一種美國白蛾SUMO-ABP-dHC- Cecropin A融合蛋白及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種美國白蛾SUMO-ABP-dHC-CecropinA融合蛋白及其應(yīng)用，該美國白蛾SUMO-ABP-dHC-CecropinA融合蛋白表達方法如下：構(gòu)建pETSUMO-ABP-dHC-CecropinA表達載體，在大腸桿菌中表達，超聲破碎后收集上清Ni+親和純化，梯度洗脫之后得到美國白蛾SUMO-ABP-dHC-CecropinA融合蛋白。本發(fā)明通過基因重組方法獲得美國白蛾SUMO-ABP-dHC-CecropinA融合蛋白，并在大腸桿菌中獲得高效表達，目的多肽經(jīng)過HPLC分析達到大95%的純度，通過質(zhì)譜分析，分子量與預(yù)測多肽分子量也吻合。經(jīng)檢測，多肽具有明顯的抗真菌活性，所制備的目的多肽，其活性高、成本低。
【專利說明】—種美國白蛾SUMO-ABP-dHC- Cecropin A融合蛋白及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種美國白蛾SUMO-ABP-dHC- CecropinA融合蛋白及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]隨著抗生素的大量應(yīng)用，致病菌耐藥性的產(chǎn)生和新生抗生素的篩選瓶頸使得抗生素的應(yīng)用受到一定的制約。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽(Antimicrobal peptides,AMPs)以其獨特的作用機理和分子特性成為有望替代傳統(tǒng)抗生素的理想藥物。
[0003]要將抗菌肽應(yīng)用到生產(chǎn)實踐，還有許多問題亟待解決，其中最主要的問題就是如何大量獲取，現(xiàn)階段主要通過以下3種途徑獲得抗菌肽:(I)天然提?。?2)化學(xué)合成；(3)基因工程表達。雖然生物提取可為工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供便宜、安全、可靠的抗菌肽產(chǎn)品，而且最早研究與發(fā)現(xiàn)抗菌肽往往采用生物提取的方法，但由于抗菌肽在動植物體內(nèi)含量極微，因而天然提取抗菌肽往往雜質(zhì)較多、提取率較低、費時長、工藝復(fù)雜，因此成本相對較高，無法實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，這也成為制約抗菌肽進入實際應(yīng)用的最大障礙?；瘜W(xué)合成的方法雖然在生產(chǎn)上行得通，但是運用于產(chǎn)業(yè)化并不現(xiàn)實，特別是費用昂貴、對長鏈肽合成的低效率和抗菌活性不穩(wěn)定的問題，使得其應(yīng)用受到限制，仍不及通過基因工程在體外表達的發(fā)展?jié)摿Α＠没蚬こ谭椒▉砩a(chǎn)抗菌肽是一條理想途徑，通過對基因工程菌種、表達載體、表達條件、分離純化條件、表達系統(tǒng)等的不斷改造與優(yōu)化，得到了大量不同種類有活性的重組抗菌肽。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]發(fā)明目的:針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種美國白蛾SUMO-ABP-dHC- Cecropin A融合蛋白，具有很好的抗菌活性。本發(fā)明的另一目的是提供上述美國白蛾SUMO-ABP-dHC- Cecropin A融合蛋白的應(yīng)用。
[0005]技術(shù)方案:為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
一種美國白蛾SUMO-ABP-dHC- Cecropin A融合蛋白，由以下步驟獲得:
O根據(jù)美國白蛾天蠶素A基因序列設(shè)計引物Al、A2，以美國白蛾DNA為模板進行PCR，將PCR產(chǎn)物割膠回收，回收產(chǎn)物用和歷/^///酶切，SUMO載體只用歷酶切，T4 DNA Ligase連接酶切后的載體和PCR產(chǎn)物，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化萬.co7i toplO中，獲得含Petsumo-ABP-dHC- Cecropin A重組菌株；挑選陽性重組菌株，擴大培養(yǎng)提取Petsumo-ABP-dHC- Cecropin A重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 ；
2)1?了6濃度0.2 mmol/L，低溫誘導(dǎo)含有重組載體pETSUMO-dHC- Cecropin A的大腸桿菌表達菌株BL21，20小時后4°C收菌，冰上超聲破碎表達菌體，40C，13000g, 20min離心超聲破碎液后，棄沉淀，留上清過Ni+-NTA柱洗去雜蛋白，收集目的多肽透析過濾除菌后保存；其中，美國白蛾天蠶素A基因序列如SEQ ID N0.1所示。
[0006]所述的美國白蛾SUMO-ABP-dHC- Cecropin A融合蛋白，所述的引物A1、A2序列分別為:
Al 序列:5’ - CAGGTGGAAGATCTTTAAGAAAATCG-3’，
A2 序列:5，- CCCAAGCTTTTATTTTCTTAATGCTTTTGC-3，；
其中，Al的5’端具有泣W酶切位點，A2的5’端具有酶切位點。
[0007]所述的美國白蛾SUMO-ABP-dHC- Cecropin A融合蛋白，過Ni+-NTA柱洗去雜蛋白的步驟為:Binding Buffer平衡Ni+-NTA柱后，上樣含可溶性重組多肽的上清,先用Washingbuffer洗去雜蛋白，再用不同濃度的咪唑Tis HCl洗脫，目的多肽在洗脫濃度為250 mmol/L Imidazole, 0.5 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris HCl, pH 8.0 洗脫下來。
[0008]所述的美國白蛾SUMO-ABP-dHC- Cecropin A融合蛋白在抗真菌活性中的應(yīng)用。
[0009]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過基因重組方法獲得美國白蛾SUMO-ABP-dHC- Cecropin A融合蛋白，并在大腸桿菌中獲得高效表達，目的多肽經(jīng)過HPLC分析達到大95%的純度，通過質(zhì)譜分析，分子量與預(yù)測多肽分子量也吻合。經(jīng)檢測，多肽具有明顯的抗真菌活性，所制備的目的多肽，其活性高、成本低。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1 是 pET-SUMO- ABP- dHC-Cecropin A 質(zhì)粒圖；
圖 2 是融合多肽 SUMO-ABP- dHC-Cecropin A 37°C誘導(dǎo)表達 12% SDS-PAGE 圖；
圖 3 是融合多肽 SUMO-ABP- dHC-Cecropin A 純化 12% SDS-PAGE 圖；
圖4是SUMO酶切SUMO標(biāo)簽并獲得ABP- dHC-Cecropin A的4-20%梯度SDS-PAGE電泳圖；
圖5是SUMO酶切SUMO標(biāo)簽并獲得ABP- dHC-Cecropin A的質(zhì)譜分析圖；
圖6是表達的ABP- dHC-Cecropin A抗真菌抑菌圈圖。

【具體實施方式】
[0011]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的解釋。
[0012]在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。在以下的實施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用到的引物，均在首次出現(xiàn)時標(biāo)明，其后所用相同引物，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。以下實施例中使用的美國白蛾由徐州林業(yè)站提供。
[0013]實施例1 克隆 Cecropin A cDNA 1、提取美國白蛾總RNA。
[0014]應(yīng)用RNA抽提試劑(TIANGEN)按照其操作手冊提取美國白蛾蛹脂肪體的總RNA，并通過甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定其純度，大于95%，紫外分光光度計測定其濃度為720ng/^L，滿足使用需求。
[0015]2、采用Transgen cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA。
[0016]I)引物設(shè)計:根據(jù)NCBI惜古比天蠶,家蠶及果蠅Cecropin A序列比對設(shè)計兼并引物:
Cec-Al:5’ - ATGAATTTCNCAANAATNNTNTNCTTCGT -3’，
Cec-A2:5’ - NTATTTNCNAANGNTTTTNCNGTACCCAG -3'
[0017]2)逆轉(zhuǎn)錄:在DEPC處理的1.5mL Eppendorf管中依次加入總RNA抽提物3 μ L，Oligo d (T)18 (0.5 μ g/ μ L)1 μ L, 2 X TS React1n Mix 10 μ L, DEPC 水 5 μ L，TransScriptRT/RI Enzyme Mix I μ L ;42°C孵育 30min, 85°C加熱 5min 失活 TransScript RT。將得到的cDNA分裝后-20°C保存。
[0018]3) PCR:利用逆轉(zhuǎn)錄所得模板進行PCR,體系為25 μ L, 10 μ mol/L上、下游引物(上游引物:5’ - ATGAATTTCTCAAGAATTTTATTCTTC-3’，下游引物:5’ - TTATTTTCCT AATGCTTTTGCGGTAC-3，)各 I μ L，2.5mmol/L dNTP 2 μ L, 1XDreamTaq buffer 2.5 μ L, cDNA 模板
1.5 μ L，DreamTaq 酶 0.3 μ LJnddH2O 16.7 μ L0 反應(yīng)程序為:94°C 5min, (94 °C 30s, 58 °C30s, 72°C Imin)，30個循環(huán)，最后72°C延伸1min。反應(yīng)完成后將產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳分離，用膠回收試劑盒回收得到DNA條帶,克隆入pMD19-T載體,經(jīng)含Amp抗生素(50mg/mL)的瓊脂糖平板篩選轉(zhuǎn)化子，挑出陽性克隆送往上海英駿測序公司進行堿基序列測定，得到192bp的片段,將該序列與惜古比天蠶和家蠶Cecropin A比對,具有很高的同源相似性，因此確定該序列為美國白蛾Cecropin A (美國白蛾ABP- WCr-Cecropin A)的cDNA,序列如SEQ ID N0.1所示，共440堿基，其中1_58號堿基為該基因的5’ UTR非編碼區(qū)，59-247號堿基是該基因的全長編碼序列ORF區(qū)，翻譯63個氨基酸(從137-247號堿基是該基因的功能區(qū)，翻譯37個氨基酸)，248-250為終止密碼子序列，251-440號堿基為該基因的3’UTR非編碼區(qū)。所表達的蛋白序列如SEQ ID N0.2所示，共63個氨基酸，為基因的ORF區(qū)表達產(chǎn)物。
[0019]實施例2美國白蛾ABP-1*T-Cecropin A大腸桿菌體外表達
將美國白蛾ABP-Cecropin A序列構(gòu)建到pET-SUMO質(zhì)粒中區(qū)，如圖1所示，獲得pET-SUMO- ABP-1*r-Cecropin A，具體構(gòu)建方法如下:
I)根據(jù)實施例1獲得的ABP-1*T- Cecropin A序列設(shè)計引物Al、Α2，
Al 序列:5’ - CAGGTGGAAGATCTTTAAGAAAATCG-3’，
A2 序列:5，- CCCAAGCTTTTATTTTCTTAATGCTTTTGC-3，；
其中Al的5’端具有泣W酶切位點，A2的5’端具有酶切位點。
[0020]以美國白蛾DNA為模板進行PCR，將PCR產(chǎn)物割膠回收，回收產(chǎn)物用和歷ii////酶切，SUMO載體只用歷m/細(xì)切，T4 DNA Ligase連接酶切后的載體和PCR產(chǎn)物，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化疋co7i toplO中，獲得含pETSUM0-1*T- Cecropin A重組菌株。挑選陽性重組菌株，擴大培養(yǎng)提取pETSUM0-1*T- Cecropin A重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)中，挑選陽性菌株誘導(dǎo)表達，融合多肽SUMO-ABP- dHC-Cecropin A 37°C誘導(dǎo)表達結(jié)果如圖2所示。[0021 ] 2 ) IPTG 濃度 0.2mmol/L,低溫(16 °C )誘導(dǎo)含有重組載體 pETSUM0-ABP-1*r-Cecropin A的大腸桿菌表達菌株BL21 (DE3) 20小時后，4°C收菌，冰上超聲破碎(160W，工作4s，暫停8s，共99次)表達菌體，4°C，13000g，20min離心超聲破碎液后，棄沉淀，留上清過Ni+-NTA柱。簡要過程是:Binding Buffer平衡Ni+-NTA柱后，上樣含可溶性重組多肽的上清，先用 Washing buffer (20mmol/L Imidazole,0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris HCl,pH8.0)洗去雜蛋白，再用不同濃度的咪唑Tis HCl洗脫，目的多肽在洗脫濃度為250mmol/LImidazole, 0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris HCl, ρΗ8.0 洗脫下來。收集目的多妝(美國白蛾ABP-1*T-Cecropin A)透析過濾除菌后保存。
[0022]融合多肽SUMO-ABP- dHC-Cecropin A純化電泳圖如圖3所示，SUMO酶切SUMO標(biāo)簽并獲得ABP- dHC-Cecropin A的電泳圖如圖4所示，ABP- dHC-Cecropin A的質(zhì)譜分析圖如圖5所示，可見目的多肽經(jīng)過HPLC分析達到95%的純度，且分子量與預(yù)測多肽分子量也吻合。
[0023]實施例3美國白蛾ABP- ?/^-Cecropin A抗真菌活性鑒定 I)抗白色念珠菌白色念珠菌Canidia albicans活性鑒定
采用瓊脂糖孔穴擴散法測定大腸桿菌表達抗菌肽美國白蛾ABP- ?/^-Cecropin A對白色念珠菌albicans的抗菌活性。接種albicans于液體土豆培養(yǎng)基，250C 200rpm培養(yǎng)2小時，按1%菌量加至融化的土豆瓊脂糖培養(yǎng)基中(35_50°C )，混勻后按1mL/皿鋪于無菌一次性平皿。凝固后，在無菌條件下打孔，加入待測的樣品后置于25°C培養(yǎng)箱48小時，觀察抑菌活性，結(jié)果見圖6A，具有明顯的抗真菌活性。
[0024]2)抗粗糙脈孢菌crassa活性鑒定
采用瓊脂糖孔穴擴散法測定大腸桿菌表達抗菌肽美國白蛾ABP-1/ZT-Cecropin A對粗糖脈抱菌crassa的抗菌活性。接種crassa于液體土豆培養(yǎng)基，250C 200rpm培養(yǎng)2小時，按I %菌量加至融化的土豆瓊脂糖培養(yǎng)基中(35_50°C)，混勻后按10 mL/皿鋪于無菌一次性平皿。凝固后，在無菌條件下打孔，加入待測的樣品后置于25°C培養(yǎng)箱48小時，觀察抑菌活性，結(jié)果見圖6B，具有明顯的抗真菌活性。
[0025]3)抗根霉菌TSizo/WAs sp的活性鑒定
采用瓊脂糖孔穴擴散法測定大腸桿菌表達抗菌肽美國白蛾ABP-1/ZT-Cecropin A對根霉嵐Rhizopus sp的抗菌活性。接種TSizo/WAs sp于液體土豆培養(yǎng)基,25°C 200rpm培養(yǎng)2小時，按I %菌量加至融化的土豆瓊脂糖培養(yǎng)基中(35-50°C)，混勻后按10 mL/皿鋪于無菌一次性平皿。凝固后，在無菌條件下打孔，加入待測的樣品后置于25°C培養(yǎng)箱48小時，觀察抑菌活性，結(jié)果見圖6C，具有明顯的抗真菌活性。
[0026]4)抗鐮刀菌/7W1Sariiffl? sp的活性鑒定
采用瓊脂糖孔穴擴散法測定大腸桿菌表達抗菌肽美國白蛾ABP- ?/^-Cecropin A對鐮7]寬Fusarium sp的抗菌活性。接種a? sp于液體土豆培養(yǎng)基,25°C 200rpm培養(yǎng)2小時，按I %菌量加至融化的土豆瓊脂糖培養(yǎng)基中(35-50°C)，混勻后按10 mL/皿鋪于無菌一次性平皿。凝固后，在無菌條件下打孔，加入待測的樣品后置于25°C培養(yǎng)箱48小時，觀察抑菌活性，結(jié)果見圖6D，具有明顯的抗真菌活性。
[0027]5)抗鏈格孢菌Wieraaria sp的活性鑒定
采用瓊脂糖孔穴擴散法測定大腸桿菌表達抗菌肽美國白蛾ABP- ?/^-Cecropin A對鏈格孢菌Wtemaria sp的抗菌活性。接種Wtemaria sp于液體土豆培養(yǎng)基,25°C 200rpm培養(yǎng)2小時，按I %菌量加至融化的土豆瓊脂糖培養(yǎng)基中(35-50°C)，混勻后按10 mL/皿鋪于無菌一次性平皿。凝固后，在無菌條件下打孔，加入待測的樣品后置于25°C培養(yǎng)箱48小時，觀察抑菌活性，結(jié)果見圖6E，具有明顯的抗真菌活性。
[0028]6)抗毛霉菌量/cor sp的活性鑒定
采用瓊脂糖孔穴擴散法測定大腸桿菌表達抗菌肽美國白蛾ABP-1/ZT-Cecropin A對毛霉菌ifocor sp的抗菌活性。接種ifocor sp于液體土豆培養(yǎng)基,25°C 200rpm培養(yǎng)2小時，按1%菌量加至融化的土豆瓊脂糖培養(yǎng)基中(35-50°C )，混勻后按1mL/皿鋪于無菌一次性平皿。凝固后，在無菌條件下打孔，加入待測的樣品后置于25?培養(yǎng)箱48小時，觀察抑菌活性，結(jié)果見圖6F，具有明顯的抗真菌活性。
【權(quán)利要求】
1.一種美國白蛾SUMO-ABP-dHC- Cecropin A融合蛋白，其特征在于，由以下步驟獲得: O根據(jù)美國白蛾天蠶素A基因序列設(shè)計引物Al、A2，以美國白蛾DNA為模板進行PCR，將PCR產(chǎn)物割膠回收，回收產(chǎn)物用和歷/^///酶切，SUMO載體只用歷酶切，T4 DNA Ligase連接酶切后的載體和PCR產(chǎn)物，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化萬.co7i toplO中，獲得含Petsumo-ABP-dHC- Cecropin A重組菌株；挑選陽性重組菌株，擴大培養(yǎng)提取Petsumo-ABP-dHC- Cecropin A重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 ； 2)1?了6濃度0.2 mmol/L，低溫誘導(dǎo)含有重組載體pETSUMO-dHC- Cecropin A的大腸桿菌表達菌株BL21，20小時后4°C收菌，冰上超聲破碎表達菌體，40C，13000g, 20min離心超聲破碎液后，棄沉淀，留上清過Ni+-NTA柱洗去雜蛋白，收集目的多肽透析過濾除菌后保存； 其中，美國白蛾天蠶素A基因序列如SEQ ID N0.1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的美國白蛾SUMO-ABP-dHC-Cecropin A融合蛋白，其特征在于，所述的引物A1、A2序列分別為:
Al 序列:5’ _ CAGGTGGAAGATCTTTAAGAAAATCG-3’， A2 序列:5，- CCCAAGCTTTTATTTTCTTAATGCTTTTGC-3，； 其中，Al的5’端具有泣W酶切位點，A2的5’端具有酶切位點。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的美國白蛾SUMO-ABP-dHC-Cecropin A融合蛋白，其特征在于，過Ni+-NTA柱洗去雜蛋白的步驟為:Binding Buffer平衡Ni+-NTA柱后，上樣含可溶性重組多肽的上清，先用Washing buffer洗去雜蛋白，再用不同濃度的咪唑Tis HCl洗脫，目的多妝在洗脫濃度為 250 mmol /T, Imidazole, 0.5 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris HCl’pH 8.0洗脫下來。
4.權(quán)利要求1所述的美國白蛾SUMO-ABP-dHC-Cecropin A融合蛋白在抗真菌活性中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/70GK104327188SQ201410617702
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月6日
【發(fā)明者】諸葛強, 張嘉鑫, 武小龍, 王曉立, 潘惠新, 尹佟明 申請人:南京林業(yè)大學(xué)