一種提高桑黃液體發(fā)酵產(chǎn)物中金絲桃苷含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高桑黃液體發(fā)酵產(chǎn)物中金絲桃苷含量的方法，包括：(1)制備桑黃液體種子液；(2)制備青頂擬多孔菌種子液；(3)向發(fā)酵培養(yǎng)基中先接入占發(fā)酵培養(yǎng)基體積1％-10％的青頂擬多孔菌液體種子液，在溫度22℃-30℃的條件下培養(yǎng)1天-4天后，將溫度調(diào)為25℃-29℃，接入占發(fā)酵培養(yǎng)基體積5％-20％的桑黃液體種子液，然后繼續(xù)培養(yǎng)2天-5天，終止發(fā)酵后，得到桑黃液體發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明根據(jù)藥用真菌桑黃液體發(fā)酵產(chǎn)物金絲桃苷合成代謝途徑的特點(diǎn)，通過青頂擬多孔菌先利用碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，生成中間產(chǎn)物，然后再加入桑黃液體菌種，通過桑黃的液體發(fā)酵將青頂擬多孔菌產(chǎn)生的中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成所需的代謝終產(chǎn)物，大幅度提高桑黃菌絲體中金絲桃苷含量。
【專利說明】一種提高桑黃液體發(fā)酵產(chǎn)物中金絲桃苷含量的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物發(fā)酵工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種提高桑黃液體發(fā)酵產(chǎn)物中金絲 桃苷含量的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 桑黃（Phellinus igniarius)屬擔(dān)子菌亞門，層孔菌綱，銹革孔菌科，針層孔菌屬。 桑黃菌提取物在抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和防止癌癥手術(shù)后復(fù)發(fā)等的臨床應(yīng)用中具有顯著效果，是 目前國(guó)際公認(rèn)的生物治癌藥劑中有效率最高的一種藥用真菌。
[0003] 由于受生理狀態(tài)的特殊性和復(fù)雜性以及外部環(huán)境的制約，造成桑黃在自然界中形 成子實(shí)體稀少，特別是形成可用子實(shí)體需要多年。而且人工栽培極其困難，培養(yǎng)條件苛刻， 且生長(zhǎng)周期長(zhǎng)達(dá)3-4年，難以滿足日益膨脹的市場(chǎng)需要。采用桑黃液體發(fā)酵的方法生產(chǎn)桑 黃藥用活性成分因?yàn)榫哂猩a(chǎn)周期短、勞動(dòng)力省以及受外部環(huán)境影響小等優(yōu)點(diǎn)被認(rèn)為是一 種有效的方法。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)桑黃菌絲體培養(yǎng)生產(chǎn)活性藥用成分研究和工藝應(yīng)用主要集 中在發(fā)酵條件及產(chǎn)物提取分離等層面上，整體發(fā)酵水平不高。
[0004] 桑黃液體發(fā)酵產(chǎn)物中含有金絲桃苷，金絲桃苷屬黃酮醇苷類化合物，又名槲皮 素-3-〇-β -D-批喃半乳糖苷，廣泛存在于滕黃科、?科、杜醇花科和衛(wèi)矛科等多種植物中， 具有保護(hù)心血管系統(tǒng)、保護(hù)胃黏膜、抗炎等多種生理活性，是一種重要的天然產(chǎn)物（林萍， 易宏偉，張斐.金絲桃苷藥理作用研究進(jìn)展[J]·中國(guó)現(xiàn)代中藥，2012,14(10) :23-25·)。
[0005] 目前，針對(duì)提高桑黃液體發(fā)酵產(chǎn)物中金絲桃苷含量的方法的研究國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào) 道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種提高桑黃液體發(fā)酵產(chǎn)物中金絲桃苷含量 的方法，該方法操作簡(jiǎn)便，易于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0007] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0008] -種提高桑黃液體發(fā)酵產(chǎn)物中金絲桃苷含量的方法，包括步驟：
[0009] (1)桑黃液體種子液的制備：將活化后的桑黃菌種接種于添加馬褂木提取物的液 體種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天-7天，得桑黃液體種子液；
[0010] (2)青頂擬多孔菌種子液的制備：將活化后的青頂擬多孔菌菌種接種于液體種子 培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天-7天，得青頂擬多孔菌液體種子液；
[0011] (3)液體發(fā)酵培養(yǎng)：向發(fā)酵培養(yǎng)基中先接入占發(fā)酵培養(yǎng)基體積1% -10%的青頂擬 多孔菌液體種子液，在溫度22°C -30°C的條件下培養(yǎng)1天-4天后，將溫度調(diào)為25°C _29°C， 接入占發(fā)酵培養(yǎng)基體積5 % -20 %的桑黃液體種子液，然后繼續(xù)培養(yǎng)2天-5天，終止發(fā)酵 后，得到桑黃液體發(fā)酵產(chǎn)物。
[0012] 本發(fā)明根據(jù)藥用真菌桑黃液體發(fā)酵產(chǎn)物金絲桃苷合成代謝途徑的特點(diǎn)，通過青頂 擬多孔菌先利用碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，生成中間產(chǎn)物，然后再加入桑黃液體菌種，通過桑黃的液體 發(fā)酵將青頂擬多孔菌產(chǎn)生的中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成所需的含金絲桃苷的代謝終產(chǎn)物，大幅度提高 桑黃菌絲體中金絲桃苷含量。
[0013] 所述的桑黃菌種可采用任意一種桑黃菌種，可采用市售產(chǎn)品。例如桑黃 (Phellinus linteus)ACCC51181菌種，來源于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心。
[0014] 所述的青頂擬多孔菌（Polyporellus picipes)是一種木腐真菌，可利用自身分泌 的木質(zhì)素降解酶系及獨(dú)特的作用方式降解有機(jī)物。所述的青頂擬多孔菌菌種可采用任意一 種青頂擬多孔菌菌種，可采用市售產(chǎn)品，例如北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院生產(chǎn)的青頂擬 多孔菌菌種。
[0015] 為了達(dá)到更好的發(fā)明效果，進(jìn)行以下優(yōu)選：
[0016] 步驟（1)中，每升液體種子培養(yǎng)基中馬褂木提取物的添加量為lg-10g。
[0017] 所述的馬褂木提取物可以選用市售產(chǎn)品，也可以采用現(xiàn)有方法制備；優(yōu)選以馬褂 木葉為原料制備的馬褂木提取物，進(jìn)一步優(yōu)選由馬褂木葉乙醇提取物和馬褂木葉水提物組 成的馬褂木提取物，可采用以下制備方法制備的馬褂木提取物，包括：稱取一定量的馬褂木 葉，粉碎（優(yōu)選過40目-100目），先加占馬褂木葉重量10倍量-16倍量的質(zhì)量百分濃度為 60% -80%的乙醇水溶液在60°C -80°C浸提lh-2h，過濾后得到上清液，上清液濃縮后真空 冷凍干燥得提取物I ;上述醇提后的馬褂木葉殘?jiān)尤胝捡R褂木葉重量10倍量-20倍量的 水在85°C -95°C下浸提lh-2. 5h，過濾后得到上清液，上清液濃縮至1/4體積后加入濃縮物 體積2倍量-5倍量的無水乙醇，離心收集沉淀物，沉淀物真空冷凍干燥后得提取物II，合并 上述提取物I和提取物II得馬褂木提取物。
[0018] 步驟（1)中，所述的活化后的桑黃菌種在添加馬褂木提取物的液體種子培養(yǎng)基中 培養(yǎng)的溫度為自然環(huán)境溫度，優(yōu)選為20°C -30°C。一般IL添加馬褂木提取物的液體種子培 養(yǎng)基中接入2cm2-5cm2大小的活化后的桑黃菌種菌塊。
[0019] 步驟（2)中，所述的活化后的青頂擬多孔菌菌種在液體種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)的溫度 為自然環(huán)境溫度，優(yōu)選為20°C -30°C。一般IL液體種子培養(yǎng)基中接入2cm2-5cm2大小的活 化后的青頂擬多孔菌菌種菌塊。
[0020] 本發(fā)明中，菌種的活化方法為本領(lǐng)域常規(guī)的菌種活化方法，包括：將斜面保藏 的桑黃菌種或青頂擬多孔菌菌種接種到PDA平板培養(yǎng)基上，進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度 22°C _30°C，培養(yǎng)時(shí)間4天-10天，得到活化后的桑黃菌種或活化后的青頂擬多孔菌菌種。
[0021] 所述的PDA平板培養(yǎng)基和液體種子培養(yǎng)基均采用本領(lǐng)域種子培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基， 可采用市售產(chǎn)品。優(yōu)選，所述的PDA平板培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g和瓊脂15g-20g， 用水定容至l〇〇〇mL。優(yōu)選，所述的液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖5g-20g、酵母粉4g、蛋白胨3g、 KH2PO4Ig 和 MgSO4O. 5g，用水定容至 1000mL。
[0022] 步驟（3)中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：以IL發(fā)酵培養(yǎng)基計(jì)，葡萄糖20g、蛋白 胨 4g、麥麩 5g、谷氨酸 0. 5g-5g、KH2PO4L 5g、MgSO4O. 75g 和余量的水。
[0023] 本發(fā)明，所述的桑黃發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)過后續(xù)的分離處理可以從桑黃菌絲體中提取、測(cè) 定金絲桃苷含量。所述的分離處理為本領(lǐng)域常規(guī)的分離方法，例如包括：可將所述的桑黃 發(fā)酵產(chǎn)物用紗布過濾，從過濾所得菌絲體中提取、測(cè)定金絲桃苷含量。具體的提取步驟包 括：將菌絲體用水沖洗干凈，在55°C _65°C干燥至恒重，按原料克數(shù)與溶劑毫升數(shù)之比為 1:10-30加入質(zhì)量百分濃度70% -80%的乙醇水溶液進(jìn)行回流提取，直至回流液無色為止， 提取物濃縮后得到含金絲桃苷的提取物。
[0024] 本發(fā)明所用的培養(yǎng)基均需滅菌、冷卻后使用，滅菌的條件采用本領(lǐng)域的常規(guī)條件， 例如可在 120°C _125°C下滅菌 20min-30min。
[0025] 馬褂木，拉丁學(xué)名：Liriodendron chinense (Hemsl. ) Sarg. (《Flora of China》）， 又名：鵝掌楸、雙飄樹；為木蘭科鵝掌楸屬落葉大喬木，葉大，形似馬褂，故有馬褂木之稱， 是中國(guó)特有的珍稀植物。高達(dá)40米，胸徑1米以上，小枝灰色或灰褐色。葉形如馬褂，葉片 的頂部平截，猶如馬褂的下擺；葉片的兩側(cè)平滑或略微彎曲，好像馬褂的兩腰；葉片的兩側(cè) 端向外突出，仿佛是馬褂伸出的兩只袖子。
[0026] 本發(fā)明與已有技術(shù)相比有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0027] 1.本發(fā)明根據(jù)藥用真菌桑黃液體發(fā)酵產(chǎn)物金絲桃苷合成代謝途徑的特點(diǎn)，通過青 頂擬多孔菌先利用碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，生成中間產(chǎn)物，然后再加入桑黃液體菌種，將青頂擬多孔 菌產(chǎn)生的中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成所需的終產(chǎn)物，大幅度提高桑黃金絲桃苷含量，可達(dá)到I. 85mg/g， 提取的金絲桃苷可用于食品、醫(yī)藥工業(yè)中。
[0028] 2.本發(fā)明所采用的桑黃菌絲體液體發(fā)酵方法簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，發(fā)酵周期短，效率 高，同時(shí)利用天然產(chǎn)物作為生產(chǎn)原料，環(huán)保無毒，成本低。整個(gè)發(fā)酵過程可控，不受外部環(huán)境 條件限制，非常適合工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用推廣。
[0029] 3.本發(fā)明方法同樣適用于發(fā)酵罐規(guī)模化生產(chǎn)，具有很好的工業(yè)化應(yīng)用前景。

【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面結(jié)合部分具體實(shí)施例對(duì)本
【發(fā)明內(nèi)容】
進(jìn)行進(jìn)一步闡明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不僅 限于下面的實(shí)施例。
[0031] 桑黃（Phellinus linteus)ACCC51181菌種購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中 心。
[0032] 青頂擬多孔菌菌種，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院生產(chǎn)。
[0033] 實(shí)施例1
[0034] 一、材料準(zhǔn)備
[0035] PDA平板培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g和瓊脂15g，用水定容至1000ml，自然 pH，在 121°C 下滅菌 20min。
[0036] 將斜面保藏的桑黃菌種接種到PDA平板培養(yǎng)基上，進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25°C， 培養(yǎng)時(shí)間7天，得到活化后的桑黃菌種菌塊。
[0037] 將斜面保藏的青頂擬多孔菌菌種接種到PDA平板培養(yǎng)基上，進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng) 溫度25°C，培養(yǎng)時(shí)間7天，得到活化后的青頂擬多孔菌菌種菌塊。
[0038] 馬褂木提取物的制備方法，包括：稱取一定量的馬褂木葉，粉碎過100目，先加占 馬褂木葉重量13倍量的質(zhì)量百分濃度為70%的乙醇水溶液在60°C浸提I. 0h，過濾后得到 上清液，上清液濃縮后真空冷凍干燥得提取物I ;上述醇提后的馬褂木葉殘?jiān)尤胝捡R褂 木葉重量10倍量的蒸餾水在85°C下浸提lh，過濾后得到上清液，上清液濃縮至1/4體積后 加入濃縮物體積2倍量的無水乙醇，5000rpm離心IOmin收集沉淀物，沉淀物真空冷凍干燥 后得提取物II，合并上述提取物I和提取物II得馬褂木提取物。
[0039] IL液體種子培養(yǎng)基組成為：葡萄糖10g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、KH2P04lg/L、 MgSO4O. 5g/L和余量的水，pH自然。
[0040] IL發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：葡萄糖20g/L、蛋白胨4g/L、麥麩5g/L、谷氨酸2. 5g/L、 KH2PO4L 5g/L、MgSO4O. 75g/L 和余量的水。
[0041] 二、桑黃液體發(fā)酵產(chǎn)物的制備
[0042] (1)桑黃液體種子液的制備：取2cm2大小活化后的桑黃菌種接種于IL添加馬褂木 提取物的液體種子培養(yǎng)基中，每升液體種子培養(yǎng)基中馬褂木提取物的添加量為8g，25°C培 養(yǎng)4天，得桑黃液體種子液；
[0043] (2)青頂擬多孔菌種子液的制備：取2cm2大小活化后的青頂擬多孔菌菌種接種于 IL液體種子培養(yǎng)基中，25°C培養(yǎng)4天，得青頂擬多孔菌液體種子液；
[0044] (3)液體發(fā)酵培養(yǎng)：向發(fā)酵培養(yǎng)基中先接入占發(fā)酵培養(yǎng)基體積5%的青頂擬多孔 菌液體種子液，在溫度26°C的條件下培養(yǎng)2天后，將溫度調(diào)為28°C，接入占發(fā)酵培養(yǎng)基體積 10%的桑黃液體種子液，然后繼續(xù)培養(yǎng)4天，終止發(fā)酵后，得到桑黃液體發(fā)酵產(chǎn)物。
[0045] 三、測(cè)定
[0046] 1.菌絲生物量的測(cè)定：桑黃液體發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)8層紗布過濾，過濾所得菌絲體用蒸 餾水沖洗3次，然后置60°C烘箱中烘干至恒重，即為樣品，稱重。
[0047] 2.金絲桃苷含量測(cè)定：精密稱取5g樣品，用濾紙包好，放入索氏提取器，IOOmL質(zhì) 量百分濃度70%的乙醇水溶液，回流提取6h，直至回流液無色為止。70°C減壓旋蒸濃縮，得 到含金絲桃苷的提取物，用甲醇定容于25mL容量瓶中，待測(cè)，分析前用0. 45 μ m濾膜濾過。
[0048] 高效液相色譜條件：色譜柱：Nova-Pak C18色譜柱（3. 9mmX 150mm, 5 μ m);柱溫 50°C，進(jìn)樣20 μ L ;流動(dòng)相：A相為質(zhì)量百分濃度0. 4 %的磷酸水溶液，B-乙腈/甲醇（I: 1，體 積比），流速lmL/min ;梯度洗脫：0_15min，B由16%線性改變到23%，15_30min，B由23% 線性改變到36%，至30min停止洗脫，DAD檢測(cè)（360nm)。
[0049] 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密稱取金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品11. Omg置于IOmL容量瓶中，用甲醇超 聲溶解并定容，制成濃度為I. lmg/mL金絲桃苷儲(chǔ)備液。精密吸取上述儲(chǔ)備液0. lmL，置于 IOmL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，制成濃度為11. 0 μ g/mL的金絲桃苷溶液。精密吸取該 濃度溶液適量，逐級(jí)稀釋，配成濃度依次為：〇· 275, 0· 55, L 10, 2. 75, 5. 50 μ g/mL的金絲桃 苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液。按照上述色譜條件，分別將標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液注入液相色譜儀中進(jìn)行測(cè) 定，以保留時(shí)間定性，以試樣峰面積與標(biāo)準(zhǔn)比較定量。
[0050] 檢測(cè)結(jié)果見表1。
[0051] 實(shí)施例2
[0052] 一、材料準(zhǔn)備
[0053] PDA平板培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g和瓊脂20g，用水定容至1000ml，自然 pH，在 121°C 下滅菌 20min。
[0054] 將斜面保藏的桑黃菌種接種到PDA平板培養(yǎng)基上，進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28°C， 培養(yǎng)時(shí)間9天，得到活化后的桑黃菌種菌塊。
[0055] 將斜面保藏的青頂擬多孔菌菌種接種到PDA平板培養(yǎng)基上，進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng) 溫度27°C，培養(yǎng)時(shí)間8天，得到活化后的青頂擬多孔菌菌種菌塊。
[0056] 馬褂木提取物的制備方法，包括：稱取一定量的馬褂木葉，粉碎過60目，先加占馬 褂木葉重量16倍量的質(zhì)量百分濃度為80%的乙醇水溶液在80°C浸提2h，過濾后得到上清 液，上清液濃縮后真空冷凍干燥得提取物I ;上述醇提后的馬褂木葉殘?jiān)尤胝捡R褂木葉 重量20倍量的蒸餾水在95°C下浸提2. 5h，過濾后得到上清液，上清液濃縮至1/4體積后加 入濃縮物體積5倍量的無水乙醇，5000rpm離心IOmin收集沉淀物，沉淀物真空冷凍干燥后 得提取物II，合并上述提取物I和提取物II得馬褂木提取物。
[0057] IL液體種子培養(yǎng)基組成為：葡萄糖15g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、KH2P04lg/L、 MgSO4O. 5g/L和余量的水，pH自然。
[0058] IL發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：葡萄糖20g/L、蛋白胨4g/L、麥麩5g/L、谷氨酸5g/L、 KH2PO4L 5g/L、MgSO4O. 75g/L 和余量的水。
[0059] 二、桑黃液體發(fā)酵產(chǎn)物的制備
[0060] (1)桑黃液體種子液的制備：取5cm2大小活化后的桑黃菌種接種于IL添加馬褂木 提取物的液體種子培養(yǎng)基中，每升液體種子培養(yǎng)基中馬褂木提取物的添加量為l〇g，28°C培 養(yǎng)5天，得桑黃液體種子液；
[0061] (2)青頂擬多孔菌種子液的制備：取3cm2大小活化后的青頂擬多孔菌菌種接種于 IL液體種子培養(yǎng)基中，29°C培養(yǎng)6天，得青頂擬多孔菌液體種子液；
[0062] (3)液體發(fā)酵培養(yǎng)：向發(fā)酵培養(yǎng)基中先接入占發(fā)酵培養(yǎng)基體積8 %的青頂擬多孔 菌液體種子液，在溫度28°C的條件下培養(yǎng)3天后，將溫度調(diào)為29°C，接入占發(fā)酵培養(yǎng)基體積 15%的桑黃液體種子液，然后繼續(xù)培養(yǎng)3天，終止發(fā)酵后，得到桑黃液體發(fā)酵產(chǎn)物。
[0063] 三、測(cè)定
[0064] 1.菌絲生物量的測(cè)定：桑黃液體發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)8層紗布過濾，過濾所得菌絲體用蒸 餾水沖洗3次，然后置65°C烘箱中烘干至恒重，即為樣品，稱重。
[0065] 2.金絲桃苷含量測(cè)定：精密稱取5g樣品，用濾紙包好，放入索氏提取器，IOOmL質(zhì) 量百分濃度70%的乙醇水溶液，回流提取6h，直至回流液無色為止。70°C減壓旋蒸濃縮，得 到含金絲桃苷的提取物，用甲醇定容于25mL容量瓶中，待測(cè)，分析前用0. 45 μ m濾膜濾過。
[0066] 高效液相色譜條件：色譜柱：Nova-Pak C18色譜柱（3. 9mmX 150mm, 5 μ m);柱溫 50°C，進(jìn)樣20 μ L ;流動(dòng)相：A相為質(zhì)量百分濃度0. 4 %的磷酸水溶液，B-乙腈/甲醇（I: 1，體 積比），流速lmL/min ;梯度洗脫：0_15min，B由16%線性改變到23%，15_30min，B由23% 線性改變到36%，至30min停止洗脫，DAD檢測(cè)（360nm)。
[0067] 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密稱取金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品11. Omg置于IOmL容量瓶中，用甲醇超 聲溶解并定容，制成濃度為I. lmg/mL金絲桃苷儲(chǔ)備液。精密吸取上述儲(chǔ)備液0. lmL，置于 IOmL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，制成濃度為11. 0 μ g/mL的金絲桃苷溶液。精密吸取該 濃度溶液適量，逐級(jí)稀釋，配成濃度依次為：〇· 275, 0· 55, L 10, 2. 75, 5. 50 μ g/mL的金絲桃 苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液。按照上述色譜條件，分別將標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液注入液相色譜儀中進(jìn)行測(cè) 定，以保留時(shí)間定性，以試樣峰面積與標(biāo)準(zhǔn)比較定量。
[0068] 檢測(cè)結(jié)果見表1。
[0069] 實(shí)施例3
[0070] 一、材料準(zhǔn)備
[0071] PDA平板培養(yǎng)基同實(shí)施例1。
[0072] 將斜面保藏的桑黃菌種接種到PDA平板培養(yǎng)基上，進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30°C， 培養(yǎng)時(shí)間4天，得到活化后的桑黃菌種菌塊。
[0073] 將斜面保藏的青頂擬多孔菌菌種接種到PDA平板培養(yǎng)基上，進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng) 溫度30°C，培養(yǎng)時(shí)間4天，得到活化后的青頂擬多孔菌菌種菌塊。
[0074] 馬褂木提取物的制備方法，包括：稱取一定量的馬褂木葉，粉碎過40目，先加占馬 褂木葉重量10倍量的質(zhì)量百分濃度為60%的乙醇水溶液在70°C浸提I. 5h，過濾后得到上 清液，上清液濃縮后真空冷凍干燥得提取物I ;上述醇提后的馬褂木葉殘?jiān)尤胝捡R褂木 葉重量15倍量的蒸餾水在90°C下浸提I. 5h，過濾后得到上清液，上清液濃縮至1/4體積后 加入濃縮物體積4倍量的無水乙醇，5000rpm離心IOmin收集沉淀物，沉淀物真空冷凍干燥 后得提取物II，合并上述提取物I和提取物II得馬褂木提取物。
[0075] IL液體種子培養(yǎng)基組成為：葡萄糖20g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、KH2P04lg/L、 MgSO4O. 5g/L和余量的水，pH自然。
[0076] IL發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：葡萄糖20g/L、蛋白胨4g/L、麥麩5g/L、谷氨酸4g/L、 KH2PO4L 5g/L、MgSO4O. 75g/L 和余量的水。
[0077] 二、桑黃液體發(fā)酵產(chǎn)物的制備
[0078] (1)桑黃液體種子液的制備：取3cm2大小活化后的桑黃菌種接種于IL添加馬褂木 提取物的液體種子培養(yǎng)基中，每升液體種子培養(yǎng)基中馬褂木提取物的添加量為6g，22°C培 養(yǎng)6天，得桑黃液體種子液；
[0079] (2)青頂擬多孔菌種子液的制備：取5cm2大小活化后的青頂擬多孔菌菌種接種于 IL液體種子培養(yǎng)基中，22°C培養(yǎng)6天，得青頂擬多孔菌液體種子液；
[0080] (3)液體發(fā)酵培養(yǎng)：向發(fā)酵培養(yǎng)基中先接入占發(fā)酵培養(yǎng)基體積3 %的青頂擬多孔 菌液體種子液，在溫度24°C的條件下培養(yǎng)3天后，將溫度調(diào)為26°C，接入占發(fā)酵培養(yǎng)基體積 8%的桑黃液體種子液，然后繼續(xù)培養(yǎng)3天，終止發(fā)酵后，得到桑黃液體發(fā)酵產(chǎn)物。
[0081] 三、測(cè)定同實(shí)施例1。檢測(cè)結(jié)果見表1。
[0082] 實(shí)施例4
[0083] 一、材料準(zhǔn)備
[0084] PDA平板培養(yǎng)基同實(shí)施例1。
[0085] 將斜面保藏的桑黃菌種接種到PDA平板培養(yǎng)基上，進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度22°C， 培養(yǎng)時(shí)間10天，得到活化后的桑黃菌種菌塊。
[0086] 將斜面保藏的青頂擬多孔菌菌種接種到PDA平板培養(yǎng)基上，進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng) 溫度22°C，培養(yǎng)時(shí)間10天，得到活化后的青頂擬多孔菌菌種菌塊。
[0087] 馬褂木提取物同實(shí)施例1。
[0088] IL液體種子培養(yǎng)基組成為：葡萄糖8g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、KH2P04lg/L、 MgSO4O. 5g/L和余量的水，pH自然。
[0089] IL發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：葡萄糖20g/L、蛋白胨4g/L、麥麩5g/L、谷氨酸I. 5g/L、 KH2PO4L 5g/L、MgSO4O. 75g/L 和余量的水。
[0090] 二、桑黃液體發(fā)酵產(chǎn)物的制備
[0091] (1)桑黃液體種子液的制備：取2cm2大小活化后的桑黃菌種接種于IL添加馬褂木 提取物的液體種子培養(yǎng)基中，每升液體種子培養(yǎng)基中馬褂木提取物的添加量為lg，30°C培 養(yǎng)3天，得桑黃液體種子液；
[0092] (2)青頂擬多孔菌種子液的制備：取2cm2大小活化后的青頂擬多孔菌菌種接種于 IL液體種子培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)3天，得青頂擬多孔菌液體種子液；
[0093] (3)液體發(fā)酵培養(yǎng)：向發(fā)酵培養(yǎng)基中先接入占發(fā)酵培養(yǎng)基體積1 %的青頂擬多孔 菌液體種子液，在溫度30°C的條件下培養(yǎng)1天后，將溫度調(diào)為25°C，接入占發(fā)酵培養(yǎng)基體積 5%的桑黃液體種子液，然后繼續(xù)培養(yǎng)2天，終止發(fā)酵后，得到桑黃液體發(fā)酵產(chǎn)物。
[0094] 三、測(cè)定同實(shí)施例1。檢測(cè)結(jié)果見表1。
[0095] 實(shí)施例5
[0096] 一、材料準(zhǔn)備
[0097] PDA平板培養(yǎng)基同實(shí)施例1。
[0098] 將斜面保藏的桑黃菌種接種到PDA平板培養(yǎng)基上，進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度22°C， 培養(yǎng)時(shí)間9天，得到活化后的桑黃菌種菌塊。
[0099] 將斜面保藏的青頂擬多孔菌菌種接種到PDA平板培養(yǎng)基上，進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng) 溫度22°C，培養(yǎng)時(shí)間9天，得到活化后的青頂擬多孔菌菌種菌塊。
[0100] 馬褂木提取物同實(shí)施例1。
[0101] IL液體種子培養(yǎng)基組成為：葡萄糖5g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、KH2P04lg/L、 MgSO4O. 5g/L和余量的水，pH自然。
[0102] IL發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：葡萄糖20g/L、蛋白胨4g/L、麥麩5g/L、谷氨酸0. 5g/L、 KH2PO4L 5g/L、MgSO4O. 75g/L 和余量的水。
[0103] 二、桑黃液體發(fā)酵產(chǎn)物的制備
[0104] (1)桑黃液體種子液的制備：取2cm2大小活化后的桑黃菌種接種于IL添加馬褂木 提取物的液體種子培養(yǎng)基中，每升液體種子培養(yǎng)基中馬褂木提取物的添加量為5g，20°C培 養(yǎng)7天，得桑黃液體種子液；
[0105] (2)青頂擬多孔菌種子液的制備：取2cm2大小活化后的青頂擬多孔菌菌種接種于 IL液體種子培養(yǎng)基中，20°C培養(yǎng)7天，得青頂擬多孔菌液體種子液；
[0106] (3)液體發(fā)酵培養(yǎng)：向發(fā)酵培養(yǎng)基中先接入占發(fā)酵培養(yǎng)基體積10%的青頂擬多孔 菌液體種子液，在溫度22°C的條件下培養(yǎng)4天后，將溫度調(diào)為25°C，接入占發(fā)酵培養(yǎng)基體積 20%的桑黃液體種子液，然后繼續(xù)培養(yǎng)5天，終止發(fā)酵后，得到桑黃液體發(fā)酵產(chǎn)物。
[0107] 三、測(cè)定同實(shí)施例1。檢測(cè)結(jié)果見表1。
[0108] 對(duì)比例1
[0109] (1)搖瓶種子培養(yǎng)
[0110] IL液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖10g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、KH2P04lg/L、 MgS04(X5g/L和余量為水。pH自然，在121°C下滅菌20min。
[0111] 培養(yǎng)方法：取2cm2大小實(shí)施例1中活化后的桑黃菌種接入滅菌冷卻后的IL液體 種子培養(yǎng)基中，25°C，120r/min下?lián)u床培養(yǎng)4天，得到培養(yǎng)好的種子液。
[0112] (2)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)
[0113] 發(fā)酵培養(yǎng)基同實(shí)施例1。pH自然，在121 °C下滅菌20min。
[0114] 培養(yǎng)方法：將培養(yǎng)好的種子液按占發(fā)酵培養(yǎng)基體積10 %的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng) 基中，在25°C，120r/min搖床中培養(yǎng)12天。每個(gè)試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。
[0115] 檢測(cè)結(jié)果見表1。
[0116] 對(duì)比例2僅添加馬褂木提取物，不使用青頂擬多孔菌
[0117] 除了"二、桑黃液體發(fā)酵產(chǎn)物的制備（1)桑黃液體種子液的制備：取2cm2大小活化 后的桑黃菌種接種于IL添加馬褂木提取物的液體種子培養(yǎng)基中，每升液體種子培養(yǎng)基中 馬褂木提取物的添加量為5g，20°C培養(yǎng)7天，得桑黃液體種子液；（3)液體發(fā)酵培養(yǎng)：向發(fā) 酵培養(yǎng)基中接入占發(fā)酵培養(yǎng)基體積20%的桑黃液體種子液，溫度25°C培養(yǎng)5天，終止發(fā)酵 后，得到桑黃液體發(fā)酵產(chǎn)物。"之外，其余操作同實(shí)施例5。檢測(cè)結(jié)果見表1。
[0118] 對(duì)比例3僅使用青頂擬多孔菌，不添加馬褂木提取物
[0119] 除了"二、桑黃液體發(fā)酵產(chǎn)物的制備（1)桑黃液體種子液的制備：取2cm2大小活化 后的桑黃菌種接種于IL液體種子培養(yǎng)基中，20°C培養(yǎng)7天，得桑黃液體種子液；（2)青頂擬 多孔菌種子液的制備：取2cm 2大小活化后的青頂擬多孔菌菌種接種于IL液體種子培養(yǎng)基 中，20°C培養(yǎng)7天，得青頂擬多孔菌液體種子液；（3)液體發(fā)酵培養(yǎng)：向發(fā)酵培養(yǎng)基中先接入 占發(fā)酵培養(yǎng)基體積10%的青頂擬多孔菌液體種子液，在溫度22°C的條件下培養(yǎng)4天后，將 溫度調(diào)為25°C，接入占發(fā)酵培養(yǎng)基體積20 %的桑黃液體種子液，然后繼續(xù)培養(yǎng)5天，終止發(fā) 酵后，得到桑黃液體發(fā)酵產(chǎn)物。"之外，其余操作同實(shí)施例5。檢測(cè)結(jié)果見表1。
[0120] 表1桑黃液體發(fā)酵代謝產(chǎn)物含量檢測(cè)結(jié)果
[0121]

【權(quán)利要求】
1. 一種提高桑黃液體發(fā)酵產(chǎn)物中金絲桃苷含量的方法，其特征在于，包括步驟： (1) 桑黃液體種子液的制備：將活化后的桑黃菌種接種于添加馬褂木提取物的液體種 子培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天-7天，得桑黃液體種子液； (2) 青頂擬多孔菌種子液的制備：將活化后的青頂擬多孔菌菌種接種于液體種子培養(yǎng) 基中培養(yǎng)3天-7天，得青頂擬多孔菌液體種子液； (3) 液體發(fā)酵培養(yǎng)：向發(fā)酵培養(yǎng)基中先接入占發(fā)酵培養(yǎng)基體積1% -10%的青頂擬多孔 菌液體種子液，在溫度22°C -30°C的條件下培養(yǎng)1天-4天后，將溫度調(diào)為25°C -29°C，接入 占發(fā)酵培養(yǎng)基體積5 % -20 %的桑黃液體種子液，然后繼續(xù)培養(yǎng)2天-5天，終止發(fā)酵后，得 到桑黃液體發(fā)酵產(chǎn)物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1)中，每升液體種子培養(yǎng)基中馬褂 木提取物的添加量為lg-l〇g。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的馬褂木提取物為以馬褂木葉為原 料制備的馬褂木提取物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的馬褂木提取物由馬褂木葉醇提取 物和馬褂木葉水提物組成。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于，稱取一定量的馬褂木葉，粉碎，先加占 馬褂木葉重量10倍量-16倍量的質(zhì)量百分濃度為60% -80%的乙醇水溶液在60°C -80°C 浸提lh-2h，過濾后得到上清液，上清液濃縮后真空冷凍干燥得提取物I ;上述醇提后的馬 褂木葉殘?jiān)尤胝捡R褂木葉重量10倍量-20倍量的水在85°C -95°C下浸提lh-2. 5h，過濾 后得到上清液，上清液濃縮至1/4體積后加入濃縮物體積2倍量-5倍量的無水乙醇，離心 收集沉淀物，沉淀物真空冷凍干燥后得提取物II，合并上述提取物I和提取物II得馬褂木 提取物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（3)中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成 為：以1L發(fā)酵培養(yǎng)基計(jì)，葡萄糖20g、蛋白胨4g、麥麩5g、谷氨酸0. 5g-5g、KH2P041. 5g、 MgS040. 75g和余量的水。
【文檔編號(hào)】C12P19/60GK104278068SQ201410565842
【公開日】2015年1月14日 申請(qǐng)日期:2014年10月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月21日
【發(fā)明者】程俊文, 賀亮, 魏海龍, 胡傳久, 付立忠, 李海波 申請(qǐng)人:浙江省林業(yè)科學(xué)研究院