與凡納濱對蝦Rab7具有結合活性的VP28蛋白片段的高效表達與應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及與凡納濱對蝦蛋白分子Rab7結合的對蝦白斑綜合征病毒VP28羧基端84個氨基酸，對蝦白斑綜合征病毒VP28羧基端84個氨基酸的高效表達及在抗WSSV感染中的應用。本發(fā)明利用全基因合成技術,在不改變氨基酸序列的情況下,將編碼VP28羧基端(VP28C)氨基酸的密碼子改為大腸桿菌偏性密碼子,將其構建入原核表達載體pBAD/gIIIA中，組成高效表達重組質粒pBAD/gIIIA-VP28C,然后轉化大腸桿菌，經阿拉伯糖誘導，VP28C表達量占菌體總蛋白的40％以上,大大高于文獻報道的表達水平,為大規(guī)模生產VP28C用于對蝦白斑綜合征病毒防治,減低生產成本提供基礎。本發(fā)明還涉及VP28C在防治對蝦白斑病中的應用。
【專利說明】與凡納濱對蝦Rab7具有結合活性的VP28蛋白片段的高效 表達與應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因生物工程【技術領域】，具體涉及一種與凡納濱對蝦Rab7具有結合 活性的VP28蛋白片段，該蛋白片段的高效表達方法以及該VP28蛋白片段在防治對蝦白斑 病中的應用。

【背景技術】
[0002] 對蝦白斑桿狀病毒（WSSV)是近年來危害我國及亞洲太平洋地區(qū)人工養(yǎng)殖對蝦的 主要病毒原之一，它能高致死率地侵染絕大多數(shù)種類的對蝦，此外還可侵染淡水及海洋生 態(tài)系統(tǒng)中多種蟹類、龍蝦類、端足類、水蠅類等甲殼綱動物，具有較廣泛的宿主范圍，給水產 養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經濟損失。因此針對對蝦白斑綜合征病毒的藥物開發(fā)受到廣泛關注。
[0003] 對蝦為無脊椎動物，不具備特異性免疫系統(tǒng)，但近年的研究表明，對蝦存在類免疫 (quasi-immune)應答機制，WSSV的重組蛋白可以誘導對奸產生抗病保護效應（Johnson, K. N., van Hulten, M. C. , Barnes, A. C. , 2008. "Vaccination" of shrimp against viral pathogens:phenomenology and underlying mechanisms.Vaccine 26, 4885 - 4892.； Litman, G. W. , Dishaw, L. J. , Cannon, J. P. , Haire, R. N. , Rastj J. P. , 2007. Alternative adaptive immunity in invertebrate. Current Opinion in Immunology 19, 526 - 534)〇 目前有關對蝦白斑綜合癥病毒亞單位疫苗的研究大多圍繞誘導產生高效免疫應答能 力的囊膜蛋白進行免疫接種方式來展開。VP28是WSSV的一個重要的囊膜蛋白，WSSV 的致病性與其密切相關（van Hulten，M. C.，Wstenberg，M.，and Goodal 1，S. D. 2002. Identification of two major virion protein genes of white spot syndrome virus of shrimp. Virology，266(2) :227-236)。VP28 參與 WSSV 的黏附與入侵過程（Yi，G.，et al. VP28of white spot syndrome virus is involved in the attachment and penetration into shrimp cells[J]. J. Biochem. Mol. Biol，2004, 37:726-734 ;陳文博， 譚珍一，劉慶慧，侯林，黃使.對蝦白斑綜合癥病毒VP28基因的表達及其與血細胞的 結合.漁業(yè)科學進展.2009(4) :44-49)，進一步研究表明，VP28與對蝦分子Rab7有互作 (Sritunyalucksana, K. , et al. PmRab7Is a VP28_Binding Protein Involved in White Spot Syndrome Virus Infection in Shrimp. Journal of Virology. 2006. 10734-10742), 但Rab7與VP28作用的關鍵區(qū)段并不清楚。Witteveldt等在原核系統(tǒng)中將VP28蛋白表 達，并利用該蛋白對對奸進行免疫，取得了較好的免疫效果（Witteveldt J，Cifuentes C C,Vlak J M, et al. Protection of Penaeus monodon against white spot syndrome virus by oral vaccination. Journal of Virology，2004, 78 (4): 2057-2061)。進一步的 試驗表明在通過肌肉注射或者給對蝦投喂混有VP28的飼料后，對蝦感染WSSV后的存活 率明顯上升（Jha R.K.，Xu Z.R.，Bai S.J.，Sun J.Y.，Li W.F.，Shen J. 2007. Protection of Procambarus clarkii against white spot syndrome virus using recombinant oral vaccine expressed in Pichia pastoris. Fish&shellfish immunology, 22:295-307 ； Satoh J. , Nishizawa T.Yoshimizu M. 2008.Protection against white spot syndrome virus (WSSV) infection in kuruma shrimp orally vaccinated with WSSV rVP26and rVP28. Diseases of Aquatic Organisms, 82:89-96 ;Caipang C. M. A. , Verjan N. , Ooi E. L. , Kondo H. , Hirono I. , Aoki T. , Kiyono H. , Yuki Y. Enhanced survival of shrimp, Penaeus (Marsupenaeus)japonicus from white spot syndrome disease after oral administration of recombinant VP28expressed in Brevibacillus brevis. Fish&Shellfish Immunology. 2008,25,315-320)。但目前采用原核表達技術重組表達 VP28時，目的蛋白VP28僅占包含體總蛋白的10%以下（陳文博，譚珍一，劉慶慧，侯 林，黃佳.對蝦白斑綜合征病毒vp28基因的表達及其與血細胞的結合.漁業(yè)科學進 展.2009, 30(4) :44-49)，由于目標蛋白的表達量低，生產成本高，限制了 VP28在防治對蝦 白斑綜合征病毒病中的應用。本發(fā)明生產的基因工程蛋白優(yōu)點在于，重組蛋白表達量高， 使生產成本大大降低，且VP28C對凡納濱對蝦抗WSSV感染保護效果好。


【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種配體多肽，是與凡納濱對蝦蛋白分子Rab7結合的對蝦 白斑綜合征病毒VP28多肽，其特征是含VP28羧基端84個氨基酸，命名為VP28C。
[0005] 本發(fā)明的再一目的是提供一種對蝦白斑綜合征病毒VP28羧基端84個氨基酸的高 效表達方法，即在不改變氨基酸序列的情況下，將編碼VP28的基因密碼子改為大腸桿菌偏 性密碼子，從而彌補現(xiàn)有技術的不足。
[0006] 本發(fā)明首先提供一種與凡納濱對蝦蛋白分子Rab7具有結合作用的，編碼對蝦白 斑綜合征病毒VP28羧基端84個氨基酸的核苷酸片段，其序列為SEQ ID NO: 1 ;
[0007] 本發(fā)明還提供一種提高對蝦白斑綜合征病毒VP28羧基端84個氨基酸表達量的核 苷酸片段，其序列為SEQ ID NO:2 ;
[0008] 本發(fā)明還提供一種重組表達質粒，是將上述的核苷酸片段插入到原核表達載體中 構建的；
[0009] 所述的原核表達載體優(yōu)選為pBAD/gIIIA ;
[0010] 本發(fā)明還提供一種重組表達菌株，為攜帶有上述原核表達載體的大腸桿菌。
[0011] 本發(fā)明還提供一種表達對蝦白斑綜合征病毒VP28羧基端84個氨基酸的方法，是 用上述的重組表達菌株進行發(fā)酵來生產對蝦白斑綜合征病毒VP28蛋白。
[0012] 本發(fā)明的另一個目的是提供重組蛋白VP28羧基端84個氨基酸在對蝦抗WSSV感 染中的應用技術。本發(fā)明生產的VP28羧基端84個氨基酸可通過注射、浸泡、口服等方式給 藥，較佳通過對甲殼類口服或浸泡給藥。
[0013] 本發(fā)明人工合成對于核苷酸序列為SEQ ID NO: 1的對蝦白斑綜合征病毒VP28蛋 白的密碼子進行優(yōu)化的序列SEQ ID No: 2,將其分別插入原核表達載體pBAD/gIIIA多克隆 位點中，構建成高效重組表達質粒pBAD/gIIIA-VP28C，然后轉化大腸桿菌ToplO，獲得陽性 重組體。該重組體經培養(yǎng)及L-阿拉伯糖誘導表達，VP28C的表達量占菌體蛋白總量的40% 以上，明顯高于相關文獻報道的重組VP28蛋白表達的水平，為大規(guī)模發(fā)酵生產降低生產成 本提供可能。將表達的重組Rab7蛋白進行SDS-PAGE電泳并轉引印于PVDF膜上，與標記的 VP28C作用，可見明顯的結合活性，采用重組蛋白VP28C可提高凡納濱對蝦抗白斑綜合征病 毒感染。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖I :vp28C的瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0015] 其中：Lane M :DL2, 000DNA Marker ;Lane 1，2: PCR 產物；
[0016] 圖2 :重組質粒的雙酶切核酸電泳圖，
[0017] 其中：Lane M : X-Hind III digest ;Lane 1:重組質粒雙酶切?
[0018] 圖 3 :SDS-PAGE 和 Western-bloting 分析重組 VP28C ;
[0019] 其中：Lane 1，蛋白分子質量標準；Lane 2，重組表達的VP28C ;Lane 3，重組表達 的VP28C經SDS-PAGE分離后，轉印于PVDF膜上與anti-His抗體作用顯色帶。
[0020] 圖 4 :SDS-PAGE 分析重組 VP28 ;
[0021] 其中：Lane 1，蛋白分子質量標準；Lane 2，未誘導重組菌VP28 ;Lane 2, 3，L-阿 拉伯糖誘導重組VP28 ;
[0022] 圖5: Rab7蛋白與VP28C結合；
[0023] 其中：Lane I :VP28C與Rab7結合帶（箭頭示Rab7蛋白）；Lane 2:空載體對照。

【具體實施方式】
[0024] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī) 條件如 Sambrook 等，分子克?。簩嶒炇沂謨?New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的實驗條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0025] 實施例1重組體的構建：
[0026] 對于核苷酸序列為SEQ ID NO: 1的對蝦白斑綜合征病毒VP28蛋白（氨基酸序列 為SEQ ID NO: 3)的密碼子進行如下突變，編碼精氨酸的密碼子變?yōu)镃GT，編碼蘇氨酸的密 碼子變?yōu)锳CC，編碼苯丙氨酸的密碼子變?yōu)門TT，編碼賴氨酸的密碼子變?yōu)锳AA，編碼纈氨酸 的密碼子變?yōu)镚TT，編碼天冬酰胺的密碼子變?yōu)锳AT，編碼絲氨酸的密碼子變?yōu)锳GC，編碼賴 氨酸的密碼子變?yōu)锳AA，編碼異亮氨酸的密碼子變?yōu)锳TT，編碼脯氨酸的密碼子變?yōu)镃CG，編 碼丙氨酸的密碼子變?yōu)镚CA，編碼谷氨酸的密碼子變?yōu)镃AA，編碼甘氨酸的密碼子變?yōu)镚GT， 編碼亮氨酸的密碼子變?yōu)镃TG，編碼天冬氨酸的密碼子變?yōu)镚AT，編碼酪氨酸的密碼子變?yōu)?TAT，編碼組氨酸的密碼子變?yōu)镃AT，改造后的核苷酸的序列為SEQ ID No :2。
[0027] 為了便于與載體進行連接，在序列的兩端加上酶切位點NcoI和Xbal。將合成好的 基因片段vp28C用NcoI與XbaI雙酶切，經瓊脂糖凝膠電泳及膠回收純化后的酶切片段連 接至經NcoI與XbaI酶切處理過的pBAD/gIIIA載體上。酶切、連接所用試劑均為Fermentas 公司產品。酶切反應體系如表1所示。
[0028] 表1 :雙酶切體系組成
[0029]

【權利要求】
1. 一種配體多肽，其特征在于，所述的配體多肽為對蝦白斑綜合征病毒VP28蛋白的片 段，其氨基酸序列為SEQ ID N0:3。
2. 編碼權利要求1所述的配體多肽的核苷酸片段，其特征在于，所述的核苷酸片段的 序列為 SEQ ID N0:1。
3. 如權利要求2所述的核苷酸片段，其特征在于，所述的核苷酸片段的序列為SEQ ID N0:2。
4. 一種重組表達質粒，其特征在于，所述的重組表達質粒是將權利要求3所述的核苷 酸片段插入到原核表達載體中構建的。
5. 如權利要求4所述的重組表達質粒，其特征在于，所述的原核表達載體為pBAD/ gIIIA〇
6. -種重組表達菌株，其特征在于，所述的重組表達菌株為攜帶有權利要求4所述的 重組表達質粒的大腸桿菌。
7. -種表達權利要求1所述的配體多肽的方法，其特征在于，所述的方法是用權利要 求6所述的的重組表達菌株進行發(fā)酵生產的。
8. 權利要求1所述的配體多肽在制備對蝦抗WSSV感染制品中的應用。
【文檔編號】C12N1/21GK104356210SQ201410579865
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月24日 優(yōu)先權日:2014年10月24日
【發(fā)明者】宋曉玲, 孫艷, 王秀華, 李玉宏, 黃倢 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所