一種美國(guó)白蛾天蠶素a基因及其表達(dá)蛋白和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種美國(guó)白蛾天蠶素A基因及其表達(dá)蛋白和應(yīng)用。該美國(guó)白蛾天蠶素A基因的DNA序列如SEQIDNO.1所示，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本發(fā)明首次從美國(guó)白蛾中克隆的天蠶素A基因的cDNA全長(zhǎng)序列，并獲得其表達(dá)蛋白，依據(jù)該蛋白序列，首次用化學(xué)方法合成C末端酰胺化的美國(guó)白蛾天蠶素A抗菌肽，采用瓊脂糖孔穴擴(kuò)散法測(cè)定合成抗菌肽美國(guó)白蛾天蠶素A抗菌肽對(duì)大腸桿菌E.coliK12D31和農(nóng)桿菌AgrobacteriumEHA105的抗菌活性，具有很強(qiáng)的抗細(xì)菌活性，在抑菌中具有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】—種美國(guó)白蛾天蠶素A基因及其表達(dá)蛋白和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種美國(guó)白蛾天蠶素A (Cecropin A)基因及其表達(dá)蛋白和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]抗菌肽是一類具有廣譜高效殺菌活性的多肽類物質(zhì)，是自然界中特別是昆蟲(chóng)非特異性免疫系統(tǒng)的一個(gè)必不可少的組成部分。1972年，瑞典科學(xué)家Boman等最早從天蠶蛹中發(fā)現(xiàn)抗菌肽cecropins，接著又從各種不同動(dòng)物(哺乳類、兩棲類等)和植株內(nèi)分離得到了抗菌肽，此外部分細(xì)菌也能產(chǎn)生抗菌肽。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)部分抗菌肽還對(duì)某些致病真菌、病原蟲(chóng)、病毒甚至腫瘤細(xì)胞具有顯著的殺傷作用，是一類具有重要潛在應(yīng)用價(jià)值的活性物質(zhì)?？咕木哂胁煌趥鹘y(tǒng)抗生素的獨(dú)特抗菌機(jī)制，但對(duì)機(jī)體無(wú)毒副作用、無(wú)殘留，這為解決細(xì)菌對(duì)傳統(tǒng)抗生素日益增強(qiáng)的問(wèn)題提供新思路。
[0003]根據(jù)GenBank、EMBL和DDBJ國(guó)際三大主要核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)搜索結(jié)果得知，目前惜古比天蠶、家蠶Cecropin A cDNA已被克隆,并分別已在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中申請(qǐng)了序列號(hào)，而美國(guó)白蛾Cecropin A的cDNA還未被克隆出來(lái),關(guān)于美國(guó)白蛾Cecropin A基因的研究在整個(gè)國(guó)內(nèi)外還處于完全空白狀態(tài)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]發(fā)明目的:針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種美國(guó)白蛾天蠶素A基因。本發(fā)明的另一目的是提供上述美國(guó)白蛾天蠶素A基因的表達(dá)蛋白。本發(fā)明還有一目的是提供上述美國(guó)白蛾天蠶素A基因的應(yīng)用。
[0005]技術(shù)方案:為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
一種美國(guó)白蛾天蠶素A基因，其DNA序列如SEQ ID N0.1所示。
[0006]所述的美國(guó)白蛾天蠶素A基因的表達(dá)蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0007]所述的美國(guó)白蛾天蠶素A基因在抗細(xì)菌活性中的應(yīng)用。
[0008]所述的美國(guó)白蛾天蠶素A基因的表達(dá)蛋白在抗細(xì)菌活性中的應(yīng)用。
[0009]一種美國(guó)白蛾天蠶素A抗菌肽，所述的美國(guó)白蛾天蠶素A抗菌肽的多肽序列為美國(guó)白蛾天蠶素A基因的表達(dá)蛋白序列的一部分，具體序列為:RWKIFKKIERVGQNVRDGIIKAGPAIQVLGTAKALGK。
[0010]所述的美國(guó)白蛾天蠶素A抗菌肽在抗細(xì)菌活性中的應(yīng)用。
[0011]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明首次從美國(guó)白蛾中克隆的天蠶素A基因的cDNA全長(zhǎng)序列，并獲得其表達(dá)蛋白，依據(jù)該蛋白序列，首次用化學(xué)方法合成C末端酰胺化的美國(guó)白蛾天蠶素A抗菌肽，采用瓊脂糖孔穴擴(kuò)散法測(cè)定合成美國(guó)白蛾天蠶素A抗菌肽對(duì)大腸桿菌E.coli K12D31和農(nóng)桿菌Agrobacterium EHA105的抗菌活性，具有很強(qiáng)的抗細(xì)菌活性，在抑菌中具有廣泛的應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1是美國(guó)白蛾天蠶素A抗菌肽對(duì)大腸桿菌的抗菌活性結(jié)果圖；
圖2是美國(guó)白蛾天蠶素A抗菌肽對(duì)農(nóng)桿菌的抗菌活性結(jié)果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0013]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋。
[0014]在本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)，除非有另外說(shuō)明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過(guò)程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用到的引物，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同引物，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。以下實(shí)施例中使用的美國(guó)白蛾由徐州林業(yè)站提供。
[0015]實(shí)施例1 克隆 Cecropin A cDNA 1、提取美國(guó)白蛾總RNA。
[0016]應(yīng)用RNA抽提試劑(TIANGEN)按照其操作手冊(cè)提取美國(guó)白蛾蛹脂肪體的總RNA，并通過(guò)甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定其純度，大于95%，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度為720ng/^L，滿足使用需求。
[0017]2、采用Transgen cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA。
[0018]I)引物設(shè)計(jì):根據(jù)NCBI惜古比天蠶,家蠶及果蠅Cecropin A序列比對(duì)設(shè)計(jì)兼并引物:
Cec-Al:5’ - ATGAATTTCNCAANAATNNTNTNCTTCGT -3’，
Cec-A2:5’ _ NTATTTNCNAANGNTTTTNCNGTACCCAG -3'
[0019]2)逆轉(zhuǎn)錄:在DEPC處理的1.5mL Eppendorf管中依次加入總RNA抽提物3 μ L，Oligo d (T)18 (0.5 μ g/ μ L)1 μ L, 2 X TS React1n Mix 10 μ L, DEPC 水 5 μ L，TransScriptRT/RI Enzyme Mix I μ L ;42°C孵育 30min, 85°C加熱 5min 失活 TransScript RT。將得到的cDNA分裝后-20°C保存。
[0020]3) PCR:利用逆轉(zhuǎn)錄所得模板進(jìn)行PCR,體系為25 μ L, 10 μ mol/L上、下游引物(上游引物:5’ - ATGAATTTCTCAAGAATTTTATTCTTC-3’，下游引物:5’ - TTATTTTCCT AATGCTTTTGCGGTAC-3，)各 I μ L，2.5mmol/L dNTP 2 μ L, 1XDreamTaq buffer 2.5 μ L, cDNA 模板
1.5 μ L，DreamTaq 酶 0.3 μ LjPddH2O 16.7 μ L0 反應(yīng)程序?yàn)?94°C 5min, (94 °C 30s, 58 °C30s, 72°C Imin)，30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸1min。反應(yīng)完成后將產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳分離，用膠回收試劑盒回收得到DNA條帶,克隆入pMD19-T載體,經(jīng)含Amp抗生素(50mg/mL)的瓊脂糖平板篩選轉(zhuǎn)化子，挑出陽(yáng)性克隆送往上海英駿測(cè)序公司進(jìn)行堿基序列測(cè)定，得到192bp的片段,將該序列與惜古比天蠶和家蠶Cecropin A比對(duì),具有很高的同源相似性，因此確定該序列為美國(guó)白蛾Cecropin A cDNA,序列全長(zhǎng)如SEQ ID N0.1所不,共440堿基，其中1-58號(hào)堿基為該基因的5’UTR非編碼區(qū)，59-247號(hào)堿基是該基因的全長(zhǎng)編碼序列ORF區(qū)，翻譯63個(gè)氨基酸(從137-247號(hào)堿基是該基因的功能區(qū)，翻譯37個(gè)氨基酸)，248-250為終止密碼子序列，251-440號(hào)堿基為該基因的3’ UTR非編碼區(qū)。所表達(dá)的蛋白序列如SEQID N0.2所示，共63個(gè)氨基酸，為基因的ORF區(qū)表達(dá)產(chǎn)物。
[0021]實(shí)施例2
根據(jù)實(shí)施例1所獲得的美國(guó)白蛾天蠶素A蛋白序列，體外合成美國(guó)白蛾天蠶素A抗菌肽的多肽序列(N端一C端):RWKIFKKIERVGQNVRDGIIKAGPAIQVLGTAKALGK，主要具體過(guò)程如下:
首先將一個(gè)氨基被封閉基團(tuán)保護(hù)的氨基酸共價(jià)連接在固相載體上。在三氟乙酸的作用下，脫掉氨基的保護(hù)基，這樣第一個(gè)氨基酸就接到了固相載體上了。然后氨基被封閉的第二個(gè)氨基酸的羧基通過(guò)N, N ' - 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC, Dicyclohexylcarbodiimide)活化，羧基被DCC活化的第二個(gè)氨基酸再與已接在固相載體的第一個(gè)氨基酸的氨基反應(yīng)形成肽鍵，這樣在固相載體上就生成了一個(gè)帶有保護(hù)基的二肽。
[0022]重復(fù)上述肽鍵形成反應(yīng)，使肽鏈從C端向N端生長(zhǎng)，直至達(dá)到所需要的肽鏈長(zhǎng)度。最后脫去保護(hù)基X，用HF水解肽鏈和固相載體之間的酯鍵，就得到了合成好的肽，并且C末端酰胺化，以每管I毫克分裝。純度用HPLC分析高達(dá)95%以上。
[0023]利用0.9%NaCl 溶液倍比稀釋分別配成 lmg/mL,0.5mg/mL,0.25mg/mL,0.125mg/mL, 0.0625mg/mL, 0.03125mg/mL, 0.01563mg/mL, 0.00781mg/mL 濃度的美國(guó)白蛾天香素 A 抗菌肽溶液。
[0024]I)抗大腸桿菌疋co7iK12D31活性鑒定
檢測(cè)采用瓊脂糖孔穴擴(kuò)散法測(cè)定合成美國(guó)白蛾天蠶素A抗菌肽對(duì)大腸桿菌E.co7iK12D31的抗菌活性。接種K12D31于液體LB培養(yǎng)基，37°C 200rpm培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，按1%菌量加至融化的LB瓊脂糖培養(yǎng)基中(35-50°C )，混勻后按1mL/皿鋪于無(wú)菌一次性平皿。凝固后，在無(wú)菌條件下打孔，加入待測(cè)的樣品后置于37°C培養(yǎng)箱8小時(shí)，觀察抑菌活性，結(jié)果見(jiàn)圖1，具有很強(qiáng)的抗菌活性。
[0025]2)抗農(nóng)桿菌活性鑒定
采用瓊脂糖孔穴擴(kuò)散法測(cè)定合成抗菌肽美國(guó)白蛾天蠶素A對(duì)農(nóng)桿菌Agrobac teriumEM 1 5的抗菌活性。接種EHA105于液體LB培養(yǎng)基，28°C 200rpm培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，按1%菌量加至融化的LB瓊脂糖培養(yǎng)基中(35-50°C )，混勻后按1mL/皿鋪于無(wú)菌一次性平皿。凝固后，在無(wú)菌條件下打孔，加入待測(cè)的樣品后置于28°C培養(yǎng)箱16小時(shí)，觀察抑菌活性，結(jié)果見(jiàn)圖2，具有很強(qiáng)的抗菌活性。
【權(quán)利要求】
1.一種美國(guó)白蛾天蠶素A基因，其DNA序列如SEQ ID N0.1所示。
2.權(quán)利要求1所述的美國(guó)白蛾天蠶素A基因的表達(dá)蛋白，其氨基酸序列如SEQID N0.2所示。
3.權(quán)利要求1所述的美國(guó)白蛾天蠶素A基因在抗細(xì)菌活性中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所述的美國(guó)白蛾天蠶素A基因的表達(dá)蛋白在抗細(xì)菌活性中的應(yīng)用。
5.一種美國(guó)白蛾天蠶素A抗菌肽，其特征在于:所述的美國(guó)白蛾天蠶素A抗菌肽的多肽序列為美國(guó)白蛾天蠶素A基因的表達(dá)蛋白序列的一部分，具體序列為:RffKIFKKIERVGQNVRDGIIKAGPAIQVLGTAKALGKo
6.權(quán)利要求5所述的美國(guó)白蛾抗菌肽-天蠶素A在抗細(xì)菌活性中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/12GK104357452SQ201410616987
【公開(kāi)日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月6日
【發(fā)明者】諸葛強(qiáng), 張嘉鑫, 武小龍, 王曉立, 潘惠新, 尹佟明 申請(qǐng)人:南京林業(yè)大學(xué)