一種快速鑒別刺柏屬近緣物種的分子方法
【專利摘要】一種快速鑒別刺柏屬近緣物種的分子方法，步驟為：一、對(duì)刺柏屬物種的干燥葉片或種子，進(jìn)行葉片總DNA或種子胚乳DNA的提??；二、對(duì)檢測(cè)合格的DNA樣品，利用核基因Chi1引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序；三、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化；四、對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)；五、測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)一步純化；六、純化產(chǎn)物利用遺傳分析儀進(jìn)行數(shù)據(jù)收集；或?qū)嘶駽hi1擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，用遺傳分析儀進(jìn)行測(cè)序和數(shù)據(jù)收集；七、測(cè)序得到的原始序列峰圖用軟件打開(kāi)，對(duì)測(cè)序質(zhì)量高的個(gè)體讀取堿基數(shù)據(jù)信息；原始序列比對(duì)和校正；鑒定出刺柏屬近緣物種小子圓柏（JM）、方枝圓柏（JS）和西藏圓柏（JT）核基因Chi1的序列；八、分析和比對(duì)序列之間的差異程度，進(jìn)行物種鑒定；具有鑒別快速和準(zhǔn)確的特點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】一種快速鑒別刺柏屬近緣物種的分子方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種快速鑒別刺柏屬近緣物種的分子方法。

【背景技術(shù)】
[0002]物種的快速鑒定和識(shí)別是保護(hù)生物學(xué)和生物多樣性研究的基礎(chǔ)。然而，長(zhǎng)期以來(lái)，人們對(duì)于植物物種的鑒定和識(shí)別主要依賴于物種間明顯的外部形態(tài)特征，如植物的花、果實(shí)、種子、根、莖和葉等。同時(shí)，還依賴于專業(yè)分類人員的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)和指導(dǎo)。然而，在當(dāng)前傳統(tǒng)分類學(xué)專業(yè)人員急劇減少的情況下，基于物種外部形態(tài)特征的分類學(xué)鑒定方法，很難準(zhǔn)確鑒定和識(shí)別物種間外部形態(tài)特征差異較小(尤其是物種間存在中間過(guò)渡形態(tài)性狀的時(shí)候)的近緣植物物種類群。
[0003]近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，尤其是DNA分子測(cè)序技術(shù)的飛速進(jìn)步，DNA分子條形碼(DNA Barcoding)技術(shù)被提出用來(lái)快速鑒定物種。這一方法主要是通過(guò)對(duì)一段標(biāo)準(zhǔn)目的DNA分子序列片段進(jìn)行比對(duì)分析從而對(duì)相關(guān)物種進(jìn)行快速鑒定。作為一種新型的物種鑒定手段，DNA條形碼技術(shù)自提出以來(lái)就被廣泛應(yīng)用到很多近緣類群的物種鑒定方面，如哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類、昆蟲(chóng)和魚(yú)類等。在這些動(dòng)物類群中，線粒體細(xì)胞色素C氧化酶(COI)基因序列有著豐富的和物種特有的變異位點(diǎn)，被認(rèn)為可以作為動(dòng)物物種鑒別的核心DNA分子條形碼標(biāo)記。然而，在植物類群中，由于線粒體基因較慢的進(jìn)化速率，導(dǎo)致很難尋找到含有豐富變異的線粒體基因位點(diǎn)，這嚴(yán)重限制了線粒體基因標(biāo)記在植物類群物種鑒定中的應(yīng)用。鑒于此，國(guó)際生命條形碼聯(lián)盟(CBOL)和中國(guó)植物條形碼研究團(tuán)隊(duì)(China Plant BOLGroup)通過(guò)對(duì)大量植物類群的多個(gè)葉綠體DNA片段的反復(fù)篩選和實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)在被子植物中進(jìn)化速率相對(duì)較快的葉綠體rbcL+matK基因標(biāo)記組合以及核ITS基因片段有著豐富的變異位點(diǎn)，可以用來(lái)作為種子植物的核心DNA條形碼分子標(biāo)記。另外，葉綠體trnH-psbA基因片段可以作為輔助條形碼標(biāo)記，用于植物物種的DNA分子鑒定。
[0004]然而，對(duì)于裸子植物類群來(lái)說(shuō)，由于葉綠體基因較慢的突變速率，加上裸子植物本身較長(zhǎng)的世代周期(從種子發(fā)育到植株個(gè)體成熟到再次產(chǎn)生種子，大約需要15年左右的時(shí)間)和大的有效種群大小(數(shù)量)導(dǎo)致了葉綠體DNA條形碼rbcL+matK+trnH-psbA標(biāo)記組合以及核ITS基因片段無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分裸子植物近緣物種。這尤其表現(xiàn)在近期發(fā)生物種形成歷史的柏科刺柏屬物種上面，導(dǎo)致刺柏屬物種間葉綠體DNA片段以及核ITS基因片段基因位點(diǎn)間的大量共享，使得使用這些標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼分子標(biāo)記組合很難準(zhǔn)確鑒定和識(shí)別刺柏屬近緣物種。本發(fā)明擬找到一段能夠在刺柏屬物種中具有豐富變異位點(diǎn)的核基因引物進(jìn)行區(qū)分和鑒定刺柏屬近緣物種。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種快速鑒別刺柏屬近緣物種的分子方法，柏科刺柏屬物種由于具有大量相同的外部形態(tài)特征和一些中間過(guò)度形態(tài)，一般都為常綠喬木或灌木樹(shù)種；雌雄同株或異株；葉為刺葉或鱗葉，披針形或近條形；雄球花卵圓形或矩圓形，雌球花近圓球形；球果漿果狀，近球形；種鱗合生，肉質(zhì)；種子1-6粒，無(wú)翅，常有樹(shù)脂槽，這導(dǎo)致了運(yùn)用傳統(tǒng)的形態(tài)分類學(xué)鑒定方法很難快速準(zhǔn)確的鑒別這些物種，同時(shí)，由于刺柏屬物種之間相對(duì)較近的物種形成和分化歷史和大的有效種群數(shù)量，使得利用單親遺傳、進(jìn)化速率較慢的葉綠體DNA分子標(biāo)記很難鑒別這些物種。研究發(fā)現(xiàn)，柏科刺柏屬物種在國(guó)際生命條形碼聯(lián)盟和中國(guó)植物條形碼研究團(tuán)隊(duì)推薦使用的核心葉綠體DNArbcL+matK+trnH-psbA條形碼標(biāo)記組合和核ITS基因片段上均存在大量的基因多態(tài)性共享，導(dǎo)致無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分刺柏屬近緣物種。另外，以前的物種分子鑒定研究，大多一個(gè)物種取樣一個(gè)個(gè)體進(jìn)行鑒定，導(dǎo)致一個(gè)物種在不同地方進(jìn)行取樣時(shí)，由于近緣物種間的基因多態(tài)性共享或漸滲，可能使得親緣關(guān)系較近的物種具有相同的基因序列或變異，這給物種的準(zhǔn)確鑒別帶來(lái)了極大困難，因此，本發(fā)明的目的是篩選出一種能夠在刺柏屬多個(gè)近緣物種中取樣多個(gè)個(gè)體，利用具有雙親遺傳特征、而且進(jìn)化速率較快的核基因DNA分子條形碼標(biāo)記，進(jìn)行物種的快速和準(zhǔn)確鑒別的方法；利用具有雙親遺傳特征、而且進(jìn)化速率較快的核基因DNA分子條形碼標(biāo)記，進(jìn)行物種的快速和準(zhǔn)確鑒別。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種快速鑒別刺柏屬近緣物種的分子方法，能夠?qū)Υ贪貙俳壩锓N進(jìn)行快速和準(zhǔn)確鑒別的DNA分子條形碼標(biāo)記，主要是利用一段雙親遺傳的核基因Chil引物對(duì)刺柏屬近緣種不同個(gè)體的DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增和序列測(cè)定，從而進(jìn)行序列比對(duì)分析以及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，進(jìn)一步比較分析序列間的變異以及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上不同物種個(gè)體的聚類情況來(lái)進(jìn)行物種的快速鑒定；具體包括以下步驟:
[0007]—、對(duì)采集的刺柏屬物種的干燥葉片或種子，使用CTAB法進(jìn)行葉片總DNA或種子胚乳DNA的提??；具體程序如下:
[0008]I)取自然干燥的刺柏屬物種的一顆成熟種子，砸開(kāi)外種皮；用蒸餾水侵泡種子10-24小時(shí)，用鑷子分離種子中單倍體的胚乳，保存于4°C的冰箱內(nèi)；
[0009]2)研磨胚乳或粉碎葉片:對(duì)于分離的單倍體胚乳，放入事先預(yù)冷的研缽中，一顆種子的胚乳放到一起，加入適量的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)粉末和液氮，迅速研磨成細(xì)粉末；對(duì)于干燥葉片，直接用電子天平稱取0.02g，然后與不銹鋼珠一同放進(jìn)2.0mL的離心管中，并在離心管中加入適量PVP粉末，一同置于組織研磨器以30Hz頻率打磨粉碎樣品3min，使其盡可能成為粉末；
[0010]3)粉末中加入800 μ L在65 V水浴中預(yù)熱的2 X CTAB溶液和8 μ L的β -巰基乙醇，輕彈讓粉末完全混勻于2 X CTAB溶液中，將離心管置于65°C水浴鍋中水浴45min，期間每隔1min上下顛倒混勻；
[0011]4)取出離心管，待溫度降到室溫，在12000rpm，4°C條件下離心1min ;用剪掉頭的藍(lán)色槍頭吸取上清液置于新的2.0mL離心管中，然后加入800 μ L氯仿-異戊醇溶液，上下顛倒混勻離心管lOmin，以進(jìn)行雜質(zhì)的抽提；
[0012]5)在轉(zhuǎn)速10000rpm、4°C條件下離心1min,轉(zhuǎn)移上層液體到新的2.0mL離心管中，并加入800 μ L氯仿-異戊醇溶液，上下顛倒混勻離心管1min ；
[0013]6)在轉(zhuǎn)速10000rpm，4°C條件下離心lOmin，用移液器吸取上清液(注意盡量不要吸取中間層的液體)置于1.5mL的新離心管中，加入2倍體積的無(wú)水乙醇輕搖混勻，置于_20°C的冰箱中保存90min以上；
[0014]7)取出后在4°C，轉(zhuǎn)速12000rpm下離心lOmin，倒掉上層廢液，再用70%乙醇漂洗沉淀2次，每次2-4min，然后放在超凈工作臺(tái)上自然風(fēng)干；
[0015]8)在離心管中加入60 μ L雙蒸水溶解DNA沉淀，用濃度為I %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和產(chǎn)量，置于4°C的冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫?br> [0016]二、對(duì)檢測(cè)合格的DNA樣品，利用核基因Chil引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序；
[0017]具體PCR 擴(kuò)增體系為 25 μ L:包括 2.5 μ LlO X PCR buffer, 0.5 μ L25mmoI/LMgCl2,5ymol/L 正反向核基因 Chil 引物各 1.2 μ L, 0.5 μ LlOmmol/LdNTP, 0.25 μ L5U/ μ Lr-TagDNA聚合酶，10?50ng的模板DNA，充分混勻后，在普通PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；
[0018]擴(kuò)增程序?yàn)?先在94°C條件下預(yù)變性4分鐘，接著進(jìn)行36個(gè)循環(huán)，包括在94°C條件下變性45秒，55 °C條件下退火45秒，72 °C條件下延伸2分30秒，最后72 °C條件下終延伸10分鐘，擴(kuò)增產(chǎn)物保存在4°C的冰箱內(nèi)，用濃度為I %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的純度和產(chǎn)量；
[0019]三、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化
[0020]使用純化試劑盒CASpure PCR Purificat1n Kit對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化:
[0021]I)在solut1n II中加入4倍體積的無(wú)水乙醇；
[0022]2)從PCR反應(yīng)管中將反應(yīng)產(chǎn)物移至干凈的1.5mL離心管中，加入5倍體積的solut1n I混合均勻，得到混合液；
[0023]3)將混合液轉(zhuǎn)移到一個(gè)已經(jīng)套入2.0mL離心管的吸附柱內(nèi)，室溫放置2min，在轉(zhuǎn)速 1000rpm 時(shí)離心 Imin ；
[0024]4)重復(fù)步驟3) —次；
[0025]5)倒掉2.0mL離心管中的廢液，將吸附柱放入同一個(gè)2.0mL離心管中，于轉(zhuǎn)速1000rpm的條件下空柱離心2min ；
[0026]6)將吸附柱放入一個(gè)干凈的1.5mL離心管中，于37°C時(shí)放置8_12min以確保乙醇完全揮發(fā)干凈；
[0027]7)在吸附柱中吸附膜的中央加入30 μ L滅菌的雙蒸水進(jìn)行洗脫，雙蒸水65°C預(yù)熱，室溫或37°C的水浴靜置Imin以上；
[0028]8)轉(zhuǎn)速1000rpm的條件下離心lmin，此1.5mL離心管中的液體即為回收的DNA片段，用濃度為I %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純化產(chǎn)物的純度和產(chǎn)量，于4°C條件下保存?zhèn)溆茫?br> [0029]四、對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)
[0030]純化后的產(chǎn)物，用與PCR擴(kuò)增時(shí)相同的引物進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，在普通PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行，10 μ L的反應(yīng)體系包括:Big Dye Terminator (ABI) 2.5 μ L，正向或反向核基因Chil引物5pmol，純化后的模板產(chǎn)物25-50ng，測(cè)序反應(yīng)的條件如下:
[0031]首先95°C條件下預(yù)變性8秒，接著進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，包括95°C條件下變性15秒，50°C條件下退火15秒，60°C條件下延伸90秒，最后60°C條件下終延伸90秒，測(cè)序反應(yīng)的產(chǎn)物保存在4 °C的冰箱內(nèi)；
[0032]五、測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物的進(jìn)一步純化
[0033]測(cè)序反應(yīng)的產(chǎn)物按如下步驟進(jìn)行純化:
[0034]I)加入25 μ L的醋酸鈉，避光室溫放置30min，在25°C、轉(zhuǎn)速4000rpm的條件下離心 30min ；
[0035]2)離心結(jié)束后立即倒扣離心,轉(zhuǎn)速不超過(guò)500rpm ;
[0036]3)加入35μ L的75%乙醇，立即在25°C、轉(zhuǎn)速4000rpm的條件下離心15min ；
[0037]4)離心結(jié)束后立即倒扣離心,轉(zhuǎn)速不超過(guò)500rpm ;
[0038]5)加入40μ L的75%乙醇，立即在25°C、轉(zhuǎn)速4000rpm的條件下離心15min ；
[0039]6)離心結(jié)束后立即倒扣離心,轉(zhuǎn)速不超過(guò)500rpm ;
[0040]7) 37°C的烘箱烘干半小時(shí)以上；
[0041]8)取出后加入10 μ L甲酰胺；
[0042]9)變性上機(jī):95°C條件下變性5min，取出后快速放于冰上冷凍1min ；
[0043]10)純化產(chǎn)物保存于4°C的冰箱內(nèi)，待上機(jī)收集數(shù)據(jù)；
[0044]六、純化產(chǎn)物利用ABI 3130x1 Genetic Analyser遺傳分析儀進(jìn)行數(shù)據(jù)收集；或者對(duì)于Chil基因擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，利用ABI 3730x1 Genetic Analyser遺傳分析儀進(jìn)行測(cè)序和數(shù)據(jù)的收集；
[0045]七、測(cè)序得到的原始序列峰圖用Chromas軟件打開(kāi)，并對(duì)測(cè)序質(zhì)量高的個(gè)體讀取堿基數(shù)據(jù)信息；然后利用MEGA ver.6.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)和校正；鑒定出刺柏屬近緣物種小子圓柏(JM)、方枝圓柏(JS)和西藏圓柏(JT)Chil基因的序列:
[0046]小子圓柏#292_1_JM
[0047]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGTTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGACGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTACATAGCGGCTGGGAAGACGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCGAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGACTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGTTTCTACAAGAGGTATTGCGATATATTGGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTTGAAAATCCCCAATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA
[0048]小子圓柏#292_2_JM
[0049]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGTTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGACGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTACATAGCGGCTGGGAAGACGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCGAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGACTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGTTTCTACAAGAGGTATTGCGATATATTGGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTTGAAAATCCCCAATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA
[0050]方枝圓柏#270-l_JS
[0051]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACCACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTACATAGCGGCTGGGAAGGCGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCCAAACCGTCATGCCAC
GACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGAC
CAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACAAGA
GGTATTGCGATATATTAGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGACCCTTTGGTTTTGCCCTA
GAAAATCCCCAATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTT
TGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA
[0052]方枝圓柏#061-4_JS
[0053]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACCACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTAGCCTACATAGCGGCTGGGAAGGCGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCCAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACAAGAGGTATTGCGATATATTAGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGACCCTTTGGTTTTGCCCTAGAAAATCCCCAATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA
[0054]西藏圓柏#183-1_JT
[0055]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAACTACATAGCGGCTGGGAAGGCGATTGGGTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCTCAGTCTCCGAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACAAGAGGTATTGCGATATACTGGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTTGAAAATCCCCCATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA
[0056]西藏圓柏#222-2_JT
[0057]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAACTACATAGCGGCTGGGAAGGCGATTGGGTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCTCAGTCTCCGAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACAAGAGGTATTGCGATATATTGGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGACCCTTTGGTTTTGCCCTAGAAAATCCCCAATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ；
[0058]八、分析和比對(duì)序列之間的差異程度，進(jìn)行刺柏屬小子圓柏(JM)、方枝圓柏(JS)和西藏圓柏(JT)的物種鑒定；
[0059]由序列比對(duì)和分析可以看出，刺柏屬三個(gè)近緣物種在Chil基因序列上存在明顯的遺傳差異，相互之間能夠區(qū)分，方枝圓柏(JS)的兩個(gè)個(gè)體270-1-JS和061-4-JS在核苷酸110bp、290bp和476bp位置處存在著特有的基因變異位點(diǎn)；小子圓柏(JM)的兩個(gè)個(gè)體292-1-JM和292-2-JM在28bp、120bp、189bp和449bp位置處存在著特有的變異位點(diǎn)；而西藏圓柏(JT)的兩個(gè)個(gè)體183-1-JT和222-2-JT在165bp、281bp、197bp和281bp處存在特有的基因變異，這些特有的基因變異位點(diǎn)使得三個(gè)刺柏屬物種之間能夠準(zhǔn)確區(qū)分；
[0060]利用MEGA ver.6.0軟件基于距離法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，由系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系樹(shù)可得知，每個(gè)刺柏屬物種的個(gè)體能夠單獨(dú)聚到一個(gè)獨(dú)立的遺傳分支上，對(duì)應(yīng)于該物種本身，使得這些物種之間能夠準(zhǔn)確區(qū)分。
[0061]所述的2XCTAB溶液為十六烷基三甲基溴化銨溶液，其成分為:10mmol/LTris-HCl PH 8.0, 1.4mol/LNaCl, 20mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉和 2% CTAB。
[0062]所述的氯仿-異戊醇溶液的體積比為24:1。
[0063]所述的無(wú)水乙醇需預(yù)先在_20°C冰箱預(yù)冷2小時(shí)以上。
[0064]所述的雙蒸水的PH大于7.0。
[0065]所述的核基因Chil引物的序列為，正向:GGCGGCGGAGATTACTGTA，反向:TAGAAGACGCGCATTTGAGAA。
[0066]本發(fā)明的有益效果:
[0067]本發(fā)明提供的DNA分子條形碼標(biāo)記Chil基因序列能夠?qū)Υ贪貙俳壩锓N進(jìn)行快速和準(zhǔn)確的鑒別，能夠?yàn)榇贪貙傥锓N的物種分類和分子系統(tǒng)發(fā)育研究鑒定基礎(chǔ)。通過(guò)對(duì)刺柏屬的三個(gè)物種小子圓柏、方枝圓柏和西藏圓柏的個(gè)體，進(jìn)行Chil基因的PCR擴(kuò)增和測(cè)序，并對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)和系統(tǒng)聚類分析，發(fā)現(xiàn)每一個(gè)物種的兩個(gè)個(gè)體能夠單獨(dú)的聚到一個(gè)獨(dú)立的遺傳分支上，并且得到了中度到高度水平的支持率。例如方枝圓柏(JS)的兩個(gè)個(gè)體270-1-JS和061-4-JS聚到一個(gè)遺傳分支上的支持率為99 ;西藏圓柏(JT)的兩個(gè)個(gè)體183-1-JT和222-2-JT聚在一起的支持率為68，而小子圓柏(JM)的兩個(gè)個(gè)體292-1-JM和292-2-JM聚到一起的支持率為100，說(shuō)明使用該核基因Chil基因序列能夠?qū)@些物種進(jìn)行準(zhǔn)確和快速的分類鑒別。
[0068]同時(shí)，本發(fā)明提供的DNA分子條形碼鑒定方法，不僅是對(duì)傳統(tǒng)刺柏屬物種鑒定的強(qiáng)有力補(bǔ)充，而且使該屬植物標(biāo)本鑒定過(guò)程實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化，突破了對(duì)專業(yè)分類人員經(jīng)驗(yàn)的過(guò)度依賴，能夠在較短時(shí)間內(nèi)建立形成易于利用的應(yīng)用系統(tǒng)。這一技術(shù)將極大地促進(jìn)人類監(jiān)測(cè)、了解以及利用柏科刺柏屬物種生物多樣性的能力，在該屬物種的保護(hù)生物學(xué)和生物多樣性研究領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0069]圖1為提取DNA的I %瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖。
[0070]圖2為擴(kuò)增產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖。
[0071]圖3為純化產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖。
[0072]圖4為刺柏屬物種Chi I基因的部分序列峰圖。
[0073]圖5為三個(gè)刺柏屬近緣物種Chil基因序列變異情況圖；其中圖5(a)為Chil基因l-300bp的序列變異情況圖，圖5(b)為Chil基因301-400bp的序列變異圖，圖5 (c)為Chil基因401-500bp的序列變異圖，圖5(d)為Chil基因501-600bp的序列變異圖，05(e) %Chil基因601-679bp的序列變異圖。
[0074]圖6為三個(gè)刺柏屬物種基于Chil基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系圖。
[0075]圖7為五個(gè)刺柏屬近緣物種Chil基因序列變異圖；其中圖7(a)為Chil基因1-1OObp的序列變異圖，圖7(b)為Chil基因101-200bp的序列變異圖，圖7 (c)為Chil基因201-300bp的序列變異圖，圖7⑷為Chil基因301-400bp的序列變異圖，圖7 (e)為Chil基因401-500bp的序列變異圖，圖7(f)為Chil基因501-600bp的序列變異圖，圖7 (g)為Chil基因601-687bp的序列變異圖。
[0076]圖8為五個(gè)刺柏屬物種基于Chil基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系圖。

【具體實(shí)施方式】
[0077]下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0078]實(shí)施例1
[0079]—種快速鑒別刺柏屬近緣物種的分子方法，包括以下步驟:
[0080]一、對(duì)采集的刺柏屬物種的干燥葉片或種子，使用CTAB法進(jìn)行葉片總DNA或種子胚乳DNA的提?。痪唧w程序如下:
[0081]I)取自然干燥的刺柏屬物種的一顆成熟種子，砸開(kāi)外種皮；用蒸餾水侵泡種子10-24小時(shí)，用鑷子分離種子中單倍體的胚乳，保存于4°C的冰箱內(nèi)；
[0082]2)研磨胚乳或粉碎葉片:對(duì)于分離的單倍體胚乳，放入事先預(yù)冷的研缽中，一顆種子的胚乳放到一起，加入適量的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)粉末和液氮，迅速研磨成細(xì)粉末；對(duì)于干燥葉片，直接用電子天平稱取0.02g，然后與不銹鋼珠一同放進(jìn)2.0mL的離心管中，并在離心管中加入適量PVP粉末，一同置于組織研磨器以30Hz頻率打磨粉碎樣品3min，使其盡可能成為粉末；
[0083]3)粉末中加入800 μ L在65 V水浴中預(yù)熱的2 X CTAB溶液和8 μ L的β -巰基乙醇，輕彈讓粉末完全混勻于2XCTAB溶液中，將離心管置于65°C水浴鍋中水浴45min，期間每隔1min上下顛倒混勻；
[0084]4)取出離心管，待溫度降到室溫，在12000rpm，4°C條件下離心1min ;用剪掉頭的藍(lán)色槍頭吸取上清液置于新的2.0mL離心管中,然后加入800 μ L氯仿-異戊醇溶液,輕輕的上下顛倒混勻離心管lOmin，以進(jìn)行雜質(zhì)的抽提；
[0085]5)在轉(zhuǎn)速10000rpm、4°C條件下離心1min,轉(zhuǎn)移上層液體到新的2.0mL離心管中，并加入800 μ L氯仿-異戊醇溶液，上下顛倒混勻離心管1min ；
[0086]6)在轉(zhuǎn)速1000rpm, 4°C條件下離心1min,用移液器吸取上清液(注意盡量不要吸取中間層的液體)置于1.5mL的新離心管中，加入2倍體積的無(wú)水乙醇輕搖混勻，置于_20°C的冰箱中保存90min以上；
[0087]7)取出后在4°C，轉(zhuǎn)速12000rpm下離心lOmin，倒掉上層廢液，再用70%乙醇漂洗沉淀2次，每次2-4min，然后放在超凈工作臺(tái)上自然風(fēng)干；
[0088]8)在離心管中加入60 μ L雙蒸水溶解DNA沉淀，用濃度為I %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和產(chǎn)量(如圖1)，置于4°C的冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫?br> [0089]二、對(duì)檢測(cè)合格的DNA樣品(如圖1所示)，利用核基因Chi I引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，正向:GGCGGCGGAGATTACTGTA，反向:TAGAAGACGCGCATTTGAGAA ;
[0090]具體PCR 擴(kuò)增體系為 25 μ L:包括 2.5 μ LlO X PCR buffer, 0.5 μ L25mmoI/LMgCl2,5ymol/L 正反向核基因 Chil 引物各 1.2 μ L, 0.5 μ LlOmmol/LdNTP, 0.25 μ L5U/ μ Lr-TagDNA聚合酶，10?50ng的模板DNA，充分混勻后，在普通PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；
[0091]擴(kuò)增程序?yàn)?先在94°C條件下預(yù)變性4分鐘，接著進(jìn)行36個(gè)循環(huán)，包括在94°C條件下變性45秒，55 °C條件下退火45秒，72 °C條件下延伸2分30秒，最后72 °C條件下終延伸10分鐘，擴(kuò)增產(chǎn)物保存在4°C的冰箱內(nèi)，用濃度為I %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的純度和產(chǎn)量(如圖2所示)；
[0092]三、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化
[0093]使用純化試劑盒CASpure PCR Purificat1n Kit對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化:
[0094]I)在solut1n II中加入4倍體積的無(wú)水乙醇；
[0095]2)從PCR反應(yīng)管中將反應(yīng)產(chǎn)物移至干凈的1.5mL離心管中，加入5倍體積的solut1n I混合均勻，得到混合液；
[0096]3)將混合液轉(zhuǎn)移到一個(gè)已經(jīng)套入2.0mL離心管的吸附柱內(nèi)，室溫放置2min，在轉(zhuǎn)速 1000rpm 時(shí)離心 Imin ；
[0097]4)重復(fù)步驟3) —次；
[0098]5)倒掉2.0mL離心管中的廢液，將吸附柱放入同一個(gè)2.0mL離心管中，于轉(zhuǎn)速1000rpm的條件下空柱離心2min ；
[0099]6)將吸附柱放入一個(gè)干凈的1.5mL離心管中，于37°C時(shí)放置8_12min以確保乙醇完全揮發(fā)干凈；
[0100]7)在吸附柱中吸附膜的中央加入30 μ L滅菌的雙蒸水進(jìn)行洗脫，雙蒸水65°C預(yù)熱，室溫或37°C的水浴靜置Imin以上；
[0101]8)轉(zhuǎn)速1000rpm的條件下離心lmin，此1.5mL離心管中的液體即為回收的DNA片段，用濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純化產(chǎn)物的純度和產(chǎn)量(如圖3)，于4°C條件下保存?zhèn)溆谩?br> [0102]四、對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)
[0103]純化后的產(chǎn)物，用與PCR擴(kuò)增時(shí)相同的引物進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，在普通PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行，10 μ L的反應(yīng)體系包括:Big Dye Terminator (ABI) 2.5 μ L，正向或反向核基因Chil引物5pmol，純化后的模板產(chǎn)物25-50ng，測(cè)序反應(yīng)的條件如下:
[0104]首先95°C條件下預(yù)變性8秒，接著進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，包括95°C條件下變性15秒，50°C條件下退火15秒，60°C條件下延伸90秒，最后60°C條件下終延伸90秒，測(cè)序反應(yīng)的產(chǎn)物保存在4 °C的冰箱內(nèi)；
[0105]五、測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物的進(jìn)一步純化
[0106]測(cè)序反應(yīng)的產(chǎn)物按如下步驟進(jìn)行純化:
[0107]I)加入25 μ L的醋酸鈉，避光室溫放置30min，在25°C、轉(zhuǎn)速4000rpm的條件下離心 30min ；
[0108]2)離心結(jié)束后立即倒扣離心,轉(zhuǎn)速不超過(guò)500rpm ;
[0109]3)加入35 μ L的75%乙醇,立即在25°C、轉(zhuǎn)速4000rpm的條件下離心15min ;
[0110]4)離心結(jié)束后立即倒扣離心,轉(zhuǎn)速不超過(guò)500rpm ;
[0111]5)加入40 μ L的75%乙醇,立即在25°C、轉(zhuǎn)速4000rpm的條件下離心15min ；
[0112]6)離心結(jié)束后立即倒扣離心,轉(zhuǎn)速不超過(guò)500rpm ;
[0113]7) 37°C的烘箱烘干半小時(shí)以上；
[0114]8)取出后加入1yL甲酰胺；
[0115]9)變性上機(jī):95°C條件下變性5min，取出后快速放于冰上冷凍1min ；
[0116]10)純化產(chǎn)物保存于4°C的冰箱內(nèi)，待上機(jī)收集數(shù)據(jù)；
[0117]六、純化產(chǎn)物利用ABI 3130x1 Genetic Analyser遺傳分析儀進(jìn)行數(shù)據(jù)收集；或者對(duì)于Chil基因擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，利用ABI 3730x1 Genetic Analyser遺傳分析儀進(jìn)行測(cè)序和數(shù)據(jù)的收集；
[0118]七、測(cè)序得到的原始序列峰圖用Chromas軟件打開(kāi)，并對(duì)測(cè)序質(zhì)量高的個(gè)體(如圖4所示，峰圖整齊，沒(méi)有雜峰干擾)讀取堿基數(shù)據(jù)信息；然后利用MEGAver.6.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)和校正；鑒定出刺柏屬近緣物種小子圓柏(JM)、方枝圓柏(JS)和西藏圓柏(JT)Chil基因的序列:
[0119]#292-l_JM(小子圓柏)
[0120]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGTTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGACGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTACATAGCGGCTGGGAAGACGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCGAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGACTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGTTTCTACAAGAGGTATTGCGATATATTGGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTTGAAAATCCCCAATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ；
[0121]#292-2_JM (小子圓柏)
[0122]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGTTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGACGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTACATAGCGGCTGGGAAGACGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCGAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGACTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGTTTCTACAAGAGGTATTGCGATATATTGGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTTGAAAATCCCCAATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ；
[0123]#270-l_JS (方枝圓柏)
[0124]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACCACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTACATAGCGGCTGGGAAGGCGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCCAAACCGTCATGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACAAGAGGTATTGCGATATATTAGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGACCCTTTGGTTTTGCCCTAGAAAATCCCCAATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ；
[0125]#061-4_JS (方枝圓柏)
[0126]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACCACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTAGCCTACATAGCGGCTGGGAAGGCGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCCAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACAAGAGGTATTGCGATATATTAGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGACCCTTTGGTTTTGCCCTAGAAAATCCCCAATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ；
[0127]#183-1_JT (西藏圓柏)
[0128]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAACTACATAGCGGCTGGGAAGGCGATTGGGTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCTCAGTCTCCGAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACAAGAGGTATTGCGATATACTGGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTTGAAAATCCCCCATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ；
[0129]#222_2_JT (西藏圓柏)
[0130]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAACTACATAGCGGCTGGGAAGGCGATTGGGTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCTCAGTCTCCGAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACAAGAGGTATTGCGATATATTGGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGACCCTTTGGTTTTGCCCTAGAAAATCCCCAATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ；
[0131]八、分析和比對(duì)序列之間的差異程度(見(jiàn)圖5)，進(jìn)行刺柏屬小子圓柏(JM)、方枝圓柏(JS)和西藏圓柏(JT)的物種鑒定；
[0132]由序列比對(duì)和分析可以看出，刺柏屬三個(gè)近緣物種在Chil基因序列上存在明顯的遺傳差異，相互之間能夠區(qū)分，例如方枝圓柏(JS)的兩個(gè)個(gè)體270-1-JS和061-4-JS在核苷酸110bp、290bp和476bp位置處存在著特有的基因變異位點(diǎn)；小子圓柏(JM)的兩個(gè)個(gè)體292-1-JM和292-2-JM在28bp、120bp、189bp和449bp位置處存在著特有的變異位點(diǎn)；而西藏圓柏(JT)的兩個(gè)個(gè)體183-1-JT和222-2-JT在165bp、281bp、197bp和281bp處存在特有的基因變異，這些特有的基因變異位點(diǎn)使得三個(gè)刺柏屬物種之間能夠準(zhǔn)確區(qū)分；
[0133]同時(shí)，利用MEGA ver.6.0軟件基于距離法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(Bootstrap值設(shè)置為1000，其他參數(shù)選擇默認(rèn)值)的構(gòu)建，由系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系樹(shù)(見(jiàn)圖6)可以看出，每個(gè)刺柏屬物種的個(gè)體能夠單獨(dú)聚到一個(gè)獨(dú)立的遺傳分支上，對(duì)應(yīng)于該物種本身，使得這些物種之間能夠準(zhǔn)確區(qū)分。
[0134]實(shí)施例2
[0135]應(yīng)用本發(fā)明對(duì)刺柏屬近緣物種進(jìn)行快速的分子鑒定:對(duì)采集的刺柏屬近緣物種祁連圓柏、密枝圓柏、小子圓柏、方枝圓柏和西藏圓柏的葉片或種子，進(jìn)行DNA的提取，并利用本發(fā)明提供的核基因引物Chil進(jìn)行DNA樣本的PCR擴(kuò)增和測(cè)序，比對(duì)和分析所測(cè)序列與本發(fā)明序列之間的差異，并進(jìn)行所有序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建和聚類分析，從而進(jìn)行刺柏屬物種的分子鑒定；
[0136]一種快速鑒別刺柏屬近緣物種的分子方法，包括以下步驟:
[0137]—、提取刺柏屬近緣物種祁連圓柏、密枝圓柏、小子圓柏、方枝圓柏和西藏圓柏不同個(gè)體的DNA ；
[0138]步驟一?步驟六與實(shí)施例一的步驟一?步驟六相同；
[0139]七、測(cè)序得到的原始序列峰圖用Chromas軟件打開(kāi)，并對(duì)測(cè)序質(zhì)量高的個(gè)體讀取堿基數(shù)據(jù)信息；然后利用MEGA ver.6.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)和校正；鑒定出Chil基因的序列:
[0140]小子圓柏#292-l_JM
[0141 ] CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGTTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGACGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTACATAGCGGCTGGGAAGACGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCGAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGACTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGTTTCTACAAGAGGTATTGCGATATATTGGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTTGAAAATCCCCAATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ；
[0142]小子圓柏#292-2_JM
[0143]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGTTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGACGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTACATAGCGGCTGGGAAGACGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCGAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGACTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGTTTCTACAAGAGGTATTGCGATATATTGGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTTGAAAATCCCCAATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ；TTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACCACACTGTGACGTCTCATGAATTTGCATGTGTTTGGT
ATTATGCAGGAACTATAATTACATAGCGGCTGGGAAGGCGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTG
0>00^0>^0>0000^?>^000>0000^00000>000>0>0000^000000>0?0^000000^>000>0^0>00>00?^>^?^?>000>0000^^0?^00000?>000^000>^^00>000^00>00>^000>^^00>^^0^>0?0>GGTATTGCGATATATTGGGGGTGAGCTATGGTCCTMTCTCGACTGCTTTMCCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTAGMMTCCCCMTTCATCCAGACCGTGGTGTGMAGGCCTTMTGTGAGTGTTMTMTGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ;
〔0148〕珣漭畫苗 #190-2IJC
1--10149Uo>>T>TT>oGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGACGTCTCATGAATTTGCATGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTACATAGCGGCTGGGAAGGCGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTG
0>00^0>^0>0000^?>^000>0000^00000>000>0>0000^000000>0?0^000000^>000>0^0>00>0CAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACAAGAGGTATTGCGATATATTGGGGGTGAGCTATGGTCCTMTCTCGACTGCTTTMCCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTAGMMTCCCCMTTCATCCAGACCGTGGTGTGMAGGCCTTMTGTGAGTGTTMTMTGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ;
〔0150〕 珣漭畫苗#013丨1丨^
〔0151Uo>>T>TT>oGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGACGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGMCTATMTTACATAGCGGCTGGGMGGCGATTGGCTTCGACGGGTTGMCGATCCGGATATTGTTG
Gacgtcatgacgggtmatggcagccgtcgggcagcgacagcgctgcgggcagmgtgcggggtacggagtgacga0
CAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACAAGA
GGTATTGCGATATATTGGGGGTGAGCTATGGTCCTMTCTCGACTGCTTTMCCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTA
GMMTCCCCMTTCATCCAGACCGTGGTGTGMAGGCCTTMTGTGAGTGTTMTMTGTTTGTTTGTGTGAGTTT




18TGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ；
[0152]密枝圓柏#013-3_JC
[0153]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGACGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTACATAGCGGCTGGGAAGGCGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCCAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACAAGAGGTATTGCGATATATTGGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTAGAAAATCCCCAATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ；
[0154]密枝圓柏#013-6_JC
[0155]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACCACACTGTGACGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTACATAGCGGCTGGGAAGGCGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCCAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACAAGAGGTATTGCGATATATTGGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTAGAAAATCCCCAATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ；
[0156]祁連圓柏#151-9_JP
[0157]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAACTCTGCTCAGGCCGGAAATCTGATGTTTGTATTGGTTGCTTTTCCACTTTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTGTGCTTGAACTATAATTACATTGCGGCTGGGAAGGCTATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCGAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGTTTCTATAAGAGGTATTGTGATATACTGGGGGTGAGCTATGGCCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTTGAAAATCCGCAATTCATCCAGACCGTGGTGTGAACGGCGTTAATGTGAGTGTCAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ；
[0158]祁連圓柏#06-l_JP
[0159]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAACTCTGCTCAGGCCGGAAATCTGATGTTTGTATTGGTTGCTTTTCCACTTTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTGTGCAGGAACTATAATTACATTGCGGCTGGGAAGGCTATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCGAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGTTTCTACAAGAGGTATTGTGATATACTGGGGGTGAGCTATGGCCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTTGAAAATCCGCTATTCATCCAGACCGTGGTGTGAACGGCGTTGATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ；
[0160]祁連圓柏#06-9-JP
[0161]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAACTCTGCTCAGGCCGGAAATCTGATGTTTGTATTGGTTGCTTTTCCACTTTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTGTGCAGGAACTATAATTACATTGCGGCTGGGAAGGCTATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCGAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGTTTCTACAAGAGGTATTGTGATATACTGGGGGTGAGCTATGGCCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTTGAAAATCCGCTATTCATCCAGACCGTGGTGTGAACGGCGTTGATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ；
[0162]祁連圓柏#06-14_JP
[0163]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAACTCTGCTCAGGCCGGAAATCTGATGTTTGTATTGGTTGCTTTTCCACTTTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTGTGCAGGAACTATAATTACATTGCGGCTGGGAAGGCTATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCGAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGTTTCTACAAGAGGTATTGTGATATACTGGGGGTGAGCTATGGCCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTTGAAAATCCGCTATTCATCCAGACCGTGGTGTGAACGGCGTTGATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ；
[0164]祁連圓柏#dlh-ll_JP
[0165]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAACTCTGCTCAGGCCGGAAATCTGATGTTTGTATTGGTTGCGTTTCCACTTTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTGTGCAGGAACTATAATTACATTGCGGCTGGGAAGGCTATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCGAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGTTTCTACAAGAGGTATTGTGATATATTGGGGGTGAGCTATGGCCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTTGAAAATCCCCAATTCATCCAGACCGTGGTGTGAACGGCGTTGATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ；
[0166]方枝圓柏#270-l_JS
[0167]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACCACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTACATAGCGGCTGGGAAGGCGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCCAAACCGTCATGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACAAGATGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ;
〔0170〕^^aa:#061-4-JS
〔017 Iuo>>T>TT>oGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACCACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTAGCCTACATAGCGGCTGGGAAGGCGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTMGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCCMACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTMATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGMGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACMGAGGTATTGCGATATATTAGGGGTGAGCTATGGTCCTMTCTCGACTGCTTTMCCAGAGACCCTTTGGTTTTGCCCTAGMMTCCCCMTTCATCCAGACCGTGGTGTGMAGGCCTTMTGTGAGTGTTMTMTGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ;
〔0172〕社漭畫a:#061-5-JS
1--10173Uo>>T>TT>oGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACCACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTAGCCTACATAGCGGCTGGGAAGGCGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTMGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCCMACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTMATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGMGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACMGAGGTATTGCGATATATTAGGGGTGAGCTATGGTCCTMTCTCGACTGCTTTMCCAGAGACCCTTTGGTTTTGCCCTAGMMTCCCCMTTCATCCAGACCGTGGTGTGMAGGCCTTMTGTGAGTGTTMTMTGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ;
〔0174〕到S畫苗 #1S-1-JT
1--10175U CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGMCTATMCTACATAGCGGCTGGGMGGCGATTGGGTTCGACGGGTTGMCGATCCGGATATTGTTG
GAOGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGAO




21CN 104263846 A i^sdt16/18 矧
CMTATMTMACGGAGGGCTTGMTGCGGGMAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACMGAGGTATTGCGATATACTGGGGGTGAGCTATGGTCCTMTCTCGACTGCTTTMCCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTTGMMTCCCCCATTCATCCAGACCGTGGTGTGMAGGCCTTMTGTGAGTGTTMTMTGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ;
〔0176U 到■畫苗#222-2丨！1
1--10177Uo>>T>TT>oGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGMCTATMCTACATAGCGGCTGGGMGGCGATTGGGTTCGACGGGTTGMCGATCCGGATATTGTTG
CAATATMTMACGGAGGGCTTGMTGCGGGMAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACAAGAGGTATTGCGATATATTGGGGGTGAGCTATGGTCCTMTCTCGACTGCTTTMCCAGAGACCCTTTGGTTTTGCCCTAGMMTCCCCMTTCATCCAGACCGTGGTGTGMAGGCCTTMTGTGAGTGTTMTMTGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ;
〔0178〕到■畫苗#157-1丨！1
1--10179Uo>>T>TT>oGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACCACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCATGTGTTTGGT
0>00^0>^0>0000^?>^000>0000^00000>000>0>0000^000000>0?0^000000^>000>0^0>00>0CAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACAAGAGGTATTGCGATATACTGGGGGTGAGCTATGGTCCTMTCTCGACTGCTTTMCCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTTGMMTCCCCCATTCATCCAGACCGTGGTGTGMAGGCCTTMTGTGAGTGTTMTMTGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ;
〔0180Ums 畫苗 #157-9IJT
〔0181Uo>>T>TT>oGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACCACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGMCTATMTTACATAGCGGCTGGGMGGCGATTGGCTTCGACGGGTTGMCGATCCGGATATTGTTG
CAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACAAGAGGTATTGCGATATACTGGGGGTGAGCTATGGTCCTMTCTCGACTGCTTTMCCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTTGMMTCCCCCATTCATCCAGACCGTGGTGTGMAGGCCTTMTGTGAGTGTTMTMTGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ;
〔0182〕到■畫苗#303-4丨！1
1--10183Uo>>T>TT>oGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGACGTCTCATGAATTTGCATGTGTTTGGTATTATGCAGGMCTATMTTACATAGCGGCTGGGMGGCGATTGGCTTCGACGGGTTGMCGATCCGGATATTGTTGGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACAAGAGGTATTGCGATATACTGGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAAACAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTTGAAAATCCCCCATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTCTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ；
[0184]西藏圓柏#327-3_JT
[0185]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACCACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTACATAGCGGCTGGGAAGGCGATTGGGTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCTCAGTCTCCCAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACAAGAGGTATTGCGATATACTGGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTTGAAAATCCCCAATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ；
[0186]西藏圓柏#293-l_JT
[0187]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGACGTCTCATGAATTTGCATGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTACATAGCGGCTGGGAAGGCGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCCAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACAAGAGGTATTGCGATATACTGGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTTGAAAATCCCCCATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ；
[0188]八、分析和比對(duì)序列之間的差異程度，進(jìn)行物種鑒定；經(jīng)過(guò)序列比對(duì)和分析發(fā)現(xiàn)，小子圓柏(JM)的三個(gè)個(gè)體292-l-JM、292-2-JM和132-1-JM在28bp、197bp和409bp處存在著三個(gè)特有的基因變異位點(diǎn)，祁連圓柏的5個(gè)個(gè)體151-9-JP、06-l-JP、06-9-JP、06-14-JP和 dlh-11-JP 在 40bp、58bp、65bp、77bp、87bp、157bp、184bp、199bp、475bp、499bp、579bp 和583bp處存在著12個(gè)特有的替代(變異)位點(diǎn)，同時(shí)在45-52bp處存在著一個(gè)特有的插入/缺失位點(diǎn)變異，方枝圓柏的4個(gè)個(gè)體270-l-JS、270-2-JS、061-4-JS和061-5-JS在484bp處存在著一個(gè)特有的變異位點(diǎn)，這些特有的基因變異位點(diǎn)使得刺柏屬近緣物種之間能夠初步區(qū)分和鑒別(見(jiàn)圖7);
[0189]同時(shí),利用分子進(jìn)化軟件MEGA Ver.6.0基于距離法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(Bootstrap值設(shè)置為1000，其他參數(shù)選擇默認(rèn)值)的構(gòu)建，進(jìn)一步進(jìn)行刺柏屬近緣物種的分子鑒定。分析系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(見(jiàn)圖8)可以看出，每個(gè)刺柏屬物種來(lái)自不同居群的個(gè)體(個(gè)體名稱的前兩位或三位字符代表居群號(hào)，中間一個(gè)字符代表居群中的個(gè)體編號(hào)，最后的2個(gè)字母代表物種)能夠單獨(dú)聚到一個(gè)對(duì)應(yīng)于該物種本身的遺傳分支上，使得這些物種之間能夠準(zhǔn)確的區(qū)分和鑒別。例如，祁連圓柏(JP)三個(gè)居群(151、06和dlh)的5個(gè)個(gè)體151-9-JP、06-l-JP、06-9-JP、06-14-JP和dlh-11-JP聚到了一個(gè)大的遺傳分支上，得到了 100的支持率，小子圓柏(JM)兩個(gè)居群(292和132)的三個(gè)個(gè)體292-l-JM、292-2-JM和132-1-JM也聚到了一個(gè)遺傳分支上，支持率高達(dá)99，方枝圓柏(JS)兩個(gè)居群(270和061)的4個(gè)個(gè)體270-1-JS、270-2-JS、061-4-JS和061-5-JS聚在一個(gè)分支上的支持率為96，而密枝圓柏(JC)兩個(gè)居群(190 和 013)的 5 個(gè)個(gè)體 190-l-JC、190-2-JC、013-l-JC、013-3-JC 和 013-6-JC 也聚在了一個(gè)大的遺傳分支上，對(duì)應(yīng)于該物種本身，盡管支持率較低(34),此外,西藏圓柏(JT)6個(gè)不同居群(183、222、157、303、327 和 293)的 7 個(gè)個(gè)體 183-1-JT、222_2-JT、157-1-JT、157-9-JT、303-4-JT、327-3-JT和293-1-JT也處于系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中一個(gè)大的遺傳分支上，對(duì)應(yīng)于該物種本身。這些結(jié)果顯示出核基因Chil序列片段具有高度的物種鑒定能力，能夠成功用于刺柏屬近緣物種的分子鑒定。
【權(quán)利要求】
1.一種快速鑒別刺柏屬近緣物種的分子方法，其特征在于，包括以下步驟: 一、對(duì)采集的刺柏屬物種的干燥葉片或種子，使用CTAB法進(jìn)行葉片總DNA或種子胚乳DNA的提??；具體程序如下: 1)取自然干燥的刺柏屬物種的一顆成熟種子，砸開(kāi)外種皮；用蒸餾水侵泡種子10-24小時(shí)，用鑷子分離種子中單倍體的胚乳，保存于4°C的冰箱內(nèi)； 2)研磨胚乳或粉碎葉片:對(duì)于分離的單倍體胚乳，放入事先預(yù)冷的研缽中，一顆種子的胚乳放到一起，加入適量的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)粉末和液氮，迅速研磨成細(xì)粉末；對(duì)于干燥葉片，直接用電子天平稱取0.02g，然后與不銹鋼珠一同放進(jìn)2.0mL的離心管中，并在離心管中加入適量PVP粉末，一同置于組織研磨器以30Hz頻率打磨粉碎樣品3min，使其盡可能成為粉末； 3)粉末中加入800yL在65°C水浴中預(yù)熱的2XCTAB溶液和8yL的β-巰基乙醇，輕彈讓粉末完全混勻于2 X CTAB溶液中，將離心管置于65°C水浴鍋中水浴45min，期間每隔1min上下顛倒混勻； 4)取出離心管，待溫度降到室溫，在12000rpm，4°C條件下離心1min;用剪掉頭的藍(lán)色槍頭吸取上清液置于新的2.0mL離心管中，然后加入800 μ L氯仿-異戊醇溶液，上下顛倒混勻離心管lOmin，以進(jìn)行雜質(zhì)的抽提； 5)在轉(zhuǎn)速10000rpm、4°C條件下離心1min,轉(zhuǎn)移上層液體到新的2.0mL離心管中，并加ASOOyL氯仿-異戊醇溶液，上下顛倒混勻離心管1min ； 6)在轉(zhuǎn)速10000rpm，4°C條件下離心lOmin，用移液器吸取上清液置于1.5mL的新離心管中，加入2倍體積的無(wú)水乙醇輕搖混勻，置于_20°C的冰箱中保存90min以上； 7)取出后在4°C，轉(zhuǎn)速12000rpm下離心lOmin，倒掉上層廢液，再用70%乙醇漂洗沉淀2次，每次2-4min，然后放在超凈工作臺(tái)上自然風(fēng)干； 8)在離心管中加入60μ L雙蒸水溶解DNA沉淀，用濃度為I %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和產(chǎn)量，置于4°C的冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫? 二、對(duì)檢測(cè)合格的DNA樣品，利用核基因Chil引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序， 具體 PCR 擴(kuò)增體系為 25yL:包括 2.5yL10XPCR buffer,0.5 μ L25mmol/L MgCl2,5ymol/L 正反向核基因 Chil 引物各 1.2 μ L, 0.5 μ LlOmmol/LdNTP, 0.25 μ L5U/ μ Lr-TagDNA聚合酶，10?50ng的模板DNA，充分混勻后，在普通PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)； 擴(kuò)增程序?yàn)?先在94°C條件下預(yù)變性4分鐘，接著進(jìn)行36個(gè)循環(huán)，包括在94°C條件下變性45秒，55 °C條件下退火45秒，72 °C條件下延伸2分30秒，最后72°C條件下終延伸10分鐘，擴(kuò)增產(chǎn)物保存在4°C的冰箱內(nèi)，用濃度為I %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的純度和產(chǎn)量； 三、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化 使用純化試劑盒CASpure PCR Purificat1n Kit對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化: 1)在solut1nII中加入4倍體積的無(wú)水乙醇； 2)從PCR反應(yīng)管中將反應(yīng)產(chǎn)物移至干凈的1.5mL離心管中，加入5倍體積的solut1nI混合均勻，得到混合液； 3)將混合液轉(zhuǎn)移到一個(gè)已經(jīng)套入2.0mL離心管的吸附柱內(nèi)，室溫放置2min，在轉(zhuǎn)速1000rpm 時(shí)離心 Imin ； 4)重復(fù)步驟3)—次； 5)倒掉2.0mL離心管中的廢液，將吸附柱放入同一個(gè)2.0mL離心管中，于轉(zhuǎn)速1000rpm的條件下空柱離心2min ； 6)將吸附柱放入一個(gè)干凈的1.5mL離心管中，于37°C時(shí)放置8-12min以確保乙醇完全揮發(fā)干凈； 7)在吸附柱中吸附膜的中央加入30μ L滅菌的雙蒸水進(jìn)行洗脫，雙蒸水65°C預(yù)熱，室溫或37°C的水浴靜置Imin以上； 8)轉(zhuǎn)速1000rpm的條件下離心Imin,此1.5mL離心管中的液體即為回收的DNA片段，用濃度為I %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純化產(chǎn)物的純度和產(chǎn)量，于4°C條件下保存?zhèn)溆茫? 四、對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序反應(yīng) 純化后的產(chǎn)物，用與PCR擴(kuò)增時(shí)相同的引物進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，在普通PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行，1yL的反應(yīng)體系包括:Big Dye Terminator (ABI) 2.5 μ L，正向或反向核基因Chil引物5pmol,純化后的模板產(chǎn)物25-50ng,測(cè)序反應(yīng)的條件如下: 首先95°C條件下預(yù)變性8秒，接著進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，包括95°C條件下變性15秒，50°C條件下退火15秒，60°C條件下延伸90秒，最后60°C條件下終延伸90秒，測(cè)序反應(yīng)的產(chǎn)物保存在4 °C的冰箱內(nèi)； 五、測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物的進(jìn)一步純化 測(cè)序反應(yīng)的產(chǎn)物按如下步驟進(jìn)行純化: 1)加入25μ L的醋酸鈉，避光室溫放置30min，在25°C、轉(zhuǎn)速4000rpm的條件下離心30min ； 2)離心結(jié)束后立即倒扣離心,轉(zhuǎn)速不超過(guò)500rpm； 3)加入35μL的75%乙醇，立即在25°C、轉(zhuǎn)速4000rpm的條件下離心15min ； 4)離心結(jié)束后立即倒扣離心,轉(zhuǎn)速不超過(guò)500rpm； 5)加入40μ L的75%乙醇，立即在25°C、轉(zhuǎn)速4000rpm的條件下離心15min ； 6)離心結(jié)束后立即倒扣離心,轉(zhuǎn)速不超過(guò)500rpm； 7)37°C的烘箱烘干半小時(shí)以上； 8)取出后加入1yL甲酰胺； 9)變性上機(jī):95°C條件下變性5min，取出后快速放于冰上冷凍1min； 10)純化產(chǎn)物保存于4°C的冰箱內(nèi)，待上機(jī)收集數(shù)據(jù)； 六、純化產(chǎn)物利用遺傳分析儀進(jìn)行數(shù)據(jù)收集；或者對(duì)于Chil基因擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，利用遺傳分析儀進(jìn)行測(cè)序和數(shù)據(jù)的收集； 七、測(cè)序得到的原始序列峰圖用Chromas軟件打開(kāi)，并對(duì)測(cè)序質(zhì)量高的個(gè)體讀取堿基數(shù)據(jù)信息；然后利用MEGA ver.6.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)和校正；鑒定出刺柏屬近緣物種小子圓柏(JM)、方枝圓柏(JS)和西藏圓柏(JT)Chil基因的序列: 小子圓柏#292-l-JM
CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGTTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTT
GATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACG
TTACTACACTGTGACGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGA
ACTATAATTACATAGCGGCTGGGAAGACGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGCe < rNcrc < rcrc < rcccrcrcrccrccrN < rNcrcrcrc < < Crc <rNrcrNrcc < < CrCCrCrN <ΓΝ <ΓΝΓΝ <rcrcc


ovvooovxvvvovxvxvoxvvvxxoxovooxxxxxoxxsxxvxoxxsxvox


Χχνννοοοχ3χοννχοοχν3χοχ3ον33χν333οοονο33οο3νχχνχννο






Sf-TozsVXVVxxoxsxxxxovoxoxoxxxoxxxoxvvxvvxxoxovoxoxvvxxoosvvv


35χοοχο33νον33χν3χχνν3333χννννοχχ333οχχχχοοχχχ3333


3ν3ν33ννχχχ3οχ3νο3χ3χννχ33χοοχνχ3ονοχοοοοοχχνχνχνο33


xxvxoovovvovxoxxxooxxvoooxvoovooxooovooxxvoooxooovv


V§3_V0XX3V_§VVVXVVXVXVV33V§0XS§X§0


3οχ_ον3§3οχ3§ν3ν§ν3§3χ§ον§χνννχο§


V_3x§§yx§§vvv§x3x0v8§v0xvsx3x5


Οχ3χνο3οο3νοννχχχο3χ3χοο3ν33οχνονο3χοοχχοχχνχνοο33χν


Ο3ννοχχοοο3νο3χχ3οοχχνο3νοννοοοχ3οο3ονχν3νχχννχνχονVSVOOXVXXVXSXXXOXOCJVOOXXXVVOXVOXOXOOVOXOXOVOVXOVXXΟ3νν3ο3νχννν3νχνχνοχνννχχοχ3ν33χχχχχοχχοοχχνχοχχοοχνοXXXVVVOSXOXOVVXOOXVOXOXXOVOOXVOOOOSVOCJOSOVXXVXVVOgsrfVi/VXVVxxoxsxxxxovoxoxoxxxoxxxoxvvxvvxxoxovoxoxvvxxoosvvv


35χοοχο33νον33χν3χχνν3333χννννοχχ333οχχχχοοχχχ3333


3ν3ν33ννχχχ3οχ3νο3χ3χννχ33χοοχνχ3ονοχοοοοοχχνχνχνο33


χχνχοονοννονχοχχχοοχχνοοοχνοονοοχοοονοοχχνοοοχοοονν


V§3_V0XX3V_§VVVXVVXVXVV33V§0XS§X§0


3οχ_ον3§3οχ3§ν3ν§ν3§3χ§ον§χνννχο§


V_3x§§yx§§vvv§x3x0v8§v0xvsx3x5


Οχ3χνο3οο3νοννχχχο3χ3χοο3ν33οχνονο3χοοχχοχχνχνοο33χν間9/00P ^ η Xl V 9sco9SSI Νο30X0VV0V300030X3030V3V030V30003X0330V300XVVVX0003V0XV3X03V03V330X03X033VVV033X3X0V3X3003V0XV00X3XX00X3XV03003V0VVXXX03X3X003V330XV0V03X30XX0XXVXV0033XV03VV0XX0003V03XX000XXV0300VV000X30030VXV3VX3VVXVX3VV00V30XVXXVX00XXX0X03V30XXXVV0XV3X3X0VV0X0X3V3VX3VXX03VV303VXVVV3VXVXV3XVVVXX0X3V33XXXXX0XX00XXVX0XX00XV0XXXVVV000X3X0VVX00XV3X0X30V33XV333000V033003VXXVXVV3xr-c-ccc# 鸚祖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ΧΓ-Τ-ε8Τ# 鸚祖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f-^-190# 輯釔
GGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGA
AAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACAAGAGGTATT
GCGATATATTGGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAG
ACCCTTTGGTTTTGCCCTAGAAAATCCCCAATTCATCCAGACCGTGGTGTG
AAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTT
TTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTC
AATA ； 八、分析和比對(duì)序列之間的差異程度，進(jìn)行刺柏屬小子圓柏(JM)、方枝圓柏(JS)和西藏圓柏(JT)的物種鑒定； 由序列比對(duì)和分析可以看出，刺柏屬三個(gè)近緣物種在Chil基因序列上存在明顯的遺傳差異，相互之間能夠區(qū)分，方枝圓柏(JS)的兩個(gè)個(gè)體270-1-JS和061-4-JS在核苷酸110bp、290bp和476bp位置處存在著特有的基因變異位點(diǎn)；小子圓柏(JM)的兩個(gè)個(gè)體292-1-JM和292-2-JM在28bp、120bp、189bp和449bp位置處存在著特有的變異位點(diǎn)；而西藏圓柏(JT)的兩個(gè)個(gè)體183-1-JT和222-2-JT在165bp、281bp、197bp和281bp處存在特有的基因變異，這些特有的基因變異位點(diǎn)使得三個(gè)刺柏屬物種之間能夠準(zhǔn)確區(qū)分； 利用MEGA ver.6.0軟件基于距離法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，由系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系樹(shù)可得知，每個(gè)刺柏屬物種的個(gè)體能夠單獨(dú)聚到一個(gè)獨(dú)立的遺傳分支上，對(duì)應(yīng)于該物種本身，使得這些物種之間能夠準(zhǔn)確區(qū)分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速鑒別刺柏屬近緣物種的分子方法，其特征在于，所述的2XCTAB溶液為十六烷基三甲基溴化銨溶液，其成分為:100mmol/L Tris-HCl PH8.0，1.4mol/LNaCl,20mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉和 2% CTAB。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速鑒別刺柏屬近緣物種的分子方法，其特征在于，所述的氯仿-異戊醇溶液的體積比為24:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速鑒別刺柏屬近緣物種的分子方法，其特征在于，所述的無(wú)水乙醇需預(yù)先在_20°C冰箱預(yù)冷2小時(shí)以上。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速鑒別刺柏屬近緣物種的分子方法，其特征在于，所述的雙蒸水的PH大于7.0。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速鑒別刺柏屬近緣物種的分子方法，其特征在于，所述的核基因Chil引物的序列為，正向:GGCGGCGGAGATTACTGTA，反向:TAGAAGACGCGCATTTGAGAA。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104263846SQ201410577132
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月24日
【發(fā)明者】李忠虎, 房敏峰, 岳明, 劉文哲, 劉占林, 趙鵬, 趙桂仿 申請(qǐng)人:西北大學(xué)