一種牛貝諾孢子蟲(chóng)病巢式pcr檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】一種牛貝諾孢子蟲(chóng)病巢式PCR檢測(cè)方法，涉及一種分子生物學(xué)檢測(cè)方法，該方法以樣品DNA為模板，利用蟲(chóng)體的核糖體ITS序列引物B1/B2進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，再以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，通過(guò)設(shè)計(jì)的一對(duì)鑒別貝諾孢子蟲(chóng)的特異性引物B3/B4，進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，如果出現(xiàn)393bp的特異性條帶，則確定所檢測(cè)的病原為貝諾孢子蟲(chóng)。本發(fā)明的貝病的巢式PCR檢測(cè)方法，對(duì)蟲(chóng)體基因組DNA的檢測(cè)靈敏度為24.3ag/μL，并且能克服染色鏡檢和常規(guī)PCR等方法的缺點(diǎn)，提供了一種快速、特異、靈敏的貝病的早期診斷的分子生物學(xué)方法，對(duì)該病的早期檢測(cè)和有效地預(yù)防具有重要的意義。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種牛貝諾孢子蟲(chóng)病巢式檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種分子生物學(xué)檢測(cè)方法，特別是涉及一種牛貝諾孢子蟲(chóng)病巢式？(?檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002]牛貝諾孢子蟲(chóng)病(86811011:10818)是由貝氏貝諾孢子蟲(chóng)切6812011:13 1)6811011:1)寄生于牛眼、皮膚和生殖系統(tǒng)等部位引起的一種原蟲(chóng)病。其包囊寄生于草食動(dòng)物的皮下、結(jié)締組織、漿膜和呼吸道黏膜等處；主要侵害的部位是眼、皮膚和生殖系統(tǒng)，能引起母牛流產(chǎn)、產(chǎn)奶量下降、公牛精液質(zhì)量下降，嚴(yán)重時(shí)引起死亡，對(duì)養(yǎng)牛業(yè)危害很大。給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]牛貝諾孢子蟲(chóng)病分布廣泛，最初牛貝諾孢子蟲(chóng)的病例報(bào)道常見(jiàn)于南非，以色列等國(guó)家，近些年已經(jīng)蔓延到歐洲、北美洲、非洲、大洋洲、東亞和中東等地區(qū)，并有進(jìn)一步擴(kuò)散的趨勢(shì)。其中歐盟的葡萄牙、西班牙、法國(guó)、德國(guó)和意大利等國(guó)家牛貝諾孢子蟲(chóng)的流行區(qū)域的范圍和流行率不斷增加，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，2010年歐盟食品安全委員會(huì)⑶?“)將牛貝諾孢子蟲(chóng)病列為重要的新興疾病，人們逐漸對(duì)牛貝諾孢子蟲(chóng)病重視起來(lái)。在我國(guó)，主要發(fā)生在北京、內(nèi)蒙古自治區(qū)、吉林省和黑龍江省，在黑龍江省呈地方性流行，主要分布在西部地區(qū)。因此，研究該病的檢測(cè)方法，對(duì)該病的早期快速確診和及時(shí)預(yù)防具有十分重要的意義。
[0004]目前，牛貝諾孢子蟲(chóng)病的診斷主要有病原學(xué)檢查、血清學(xué)檢查和分子生物學(xué)診斷。病原學(xué)診斷方法是通過(guò)觀察包囊內(nèi)的緩殖子以及血液中的速殖子形態(tài)結(jié)合臨床癥狀進(jìn)行診斷；血清學(xué)方法主要有間接免疫熒光試驗(yàn)(正八)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))和免疫印跡(1606111 8100等方法，但這些方法應(yīng)用的抗原都是貝諾孢子蟲(chóng)的蟲(chóng)體抗原，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。牛貝諾孢子蟲(chóng)病分子診斷方法主要是方法，該方法是一種普通的方法，敏感性較低，當(dāng)感染初期，血液中的速殖子較少時(shí)容易引起漏檢。巢式？(?方法不但提高了
反應(yīng)的特異性，同時(shí)也提高了反應(yīng)的敏感性，能檢測(cè)較低拷貝數(shù)的模板。在蟲(chóng)體基因組中，核糖體是一個(gè)由不同結(jié)構(gòu)組成的重復(fù)單元，拷貝數(shù)量高，是設(shè)計(jì)引物進(jìn)行？⑶擴(kuò)增的理想?yún)^(qū)域。其中核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(113)的選擇性壓力比較小，其進(jìn)化速率要比轉(zhuǎn)錄區(qū)的快而且能夠區(qū)分不同的物種，同時(shí)具有種內(nèi)的相對(duì)保守性。因此，很多研究方法都是依據(jù)此進(jìn)行設(shè)計(jì)。
[0005]本發(fā)明通過(guò)選取113序列設(shè)計(jì)特異性引物，運(yùn)用巢式方法對(duì)貝諾孢子蟲(chóng)病進(jìn)行檢測(cè)，在國(guó)內(nèi)外尚且沒(méi)有報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種牛貝諾孢子蟲(chóng)病巢式檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法具有敏感性高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，用于貝諾孢子蟲(chóng)病的早期檢測(cè)，對(duì)貝諾孢子蟲(chóng)病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查及防治提供依據(jù)，具有十分重要的意義。
[0007]本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
一種牛貝諾孢子蟲(chóng)病巢式檢測(cè)方法，所述方法包括以下幾個(gè)步驟:
步驟0、基因組0嫩提取:采用普通0嫩提取方法提取貝諾孢子蟲(chóng)0嫩；
步驟第一輪擴(kuò)增:以步驟1)得到的樣品0嫩為模板，采用蟲(chóng)體113序列引物剛1/剛2經(jīng)？⑶擴(kuò)增得到第一輪？⑶產(chǎn)物；腿序列為:5，-！0^1 I'丁八八丁八織^10八八?:001 I'-3，，剛2 序列為:5，-100 100 601 I'八丁 16^ I'八丁 60-3^ ；
步驟3〕、第二輪擴(kuò)增:以第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，設(shè)計(jì)貝諾孢子蟲(chóng)特異性引物83/84經(jīng)？⑶擴(kuò)增得到第二輪？⑶擴(kuò)增產(chǎn)物；剛3序列為:5’八001 001 0^0 101 601八丁-3，，剛4 序列為:5，-100 101 6X6 1X0 八丁丁八丁丁 0?3，；
步驟？⑶擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè):取5叱第二輪？⑶擴(kuò)增產(chǎn)物，加入1叱的6X1021(111181x1打61'，混勻后于1%瓊脂糖凝膠中，￡8濃度為5呢/此，100 V電壓下電泳30 0111,凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照，存在約393如的特異性條帶，則確定所檢測(cè)的病原為貝諾孢子蟲(chóng)。
[0008]所述的一種牛貝諾孢子蟲(chóng)病巢式檢測(cè)方法，所述步驟2) 反應(yīng)體系25叱:10X^1^ 811 打61~ 2.5^1, ^1？ 11x^111-6 (2.5^01 6狀10 2虬，上、下游引物(25^)各
0.5虬，模板0嫩1虬，位I叫(5^/1^1) 0.2虬，加水至25虬。
[0009]所述的一種牛貝諾孢子蟲(chóng)病巢式？⑶檢測(cè)方法，所述步驟2)9(?擴(kuò)增體系:941預(yù)變性5111111，941變性1111111，551退火1-11，721延伸1111111，共35個(gè)循環(huán)，721延伸10111111，41 保存。
[0010]所述的一種牛貝諾孢子蟲(chóng)病巢式檢測(cè)方法，所述步驟3) 反應(yīng)體系25叱:以第一輪？⑶產(chǎn)物1虬為模板，10 X位I叫811打61~ 2.51^，伽1？ 11x^111-6 (2.5^01 6^)2虬，上、下游引物(2511)1)^0.514^^^0^ 1虬，位I'叫(5^/1^1) 0^2虬，加水至25虬。
[0011]所述的一種牛貝諾孢子蟲(chóng)病巢式？⑶檢測(cè)方法，所述步驟3)9(?擴(kuò)增體系:941預(yù)變性 5111111，941 變性 1111111,49.81 退火 1111111，721 延伸 3086。，共 35 個(gè)循環(huán)，721 延伸 10111111，41 保存。
[0012]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與效果是:
1、靈敏度高:本發(fā)明檢測(cè)靈敏度為24.3叫/叱，較常規(guī)？(?的靈敏度提高了 1000倍以上。
[0013]2、特異性強(qiáng):本發(fā)明針對(duì)性的檢測(cè)貝諾孢子蟲(chóng)，能擴(kuò)增出大小為393如的單一的特異性條帶，不受其他蟲(chóng)體0嫩影響，檢測(cè)率高。
[0014]3、實(shí)用性好:本發(fā)明可用于牛貝諾孢子蟲(chóng)病的檢測(cè)，對(duì)該病的早期檢測(cè)和及時(shí)防治提供重要依據(jù)，具有十分重大的意義。
[0015]4、操作簡(jiǎn)單便捷:應(yīng)用本發(fā)明的方法，對(duì)牛貝諾孢子蟲(chóng)血液提取0嫩，擴(kuò)增和常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳后即可判定結(jié)果，一般在6小時(shí)即可完成，易于推廣。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1是貝諾孢子蟲(chóng)常規(guī)特異性檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果；
圖2是貝諾孢子蟲(chóng)巢式特異性檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果；
圖3是貝諾孢子蟲(chóng)常規(guī)？(?靈敏性擴(kuò)增結(jié)果；
圖4是貝諾孢子蟲(chóng)巢式靈敏性擴(kuò)增結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0017]下面結(jié)合附圖所示實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述。
[0018]本發(fā)明方法篩選出的引物及反應(yīng)參數(shù)，擴(kuò)增所用的引物、擴(kuò)增片段大小及參數(shù)為:
第一輪擴(kuò)增采用蟲(chóng)體核糖體轉(zhuǎn)錄區(qū)間隔子(113)序列引物8X1/8吧經(jīng)擴(kuò)增得到第一輪產(chǎn)物:
腿序列為:5，-16^ 0^1 丁I'八八I'八織^10八八?:001 I'-3，，
剛2 序列為:5，-100 100 601 1^1 16^ 1^1 60-3^ ；
擴(kuò)增片段大小:800如
反應(yīng)參數(shù)為:941預(yù)變性5111111，941變性1111111，551退火1111111，721延伸1111111，共35個(gè)循環(huán)，721延伸100111，41保存;
第二輪擴(kuò)增所用引物為剛3/剛4:
83序列為:5，001 001 0^0 101 601 八丁-3，，
84序列為:5，-100 101 6X6 1X0 八 17 八 17 0?3，；
擴(kuò)增片段大小:393如
反應(yīng)參數(shù)為:941 預(yù)變性 5111111，941 變性 1111111,49.81 退火 1111111，721 延伸 3086(3，共35個(gè)循環(huán)，721延伸100111，41保存；
本發(fā)明樣品分析為:第二輪？(?擴(kuò)增片段大小與預(yù)期一致，表明在該樣品中檢測(cè)出牛貝諾孢子蟲(chóng)的113序列，即該牛感染了牛貝諾孢子蟲(chóng)病，反之未感染。
[0019]實(shí)施例:
貝諾孢子蟲(chóng)病的巢式檢測(cè):
1、樣品0嫩提取:
利用0嫩提取試劑盒(”八似卹6611011110 0嫩1(10，提前準(zhǔn)備561，701水浴，具體過(guò)程如下:
1)取患牛血液200叱加入20叱蛋白酶1(溶液，混勻，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。
[0020]2)加入200叱緩沖液⑶，充分顛倒混勻，701放置10分鐘，溶液應(yīng)變清亮，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。
[0021]3)加入200叱無(wú)水乙醇，充分振蕩混勻1秒，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。
[0022]4)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱083中(吸附柱放入收集管中)，12 000印111離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱?:83放入收集管中。
[0023]5)向吸附柱083中加入500叱緩沖液⑶(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇)，12 000 1-13111離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱?:83放入收集管中。
[0024]6)向吸附柱?:83中加入700叱漂洗液？1，12 000印111離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱083放入收集管中。
[0025]7)將吸附柱?:83中加入500虬漂洗液？1，12 000印111離心30秒，倒掉廢液。
[0026]8)將吸附柱083放回收集管中12 000印111離心2分鐘，倒掉廢液。將吸附柱083置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
[0027]9)將吸附柱083轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200叱洗脫緩沖液！'2，室溫放置2-5分鐘，12 000印111離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。-20° 低溫保存?zhèn)溆谩?br> [0028]2、第一輪？⑶擴(kuò)增:
以提取的蟲(chóng)體0嫩為模板，采用蟲(chóng)體113序列引物8X1/8吧進(jìn)行第一輪擴(kuò)增。
[0029]引物序列:腿:5，-16^0^1 I'丁八八丁八織 ^10 八八?:001 I'-3，，剛2:5，-100 100601 I'八丁 16^ I'八丁 60-3 ^ ；
卩⑶反應(yīng)體系 25叱:10 & I'叫 811 打61~ 2.5)4^，伽了？ 11x1:111-6 (2.5^01 6^0)1)
上、下游引物(2511)1)^0.514^^^0^ 11^1, ^ I'叫(51/1^)0.214^^^^2514^
[0030]？⑶擴(kuò)增體系:941預(yù)變性50111，941變性加丨!!，551退火加化，721延伸1111111,共 35 個(gè)循環(huán)，72。。延伸 10111111, 4。。保存；
圖1是貝諾孢子蟲(chóng)常規(guī)？⑶特異性檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，其中1為2000恥的0嫩分子量1成虹，1為貝諾孢子蟲(chóng)病原，2-6依次為弓形蟲(chóng)、新孢子蟲(chóng)。巴貝斯蟲(chóng)、錐蟲(chóng)和無(wú)漿體的參照病原，7為陰性對(duì)照。
[0031]常規(guī)？⑶擴(kuò)增結(jié)果顯示，只有在泳道1貝諾孢子蟲(chóng)病原處有800恥的特異性條帶，泳道2-6和陰性對(duì)照處均無(wú)擴(kuò)增條帶。
[0032]貝諾孢子蟲(chóng)病的巢式特異性試驗(yàn):
3、第二輪擴(kuò)增:以第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，采用貝諾孢子蟲(chóng)特異性引物剛3/
001 001 0^0 101 601
八丁-3’，剛4:5’ -100 101 6X6 1X0 ^11 ^11 0?3’ ；
？邙反應(yīng)體系25虬:以第一輪？邙產(chǎn)物1虬為模板，10X^1^ 811打61~ 2.5虬，伽??？11x^111-6 (2.511111101 )2虬，上、下游引物(25^)各 0.5虬，模板 0嫩 1虬，位I'叫(5^/1^1)
0.2虬，加水至25虬。
[0033]？⑶擴(kuò)增體系:941預(yù)變性50111，941變性加化，49.81退火加化，721延伸3086。，共35個(gè)循環(huán)，721延伸10111111，41保存；
4、擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè):
取5虬第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物，加入1虬的6 X 108(11118 811^61-,混勻后于1%瓊脂糖凝膠(￡8濃度為5 ^/01)中100 V電壓下電泳30 -11,凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照，如果存在約393如的特異性條帶，則確定所檢測(cè)的病原為貝諾孢子蟲(chóng)。
[0034]圖2是巢式特異性檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，其中1為20001^的0嫩分子量1成61~，1為貝諾孢子蟲(chóng)病原，2-6依次為弓形蟲(chóng)、新孢子蟲(chóng)。巴貝斯蟲(chóng)、錐蟲(chóng)和無(wú)漿體的參照病原，7為陰性對(duì)照。
[0035]巢式？⑶擴(kuò)增結(jié)果顯示，只有在泳道1貝諾孢子蟲(chóng)病原處有393恥的特異性條帶，泳道2-6和陰性對(duì)照處均無(wú)擴(kuò)增條帶。
[0036]貝諾孢子蟲(chóng)病的常規(guī)靈敏度試驗(yàn):
將標(biāo)準(zhǔn)濃度為24.3118/此貝諾孢子蟲(chóng)的基因組0嫩10倍倍比稀釋為2.43118/叱，243呢/乩，24.3呢/虬，2.43^/1^1, 243^^/^1, 24.2.43^/虬，2438^/^1 和 24.3^/
叱，共10個(gè)濃度梯度，第11個(gè)泳道是陰性對(duì)照。取各濃度的0嫩1叱作為模板，用引物剛1/8^2進(jìn)行第一次擴(kuò)增。
[0037]圖3是貝諾孢子蟲(chóng)常規(guī)？⑶敏感性檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，其中1為2000恥的0嫩分子量 1為貝諾孢子蟲(chóng)濃度為24.3118/虬病原，2-11依次為2.43^/)^,2431^/1^,24.3^/
虬，2.43呢/虬，2434/虬，24.2.43^/虬，243^/^, 24.3^/^1 和 0.2438^/^1 的參照病原，12為陰性對(duì)照。
[0038]圖3結(jié)果顯示，單獨(dú)使用8X1/8吧引物進(jìn)行第一次？⑶擴(kuò)增，在泳道1-7均能擴(kuò)增出800如的單一條帶，表明病原檢測(cè)的最低濃度為2434/4。
[0039]貝諾孢子蟲(chóng)病的巢式靈敏度試驗(yàn):
同貝諾孢子蟲(chóng)病的常規(guī)靈敏度試驗(yàn)，將常規(guī)測(cè)得的濃度為2.431^/叱的第一輪產(chǎn)物的貝諾孢子蟲(chóng)基因組0嫩假設(shè)為標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)濃度，再進(jìn)行10倍倍比稀釋?zhuān)謩e稀釋為 2434/14^24.34/14^2.434/14^243218/14^24.3^/14^2.43^/14^0.243218/14^
0.0243^8/1^1和0.00243叫/虬，共10個(gè)梯度，第11泳道為陰性對(duì)照。取各濃度的0嫩1虬為模板，用引物83/84進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。
[0040]圖4是貝諾孢子蟲(chóng)巢式敏感性檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，其中1為2000恥的0嫩分子量1成61~，泳道1-16分別是濃度為2.43^/^1, 2434/虬，24.34/虬，2.43^/虬，243叫/虬，24.2.43^/1^1,0.243^/^1,0.0243^/1^，和 0.002438^/^1 的貝諾孢子蟲(chóng)的病原，11泳道為陰性對(duì)照。
[0041]圖4結(jié)果顯示，使用引物83/84進(jìn)行第二輪？(?擴(kuò)增，在泳道1-5均能擴(kuò)增出393如的條帶，表明該次檢測(cè)的病原最低濃度為24.3^/4。與實(shí)施例3的結(jié)果相比，本發(fā)明的巢式檢測(cè)靈敏度是單獨(dú)使用引物8附/8吧進(jìn)行一次擴(kuò)增檢測(cè)靈敏度的1000倍。
[0042]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專(zhuān)利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種牛貝諾孢子蟲(chóng)病巢式PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所述方法包括以下幾個(gè)步驟: 步驟I)、基因組DNA提取:采用普通DNA提取方法提取貝諾孢子蟲(chóng)DNA ； 步驟2)、第一輪PCR擴(kuò)增:以步驟I)得到的樣品DNA為模板，采用蟲(chóng)體ITS序列引物BN1/BN2 經(jīng) PCR 擴(kuò)增得到第一輪 PCR 產(chǎn)物；BN1 序列為:5，_TGA CAT TTA ATA ACA ATC AACCCT Τ-3，，ΒΝ2 序列為:5，-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3，； 步驟3)、第二輪PCR擴(kuò)增:以第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，設(shè)計(jì)貝諾孢子蟲(chóng)特異性引物B3/B4經(jīng)PCR擴(kuò)增得到第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；BN3序列為:5’-CCA CCT CCT CAC TCT GCTAT-3，，BN4 序列為:5，-TCC TCT GTG TTC ATT ATT CC-3，； 步驟4)、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè):取5 PL第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入?μ?的6XLoadingBuffer,混勻后于1%瓊脂糖凝膠中，EB濃度為5 Pg/mL, 100 V電壓下電泳30 min,凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照，存在約393bp的特異性條帶，則確定所檢測(cè)的病原為貝諾孢子蟲(chóng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種牛貝諾孢子蟲(chóng)病巢式PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟 2) PCR 反應(yīng)體系 25 μ 1-.1QXEx Taq Buffer 2.5μ?, dNTP Mixture (2.5mmol each)2PL，上、下游引物(25mM)各 0.5μ?，模板 DNA ?μ?,Βχ Taq (5U/^L) 0.2μ?，加水至 25μ?。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種牛貝諾孢子蟲(chóng)病巢式PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟2)?0?擴(kuò)增體系:941:預(yù)變性5min，94°C變性lmin，55°C退火Imin，72°C延伸Imin,共35個(gè)循環(huán)，72°C延伸10min，4°C保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種牛貝諾孢子蟲(chóng)病巢式PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟3) PCR反應(yīng)體系25μ?:以第一輪PCR產(chǎn)物WL為模板，10 X位Taq Buffer 2.5μ?, dNTPMixture (2.5mmol each) 2μ?，上、下游引物(25mM)各 0.5μ?，模板 DNA ?μ?, Ex Taq (5U/μυ ο.2μ?，加水至 25μ?。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種牛貝諾孢子蟲(chóng)病巢式PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟3)?0?擴(kuò)增體系:941:預(yù)變性5min，94°C變性lmin，49.8°C退火Imin，72°C延伸30sec，共35個(gè)循環(huán)，72°C延伸10min，4°C保存。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK104388550SQ201410605699
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年11月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月3日
【發(fā)明者】常巧呈, 張艷, 羅英花, 王文濤, 岳東梅, 那璐, 孫健, 宋利國(guó), 薛瑞, 王云光, 李莉莉, 王春仁 申請(qǐng)人:黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)