焦磷酸測序法檢測npm1基因突變的引物對及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種焦磷酸測序法檢測NPM1基因突變的引物對及包含所述引物對的試劑盒。通過對NPM1突變基因NPM1-mutA的mRNA設計引物，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄PCR后對產(chǎn)物進行測序分析，本試劑盒可以實現(xiàn)NPM1突變基因NPM1-mutA的快速、準確、高通量的檢測。
【專利說明】焦磷酸測序法檢測NPM1基因突變的引物對及試劑盒

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學領域，具體涉及一種焦磷酸測序法檢測NPMl基因突變的 引物對及試劑盒。

【背景技術】
[0002]核磷蛋白（nucleophosmin，NPM)基因定位于人類染色體5q35,含有12個外顯子， 編碼由294個氨基酸組成的NPM蛋白。NPMl參與核糖體的合成和中心體復制以調(diào)控細胞 增殖和周期進程。NPMl突變僅累及第12號外顯子，目前有超過40種不同的突變亞型，其 中絕大多數(shù)包含了 12號外顯子4個堿基的插入；其中最常見的是NPMl-mutA，占所有突變 的75% -80%，它是在野生型NPMl核苷酸序列上第956-959位上插入1個TCTG4個核苷 酸而形成串聯(lián)重復序列。
[0003]NPMl基因突變常見于AML患者中；近來有報道顯示在骨髓增生異常綜合癥（MDS) 患者中，也存在著NPMl突變。
[0004] 當前國內(nèi)外廣泛使用的分子生物學檢測NPMl基因突變的方法中，熒光原位雜交 技術（FISH)只能進行定性檢測、操作復雜；熒光定量PCR存在著檢測通量的局限性，所以都 還不能真正滿足臨床診斷檢測的需要。傳統(tǒng)的固相生物芯片（Biochip)或基因芯片技術存 在著可重復性差、靈敏度不夠好以及操作繁瑣的突出弱點。
[0005] 焦磷酸測序技術（Pyrosequencing)是新一代DNA序列分析技術，具備同時對大量 樣品進行測序分析的能力，為高通量、低成本、快速、直觀地進行核苷酸分析和臨床檢驗提 供了非常理想的技術操作平臺。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術中存在的技術問題，本發(fā)明提出一種焦磷酸測序法檢測 NPMl基因突變的引物對以及含有所述引物對的試劑盒，具有高靈敏度、高特異性、高準確 度、檢測迅速等優(yōu)點。
[0007] 技術方案：為實現(xiàn)上述技術目的，本發(fā)明提出了一種焦磷酸測序法檢測NPMl突變 基因NPMl-mutA的引物對，所述引物對包括：
[0008] 擴增引物：
[0009]上游引物：5' -GTGAAGAATTGCTTCCGGATGACT-S'，
[0010]下游引物：5' -ACGGTAGGGAAAGTTCTCACTCTG-3'，
[0011] 其中下游引物的5'端進行生物素標記；
[0012] 測序引物：
[0013] 5' -ACTTCCTCCACTGCC-3' 。
[0014] 本發(fā)明進一步提出了一種焦磷酸測序法檢測NPMl突變基因NPMl-mutA的試劑盒， 所述試劑盒包含質(zhì)控品和上述引物對，具體地，所述引物對為：
[0015] 擴增引物為：
[0016]上游引物：5'-GTGAAGAATTGCTTCCGGATGACT-S'，
[0017]下游引物：5'-ACGGTAGGGAAAGTTCTCACTCTG-3'，
[0018] 其中下游引物的5'端進行生物素標記；
[0019]測序引物為：
[0020] 5，-ACTTCCTCCACTGCC-3，。
[0021] 其中，所述質(zhì)控品包括陽性對照品和陰性對照品。具體地，所述的陽性對照品 為陽性對照，具體為含有NPMl-mutA的質(zhì)粒溶液，所述的陰性對照品為陰性對照，其不含 NPMl-mutA的質(zhì)粒溶液。
[0022] 本發(fā)明還提出了上述引物對及包含上述引物對的試劑盒在制備檢測NPMl-mutA 的試劑中的應用。
[0023] 有益效果：與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的焦磷酸測序法檢測NPMl基因突變的試 劑盒能夠?qū)崿F(xiàn)快速、簡便、高效、準確的檢測NPMl突變基因NPMl-mutA，為制備用于檢測 NPMl-mutA的試劑提供了理論基礎。

【具體實施方式】
[0024] 實驗材料：
[0025]弓丨物由invitrogen公司合成；Trizol購自invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成試 劑盒購置于Fermentas公司；多重PCR試劑盒購置于QIAGEN公司；焦磷酸測序試劑購置于 QIAGEN公司。
[0026] -種焦磷酸測序法檢測NPMl突變基因NPMl-mutA的試劑盒，包括質(zhì)控品和如下引 物：
[0027] 擴增引物為：
[0028]上游引物：5'-GTGAAGAATTGCTTCCGGATGACT-S'，
[0029]下游引物：5' -ACGGTAGGGAAAGTTCTCACTCTG-3'，
[0030] 其中下游引物的5'端進行生物素標記；
[0031] 測序引物為：
[0032] 5， -ACTTCCTCCACTGCC-3，。
[0033] 其中，質(zhì)控品（質(zhì)控品DNA)包括陽性對照品和陰性對照品，所述的陽性對照品作 為陽性對照，為含有NPMl-mutA的質(zhì)粒溶液；陰性對照品作為陰性對照，與陽性對照品相 t匕，陰性對照品為不含NPMl-mutA的質(zhì)粒溶液。
[0034] 檢測方法包括如下步驟：
[0035] (一）RNA提?。?br> [0036] 取20個AML或MDS患者的臨床樣本；1?20號患者的臨床樣本分別按照下面的 步驟提取RNA:
[0037] (1)淋巴細胞提?。喝⌒迈r全血2ml加Iml3wt%檸檬酸鈉，混勻后在4°C下 3000r/min離心lOmin，取血球?qū)由蠝\黃色層即為淋巴細胞，得到淋巴細胞液；
[0038] (2)取1個RNase-free的離心管加入⑴中的淋巴細胞液150μ1，然后加Iml Trizol，室溫放置5min，使其充分裂解；
[0039] (3) 12, 000r/min離心 5min，取上清；
[0040] (4)向上清中加入200μ1氯仿，劇振蕩混勻后室溫放置15min;
[0041] (5)4°C12,OOOg下離心 15min;
[0042] (6)吸取上層水相，將水相轉(zhuǎn)移至另一離心管中；
[0043] (7)向水相中加入500μ1異丙醇混勻，室溫放置5?IOmin;
[0044](8)4?12,OOOg下離心IOmin,棄上清，RNA沉于管底；
[0045] (9)向步驟⑶的管中加入Iml75% (v/v)乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀；
[0046] (10) 4°C8,OOOg離心 5min，盡量棄上清；
[0047] (11)室溫晾干或真空干燥5?IOmin;
[0048](12)用 50ulRNase-freedH20 溶解RNA樣品，55 ?6(TC，5 ?IOmin;
[0049] (13)測OD值定量RNA濃度。
[0050] 按照上述步驟，分別獲得1-20號樣本的mRNA。
[0051] (二）多重逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增：
[0052] 按照如下方法對上述的1?20號樣本的mRNA進行多重逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增：
[0053] (l)cDNA第一鏈的合成
[0054] ①取一RNase-free的離心管，置于冰上，建立下列反應體系；
[0055] TotalRNA 5 ~ 10μg/3μ1
[0056] Oligo(dT) 18Primer(0. 5μg/μI) 1μI
[0057] RNase-freedH20 加至 12μI
[0058] 輕輕混勻反應液，用冷凍離心機稍微離心收集管壁上的反應液到管底；
[0059] ②離心管于70°C溫育5分鐘，之后迅速取出置于冰中冷卻，用冷凍離心機稍微離 心收集管壁上的反應液到管底；
[0060] ③將離心管放置于冰上，按順序加入以下反應液；
[0061] 5Xreactionbuffer 4μI
[0062] RNaseInhibitor(20U/μI) IμI
[0063] IOmMdNTPsMix 2μI
[0064] 輕輕混勻反應液，用冷凍離心機稍微離心收集管壁上的反應液到管底；
[0065] ④離心管于37°C溫育5分鐘；
[0066] ⑤加入 1μIRevertAidTMReverseTranscriptase(200U/μ1)，終體積為 20μ1 ;
[0067] ⑥離心管于42°C反應60分鐘；
[0068] ⑦離心管于70°C加熱10分鐘終止反應，之后迅速取出置于冰中冷卻。
[0069] 如此，合成cDNA第一鏈，即模板cDNA(TemplatecDNA)。
[0070] (2)多重PCR
[0071] 采用的是QIAGEN公司的MultiplexPCR試劑盒，體系如下
[0072] Template cDNA或通持:晶DNA 10μ1 2xQIAGEN Multiplex PCR Master Mix 25μ?
[0073] IOXPrimermix 5μI RNasc-l'rccdhb〇 10μΙ
[0074] 終體積為50μ1。
[0075] 其中，2XQIAGENMultiplexPCRMasterMix中含熱啟動TaqDNA酶、MgCljPdNTP Mix; 10XPrimermix為包含上述突變基因引物對的混合物。
[0076] PCR擴增程序：95°C15min;94°C30s，55?90s，72?90s，35 個循環(huán)；72°CIOmin; 4C保溫。
[0077] 通過上述步驟，獲得PCR產(chǎn)物。
[0078](三）焦磷酸測序
[0079] 首先，用微珠固定PCR產(chǎn)物，其主要是將生物素標記的PCR產(chǎn)物固定到鏈霉親和素 包被的瓊脂糖微珠（StreptavidinSepharoseHighPerformance)上，包括如下步驟：
[0080] (1)輕搖包被鏈霉親和素的瓊脂糖微珠，直至獲得均質(zhì)溶液；
[0081] (2)在一個試管中混合鏈霉親和素包被的瓊脂糖微珠總量（2μ1/樣品）與結合緩 沖液（40μ1/樣品），添加超純水至一定體積，該體積與后續(xù)所要添加優(yōu)化好的生物素標記 的PCR產(chǎn)物的體積的總和為80μ 1/孔；
[0082] (3)將⑵中得到的一定體積的溶液添加至24孔PCR孔板中；
[0083] (4)根據(jù)孔板設置，添加5?20μ1優(yōu)化好的生物素標記的PCR產(chǎn)物至PCR孔板的 每個孔槽，使其中每孔所含溶液為80μ1 ;
[0084] (5)使用孔板條蓋密封PCR孔板，確?？撞壑g沒有泄漏；
[0085] (6)使用振蕩混合器（HOOrpm)不斷振蕩PCR孔板至少5?10分鐘。
[0086] 經(jīng)過上述步驟，生物素標記的PCR產(chǎn)物被固定到鏈霉親和素包被的瓊脂糖微珠 上。
[0087] 接著，開始真空工作站準備工作，包括如下步驟：
[0088] (1)準備以下試劑：大約50ml70% (ν/ν)乙醇；大約40ml變性溶液（QIAGEN公 司）；大約50mlIX洗滌緩沖液（QIAGEN公司））；大約50ml超純水；大約70ml超純水；
[0089] (2)打開真空泵：打開真空開關，進行測試試驗，以確定過濾探針是否正常工作； [0090] (3)每次使用真空泵前要用超純水檢測過濾探針的通透性，將事先準備好的裝好 超純水的離心管插在PCR裝置上，將過濾探針降入超純水中，超純水如在20秒內(nèi)被抽空則 表明過濾探針正常，可以使用，反之則需更換過濾探針；
[0091] (4)取下振蕩好的PCR孔板，將樣品放入PCR裝置中，小心降下過濾探針至PCR孔 板中，停留15秒；確保溶液全部被吸走，以捕獲含有固定模板的微珠；
[0092] (5)將真空裝置移至含有70% (v/v)乙醇的第一試劑槽，沖洗過濾探針5秒；
[0093] (6)將真空裝置移至含有變性溶液的第二試劑槽，沖洗過濾探針5秒；
[0094] (7)將真空裝置移至含有洗滌緩沖液的第三試劑槽，沖洗過濾探針10秒；
[0095] (8)抬高真空裝置超過90°垂線5秒，從過濾探針中排液；
[0096] (9)握持真空裝置到Q24孔板上，關閉裝置上的真空開關并懸空停留5秒，讓負壓 散去；
[0097] (10)通過左右輕搖真空裝置，釋放珠子至含3種測序引物的孔板中；
[0098] (11)在真空裝置關閉的情況下將真空裝置轉(zhuǎn)移至含有超純水的第四試劑槽，振蕩 10秒；
[0099] (12)降下探針至另一個含超純水的第五試劑槽中并施加真空，清洗探針，用70ml 超純水沖洗過濾探針；
[0100] (13)抬高真空裝置超過90°垂線5秒，從過濾探針中排液；
[0101] (14)關閉真空裝置上的開關，并將其置于靜止（P)位。
[0102] 如此變完成了真空站的準備工作，接著開始分離DNA單鏈并將樣品釋放到 PyroMarkQ24孔板中，具體地包括如下步驟：
[0103] (1)將PyroMarkQ24孔板放置在預熱的孔板底座上80°C精確加熱2分鐘；
[0104] (2)從孔板底座上取下孔板，使樣本在室溫下至少冷卻5分鐘。
[0105] 經(jīng)過上述步驟，樣品被杯釋放到PyroMarkQ24孔板中。接著準備PyroMarkQ24 試劑，按下述步驟進行：
[0106] (1)打開PyroMarkQ24試劑盒并取出含有酶和底物凍干粉的小瓶，以及含有核苷 酸的試管；
[0107] (2)按照試劑盒說明書用超純水溶解并分裝酶和底物，所有試劑需恢復室溫后再 使用；
[0108] (3)依照電腦程序計算出的體積，向試劑倉內(nèi)加入酶、底物和核苷酸A、T、G、C(試 劑倉最多使用30次，試劑倉在使用前必須是干燥的）。
[0109] 準備好PyroMarkQ24試劑后，在PyroMarkQ24儀器上按下述步驟進行測試：
[0110] (1)打開PyroMarkQ24 軟件，點擊newassay(新測試）一newAQassay(新 AQ測試）一在sequencetoanalyze(待分析序列）中輸入突變點序列，點擊Generate DispensationOrder(產(chǎn)生分配順序），點擊保存；
[0111] (2)點擊newrun(新運行）一Instrumentmethod(儀器方法）一007,然后點擊 要測序的格子，點擊保存至U盤；
[0112] (3)將含有運行文件的U盤插入儀器前面的USB端口中；
[0113] (4)把加熱好的孔板放到儀器上；
[0114] (5)將試劑倉（酶、底物和核苷酸）的標簽面面向自己放入儀器，打開孔板支座架 放入孔板，關閉孔板支座架和儀器蓋；
[0115] (6)選擇Run(運行），并按OK;
[0116] (7)在進入Run(運行）后，按select(選擇）選擇要運行的文件；
[0117] (8)儀器運行結束并確認運行文件已保存至U盤后，按close，取出U盤；
[0118] (9)打開儀器，取出試劑倉，并對其進行反復清洗，廢棄孔板；
[0119] (10)當儀器不運行時，從主菜單選擇shutdown(關機）并按OK;
[0120] (11)當Itisnowsafetoturnofftheinstrument(現(xiàn)在可以安全關機）出 現(xiàn)時，即可關閉儀器，電源開關位于儀器后面。
[0121] (四）結果分析：
[0122] 打開PyromarkQ24軟件，分析NPMl-mutA融合基因的類型，分析結果如下表：
[0123]

【權利要求】
1. 一種焦磷酸測序法檢測NPM1突變基因 NPMl-mutA的引物對，其特征在于，所述引物 對包括： 擴增引物： 上游引物：5' -GTGAAGAATTGCTTCCGGATGACT-3'， 下游引物：5' -ACGGTAGGGAAAGITCTCACTCTG-3 '， 其中下游引物的5'端進行生物素標記； 測序引物： 5，-ACTTCCTCCACTGCC-3，。
2. -種焦磷酸測序法檢測NPM1突變基因 NPMl-mutA的試劑盒，其特征在于，所述試劑 盒包含如下所述的引物對： 擴增引物為： 上游引物：5' -GTGAAGAATTGCTTCCGGATGACT-3'， 下游引物：5' -ACGGTAGGGAAAGITCTCACTCTG-3 '， 其中下游引物的5'端進行生物素標記； 測序引物為： 5， -ACTTCCTCCACTGCC-3，。
3. 根據(jù)權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括質(zhì)控品，所述質(zhì)控品 包括陽性對照品和陰性對照品。
4. 根據(jù)權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述的陽性對照品為含有NPMl-mutA的 質(zhì)粒溶液，所述的陰性對照品為不含NPMl-mutA的質(zhì)粒溶液。
5. 權利要求1所述的引物對在制備檢測NPM1突變基因 NPMl-mutA的試劑中的應用。
6. 權利要求2所述的試劑盒在制備檢測NPM1突變基因 NPMl-mutA的試劑中的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK104357557SQ201410579959
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月24日 優(yōu)先權日:2014年10月24日
【發(fā)明者】邵棠, 陳慶, 李玲 申請人:南京百捷生物科技有限公司