miRNA-30a作為標記分子在制備診斷試劑中的用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種miRNA-30a作為標記分子在制備診斷對比劑誘導的急性腎損傷試劑中的用途。本發(fā)明還提供了miRNA-30a聯(lián)合miRNA-30e、miRNA-188中任意一種或者兩種作為標記分子在制備診斷對比劑誘導的急性腎損傷試劑中的用途。本發(fā)明還提供了一種試劑盒，含有miRNA-30a。經(jīng)實驗驗證miRNA-30a可以用于早期診斷CI-AKI。miRNA-30a單獨用于診斷CI-AKI的敏感性為56.3%，特異性為94.4%；與miR-30e和miR-188聯(lián)合診斷CI-AKI的敏感性為71.8%，特異性為88.7%。采用上述標記物早期診斷CI-AKI具有極大的應用前景和市場前景。
【專利說明】mi RNA-30a作為標記分子在制備診斷試劑中的用途

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學領域，尤其涉及一種分子標記物，具體來說是miRNA-30a作 為標記分子在制備診斷試劑中的用途。

【背景技術】
[0002] 對比劑誘導的急性腎損傷（Contrast Induced Acute Kidney Injury, CI-AKI)是 指除外其他因素，對比劑給藥后新發(fā)生急性腎功能損傷或腎功能不全加重。CI-AKI是醫(yī)源 性急性腎功能衰竭的第3位病因，占醫(yī)源性急性腎功能衰竭的11%，目前臨床上主要見于 接受冠狀動脈介入診療手術的患者。近年來隨著我國冠心病發(fā)病率的增加和冠脈介入技術 的廣泛開展，CI-AKI的發(fā)病率、發(fā)病絕對人數(shù)有逐年升高趨勢。
[0003] 雖然大多數(shù)CI-AKI患者表現(xiàn)為一過性血肌酐水平升高，真正導致腎功能衰竭需 要透析治療的比例還不到1%，但CI-AKI患者住院期間死亡、中風及各種心血管事件的發(fā) 生率均顯著升高，長期生存率也明顯低于無腎臟損傷表現(xiàn)的患者。CI-AKI的防治對改善患 者臨床預后有重要意義。
[0004] 研究表明，早期干預能夠提高腎功能障礙改善的機會，是防治CI-AKI的關鍵。 而早期干預的前提是早期診斷。目前CI-AKI診斷的難點在于缺乏類似急性心肌梗死中 肌鈣蛋白一樣的敏感性高、特異性好的早期診斷生物標志物。臨床上正在使用的診斷 標準是以血肌酐為依據(jù)，規(guī)定接受對比劑48-72h血肌酐絕對值增加0. 5mg/dL以上或相 對值升高25%以上確診CI-AKI。但血肌酐不是一個反映腎功能急性改變的可靠指標， 它在腎功能損失50 %以前濃度不會改變，升高通常在對比劑暴露后48-72小時，嚴重滯 后，且受患者體重、種族、年齡、性別、身體體積、藥物、肌肉代謝和蛋白質攝入等許多非腎 性因素影響（Thomsen HS, et al·，Br J Radiol 76(2003)513-518 ;Tomlanovich S，et al. ,Am J Kidney Dis 8 (1986)332-337 ;Van Biesen W，et al·，Clin J Am Soc Nephrol 1(2006) 1314-1319)。
[0005] 最近10年的一些研究探討了 NAGL、IL-18、KM-I等新型標記物作為CI-AKI早 期診斷指標的可靠性及可行性（Ferguson MA, et al·，Toxicology 245(2008) 182-193; Devarajan P, et al.，Contrib Nephrol 156(2007)203-212)。這些診斷標記物中， 血NAGL相關研究最多，評價相對較好。Bachorzewska Gajewska等發(fā)現(xiàn)PCI術后患 者血 NGAL 在 4h 明顯升高（Bachorzewska-Gajewska H, et al. ,Kidney Blood Press Res30(2007)408-415)。其靈敏度和特異度分別為 0· 9 和 0· 74(Bachorzewska-Gajewska H, et al. Int J Cardiol 127(2008)290-291)。但NAGL穩(wěn)定性和特異性較差，易受許多已 存的可變因素的影響，如基礎腎臟疾病和尿路感染，且不能進一步鑒別不同因素導致的急 性腎功能損傷，因此不能代替血肌酐作為臨床CI-AKI的診斷標記物。
[0006] 目前迫切需要尋找到一個敏感性好、特異性強、易于測量、穩(wěn)定不受其他可變生物 因素影響的、可評價對比劑引起急性腎功能損傷的早期生物標志物。
[0007] miRNAs是一類23-25個核苷酸大小的、進化上高度保守、內源性單鏈非編 碼RNA。同時，miRNA是一類具有生物活性的小RNA。miRNA通過與mRNA的配對結合， 降解mRNA或干擾其翻譯，起到生物調節(jié)作用（Saal S，et al·，Curr Opin Nephrol Hypertensl8(2009)317-323)〇
[0008] 研究發(fā)現(xiàn)，miRNA表達具有組織特異性。Yu Liang、Pablo Landgraf等分別對不同 物種、不同組織miRNA表達譜進行研究。發(fā)現(xiàn)部分miRNAs在特定的組織特異性表達或富集。 例如，miR-122在肝臟特異性表達，而miR-133a、miR-499在骨骼肌、心肌特異性表達（Liang Y，et al·，BMC Genomics 166(2007)8)。
[0009] 同時，miRNAs表達具有疾病特異性。研究發(fā)現(xiàn)不同種類的癌癥細胞miRNA表達特 點各不相同。Calin等首先發(fā)現(xiàn)miRNA-15、miRNA-16在慢性淋巴細胞性白血病中表達下調 (Barbarotto E，et al·，Curr Pharm Des 14(2008)2040-2050)。而 Nozomu Yahaihara 等 的觀察到肺腺癌中 miR-155 高表達、let_7a_2 低表達（Yanaihara N, et al.，Cancer Cell 9(2006) 189-198)。證明了 miRNAs的表達具有疾病特異性。miRNA表達還具有時相性，miRNA 表達譜隨疾病病程動態(tài)改變。Jonathan Godwin等對腎臟缺陷再灌注小鼠模型不同時間點 腎臟miRNA表達譜進行對比發(fā)現(xiàn)，miRNAs呈現(xiàn)出不同的變化趨勢。例如，miRNA-21在再灌 注早期迅速升高，達到平臺期。而miRNA-146a在再灌注第3-7天才開始逐漸升高（Godwin JG，et al·，Proc Natl Acad Sci U S A 107(2010) 14339-14344)。
[0010] 部分研究發(fā)現(xiàn)miRNA在病變組織、器官的表達改變能反應在血漿中。研究發(fā)現(xiàn)前列 腺癌組織高表達的miR-141在前列腺癌患者血清中也明顯高于健康人群，且具有較高的敏 感性和特異性（Mitchell PS, et al·，Proc Natl Acad Sci U S A105 (2008) 10513-10518)。 藥物性肝損模型小鼠中，肝臟特異的miRNA-122在小鼠肝臟中表達下調，但在血漿中表達 明顯上調，并具有劑量/時間相關性。血漿中miRNA還具有很好的穩(wěn)定性（Wang K，et al·，Proc Natl Acad Sci U S A 106(2009)4402-4407)。雖然血漿中存在大量降解 RNA 的 酶，血漿中基本不存在長段的RNA，但miRNA在血漿中可以以某種形式穩(wěn)定存在。研究發(fā)現(xiàn) 血漿中的miRNAs在室溫（24小時）和反復凍融（8次）的情況下均保持穩(wěn)定（Chen X，et al·，Cell Res 18(2008)997-1006)。
[0011] 正是由于miRNA的組織、疾病特異性，與疾病病理生理狀態(tài)密切相關的特性決定 了 miRNA作為診斷標記物具有較高的特異性。同時血漿或血清中miRNA能反映病變組織 mi RNA表達的改變。因此血漿mi RNA作為一種無創(chuàng)的、特異的疾病診斷標記物越來越得到重 視和認可。
[0012] 已有大量研究探討了 miRNA在慢性腎臟疾病中的地位，其中包括多囊性腎 病、糖尿病腎病、腎臟腫瘤等（Sun H，et al.，Mol Biol R印 37(2011)2951-2958 ;Kato M, et al.,Proc Natl Acad Sci U S A 104 (2007) 3432-3437 ；Zhang Z, et al. , FEBS Lett583 (2009) 2009-2014 ;Hanke M,et al·, Urol Oncol 28(2009)655-661)。但目前國內 外無相關研究關注血漿miRNA作為CI-AKI的診斷標記物。
[0013] 全血、血清或血漿是最廣泛使用的臨床途徑樣品源。尋找到提供早期診斷信息的 對比劑誘導急性腎損傷血漿標記物，可產(chǎn)生一種診斷性實驗，極大地幫助診斷和處理該疾 病。


【發(fā)明內容】

[0014] 本發(fā)明的目的在于提供一種miRNA-30a作為標記分子在制備診斷試劑中的用途， 所述的這種用途解決了現(xiàn)有技術中診斷對比劑誘導的急性腎損傷的分子標記物穩(wěn)定性和 特異性較差，易受許多已存的可變因素影響的技術問題。
[0015] 本發(fā)明提供了 miRNA-30a作為標記分子在制備診斷對比劑誘導的急性腎損傷試 劑中的用途，所述的miRNA-30a的堿基序列如SEQ ID NO :1所示。
[0016] 本發(fā)明還提供了 miRNA-30a作為標記分子在制備早期診斷對比劑誘導的急性腎 損傷試劑中的用途，所述的miRNA-30a的堿基序列如SEQ ID NO :1所示。
[0017] 進一步的，其中所述早期診斷是指對比劑暴露后的4-6小時。
[0018] 本發(fā)明還提供了 miRNA_30a聯(lián)合miRNA_30e、miRNA-188中任意一種或者兩種作 為標記分子在制備診斷對比劑誘導的急性腎損傷試劑中的用途，所述的miRNA-30a的堿 基序列如SEQ ID NO :1所示，所述的miRNA-30e的堿基序列如SEQ ID NO :2所示，所述的 miRNA-188的堿基序列如SEQ ID NO :3所示。
[0019] 本發(fā)明還提供了 miRNA-30a聯(lián)合miRNA-30e、miRNA-188中任意一種或者兩種作為 標記分子在制備早期診斷對比劑誘導的急性腎損傷試劑中的用途，，所述的miRNA-30a的 堿基序列如SEQ ID NO: 1所示，所述的miRNA-30e的堿基序列如SEQ ID NO :2所示，所述的 miRNA-188的堿基序列如SEQ ID NO :3所示。
[0020] 本發(fā)明還提供了一種試劑盒，含有miRNA_30a，所述的miRNA_30a的堿基序列如 SEQ ID NO :1 所示。
[0021] 本發(fā)明在CI-AKI患者的血漿miRNA中尋找到有助于早期診斷該疾病的新標記物 miRNA_30a〇
[0022] 同時，本發(fā)明還提供了涉及對比劑誘導的急性腎損傷診斷方法，該方法包括以下 步驟：a)提供由個體獲得的血漿樣品；b)測量對比劑暴露前后血漿樣品中miRNA-30a濃度 變化倍數(shù)，和c)將（b)與CI-AKI診斷相關聯(lián)。
[0023] 本發(fā)明涉及對比劑誘導的急性腎損傷的診斷方法還提供了另一個優(yōu)選實施方案， 該方法包括以下步驟：a)測量對比劑暴露前后血漿樣品中miRNA-30a濃度變化倍數(shù)，b)任 選地測量血漿樣品中CI-AKI的一種或多種其他miRNA標記的濃度變化倍數(shù)；和c)使用在 步驟（a)和任選的步驟（b)中測定的濃度變化倍數(shù)，診斷CI-AKI。
[0024] 如本文所使用的，下面術語的每一個在本部分中具有與它相關的含義。
[0025] 術語"個體"在本文中用于指接受冠脈介入診療手術的患者，這些患者未接受普通 肝素抗凝治療，或給予普通肝素抗凝治療超過4小時。
[0026] 術語"測量"在本文中用于指包括microRNA芯片、Solexa測序、Taqman低密度陣 列、實時熒光定量PCR或基于微球的各種microRNA檢測方法。
[0027] 術語"血漿樣品"在本文中用于指為體外評價目的而得到的患者血漿，該血漿自經(jīng) EDTA(工作濃度為1.8mg/ml)抗凝的個體全血離心后獲得。
[0028] 在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及通過各種mi croRNA檢測方法體外檢測血漿 miRNA-30a、miR-188和miR-30e濃度變化，和使用測定的濃度變化診斷CI-AKI。
[0029] 本發(fā)明經(jīng)實驗驗證miRNA_30a可以用于早期（對比劑暴露后4-6小時）診斷 CI-AKI。miRNA-30a單獨用于診斷CI-AKI的敏感性為56. 3 %，特異性為94. 4 %;與miR-30e 和miR-188聯(lián)合診斷CI-AKI的敏感性為71. 8%，特異性為88. 7%。采用上述標記物早期 診斷CI-AKI具有極大的應用前景和市場前景。
[0030] 上述本
【發(fā)明內容】
已經(jīng)對本發(fā)明做了詳細的描述，為了使本領域技術人員更清楚本 發(fā)明的
【發(fā)明內容】
和技術效果，下面結合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明做進一步詳細說明。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 圖1說明通過miRNA芯片方法篩選對比劑誘導的急性腎損傷標記物流程。
[0032] 圖2A為用real-time PCR方法檢測證明miRNA_30a在大鼠腎臟組織特異表達；
[0033] 圖2B為檢索已發(fā)表的人組織miRNAs表達譜文獻顯示miRNA_30a在人體腎臟組織 特異性表達。
[0034] 圖3用real-time PCR方法驗證芯片結果，CI-AKI大鼠血漿miRNA_30a表達上調。
[0035] 圖4用real-time PCR方法驗證芯片結果，CI-AKI大鼠血漿miRNA-30a在對比劑 暴露后4h上升達峰值。
[0036] 圖5用real-time PCR方法證明，CI-AKI大鼠血漿miRNA_30a升高與對比劑誘導 的腎損傷特異相關。
[0037] 圖6用real-time PCR方法比較miRNA-30a在CI-AKI和非CI-AKI患者血漿中的 水平，證明CI-AKI患者顯著升高。
[0038] 圖7miRNA_30a作為CI-AKI診斷標志物的ROC評價。

【具體實施方式】
[0039] 下面結合具體實施例和附圖對本發(fā)明作進一步的說明。
[0040] 實施例1芯片篩選人腎臟特異性表達的目標miRNA
[0041] 1.構建CI-AKI大鼠模型
[0042] 本發(fā)明通過在禁水3天、利尿"預處理"的基礎上經(jīng)尾靜脈注射低滲對比劑的方法 建立CI-AKI大鼠模型。這是本發(fā)明人建立的一種新型CI-AKI大鼠模型，具體方案見相關 文獻（Sun SQ, et al. Int Journal of Cardiol 172 (2014) e48_50)。
[0043] 2. miRNA芯片差異表達譜分析
[0044] DmiRNA芯片制備
[0045] 在采用上述方法成功造模的基礎上，留取造模后8小時CI-AKI大鼠血漿、腎臟，用 于芯片上樣。采用Agilent miRNAs 10. Oversion芯片技術，以血楽和腎臟總RNA進行上樣， 以磷酸化Cyanine3-pCp進行標記，然后進行芯片雜交、洗滌和數(shù)據(jù)采集。
[0046] 2)生物信息學分析
[0047] 芯片突光強度信號值米用 AgilentG4450AA Feature Extraction Software 9. 5 以及Agilent Scan Control Software version A7.0軟件進行采集分析。樣品信號值用 原始數(shù)據(jù)經(jīng)歸一化（normalization)后進行l(wèi)og2轉換表示。樣品信號Flag值A (Absent) 代表信號與背景差異不顯著，P(Present)代表信號與背景差異顯著。樣品數(shù)據(jù)分析采用 Agilent Gene Spring software 9.0,通過對比CI-AKI和非CI-AKI大鼠的腎臟和血楽芯 片數(shù)據(jù)，得到差異表達的microRNA，結果如表1所示。
[0048] 表I. miRNAs表達譜分析
[0049]

【權利要求】
1. miRNA-30a作為標記分子在制備診斷對比劑誘導的急性腎損傷試劑中的用途，所述 的miRNA-30a的堿基序列如SEQ ID NO :1所示。 2. miRNA-30a作為標記分子在制備早期診斷對比劑誘導的急性腎損傷試劑中的用途， 所述的miRNA-30a的堿基序列如SEQ ID NO :1所示。
3. 根據(jù)權利要求2的用途，其中所述早期診斷是指對比劑暴露后的4-6小時。 4. miRNA-30a聯(lián)合miRNA-30e、miRNA-188中任意一種或者兩種作為標記分子在制備診 斷對比劑誘導的急性腎損傷試劑中的用途，所述的miRNA-30a的堿基序列如SEQ ID NO :1 所示，所述的miRNA-30e的堿基序列如SEQ ID NO :2所示，所述的miRNA-188的堿基序列如 SEQ ID NO : 3 所示。 5. miRNA-30a聯(lián)合miRNA-30e、miRNA-188中任意一種或者兩種作為標記分子在制備 早期診斷對比劑誘導的急性腎損傷試劑中的用途，所述的miRNA-30a的堿基序列如SEQ ID NO :1所示，所述的miRNA-30e的堿基序列如SEQ ID NO :2所示，所述的miRNA-188的堿基 序列如SEQ ID NO : 3所示。
6. -種試劑盒，其特征在于：含有miRNA-30a，所述的miRNA-30a的堿基序列如SEQ ID NO :1所示。
【文檔編號】C12Q1/68GK104313142SQ201410549236
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月16日 優(yōu)先權日:2014年10月16日
【發(fā)明者】何奔, 沈玲紅, 張拓, 孫士群 申請人:上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院