羥基萘酚藍(lán)；其中，各引 物序列具體如下： FIP:5, -AATCGCGAAAGCCATGTGAGCCAAACGACCTTTTGTAAGG-3,; BIP:5' -TTGCTTAGAAAATCCGTACGATCGGACAAATGTTTTTTTAGCGGC-3'; F3:5' -TGTGAGTGTCTAACATATTTTACG-3'; B3:5' -GTTAGTTAAATAGGAAATCACGC-3^ ; LB:5, -GGCAAGACCATCAAGCTCCAA-3,。
4. 權(quán)利要求3所述的檢測致病疫霉菌的LAMP試劑盒在檢測致病疫霉菌的中的應(yīng)用。
5. -種檢測致病疫霉菌的方法，其特征在于：包括提取待檢微生物的DNA，以提取的 DNA為模板，利用LAMP引物組合物或LAMP試劑盒進(jìn)行LAMP ;擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電 泳，在紫外光下檢測結(jié)果，如果存在特征性階梯狀條帶，則證明所檢測樣品中存在致病疫 霉；無特征性階梯狀條帶，則所檢測樣品中無致病疫霉；或觀察LAMP反應(yīng)溶液顏色變化，天 藍(lán)色表示檢測為陽性，存在致病疫霉；紫色表示檢測結(jié)果為陰性，不存在致病疫霉菌。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測致病疫霉菌的方法，其特征在于：提取待檢微生物的 DNA，取I ii L DNA溶液，加入23 ii LLAMP試劑盒中的檢測溶液和I ii L滅菌去離子水進(jìn)行 LAMP，LAMP反應(yīng)程序?yàn)椋?0°C?65°C，55~85min，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外光下 檢測結(jié)果。
【文檔編號(hào)】C12R1/645GK104313175SQ201410639817
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月13日
【發(fā)明者】戴婷婷, 鄭小波, 吳小芹 申請(qǐng)人:南京林業(yè)大學(xué)