長鏈金屬硫蛋白基因mtt1的優(yōu)化及植物表達(dá)載體構(gòu)建的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種經(jīng)密碼子優(yōu)化的嗜熱四膜蟲金屬硫蛋白 MTT1 植物表達(dá)載體及其應(yīng)用。該載體按照如下步驟的方法得到：在不改變氨基酸序列的前提下，按照蘆葦偏愛密碼子對嗜熱四膜蟲金屬硫蛋白 MTT1 進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，綜合考慮密碼子使用頻率，GC含量及mRNA二級結(jié)構(gòu)等影響因素，使其利于在蘆葦、煙草等植物中高效表達(dá)，并在基因序列兩端預(yù)留 Nco I和 Eco RI酶切位點(diǎn)。然后用 Nco I和 Eco RI雙酶切植物表達(dá)載體pCAMBIA-1302和金屬硫蛋白基因 MTT1 兩端 Nco I和 Eco RI酶切位點(diǎn)，回收植物表達(dá)載體片段和金屬硫蛋白基因片段，經(jīng)DNAT4連接酶將二者連接成金屬硫蛋白植物表達(dá)載體。經(jīng)將表達(dá)載體pCAMBIA-1302-MTT1轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌侵染煙草組培證實(shí)，原生生物金屬硫蛋白可以在植物中表達(dá)。該載體還可以借助根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化蘆葦及其他植物，獲得具有清除環(huán)境中有毒有害重金屬離子的植株。
【專利說明】長鏈金屬硫蛋白基因MTT1的優(yōu)化及植物表達(dá)載體構(gòu)建

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)計(jì)合成了一種適合在蘆葦中表達(dá)的長鏈金屬硫蛋白基因，以便克隆到植 物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化蘆葦?shù)玫教J葦植株后，可以用該蘆葦植株清除環(huán)境中的重金屬離子。

【背景技術(shù)】
[0002] 重金屬是存在于環(huán)境中最豐富和最持久的無機(jī)污染物，它們能夠通過食物鏈的生 物積累逐步將毒害放大，而卻不能像有機(jī)污染物那樣被微生物降解。幾乎所有的重金屬，尤 其是那些不屬于生物體組成成分的重金屬，都能對生物體產(chǎn)生毒害作用，并能夠干擾生態(tài) 平衡。這些重金屬離子在生物體內(nèi)通過產(chǎn)生氧化劑的方式，直接或間接地強(qiáng)烈破壞蛋白質(zhì)、 DNA和細(xì)胞脂類，從而導(dǎo)致細(xì)胞壞死或凋亡。
[0003] 由于金屬離子和細(xì)胞之間的相互作用機(jī)制不同，因此真核細(xì)胞和原核細(xì)胞存在 不同的金屬離子拮抗機(jī)制。微生物和高等真核生物體內(nèi)六大基本重金屬拮抗機(jī)制之一就 是通過具有鰲和能力的蛋白或多肽來清除胞內(nèi)金屬離子(實(shí)質(zhì)上就是有毒物質(zhì)的生物積 累），或者是通過其他分子(如多聚磷酸鹽）阻止金屬離子與細(xì)胞敏感靶位發(fā)生相互作用。 通常來說，在生物細(xì)胞內(nèi)有兩類具有鰲和重金屬能力的多肽：a)生物體通過酶解方法合 成的小分子化合物，例如谷胱甘肽或植物螯合素；b)由基因編碼的蛋白，例如金屬硫蛋白 (metallothionein，MTs)，其帶有眾多來自半胱氨酸的巰基，這些巰基能夠形成鰲和重金屬 離子的反應(yīng)基團(tuán)。
[0004] 金屬硫蛋白（MTs)是細(xì)胞胞內(nèi)金屬結(jié)合蛋白超家族中的一員，存在于幾乎所有生 物體中，有較低的分子量（〈7000Da)，分子內(nèi)缺少芳香族氨基酸或組氨酸，并且能夠通過半 胱氨酸殘基鰲合Zn、Cu或Cd等金屬離子以達(dá)到解毒的目的。在哺乳動物體內(nèi)MTs維持銅 離子的動態(tài)平衡和清除自由基。金屬硫蛋白根據(jù)物種種類被分為15個家族，四膜蟲金屬硫 蛋白屬于第7亞家族。
[0005] 嗜熱四膜蟲是第一個完成全基因組測序的纖毛類原生動物。目前，從嗜熱四膜蟲 全基因組數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)其有5種金屬硫蛋白：#777、#m#7TJ、#77￥和#77^。這5種金 屬硫蛋白肽鏈長度、半胱氨酸數(shù)目及結(jié)合重金屬離子的數(shù)目均普遍高于哺乳動物金屬硫蛋 白及植物金屬硫蛋白，王清路等研究發(fā)現(xiàn)最長肽鏈的MTT1蛋白對有毒重金屬有高度的螯 合能力以達(dá)到解毒的目的。
[0006] 因此，我們決定采用具有污水、污染物和重金屬處理能力的蘆葦或其它植物表達(dá) 金屬硫蛋白#777來凈化環(huán)境中的重金屬離子。因?yàn)樵谶@些植物中過表達(dá)MTT1蛋白可以提 高植物處理重金屬離子的能力，而要想在植物中過表達(dá)#777基因就必須構(gòu)建一個#777植 物表達(dá)質(zhì)粒并能夠使其在植物中表達(dá)或過表達(dá)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種含有嗜熱四膜蟲金屬硫蛋白#777基因的重組植物表 達(dá)載體；提供一種按照蘆葦偏愛密碼子優(yōu)化的金屬硫蛋白基因；以及該植物表達(dá)載體 在蘆葦清除環(huán)境重金屬離子中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明提供的一種金屬硫蛋白#777基因的重組植物表達(dá)載體，包括如下構(gòu)建步 驟：（1)利用蘆葦偏愛密碼子表合成能在蘆葦中高效表達(dá)的嗜熱四膜蟲金屬硫蛋白基因 (#777 );基因的5'-端添加AfcoI酶切位點(diǎn)，3'-端添加feoRI酶切位點(diǎn)。原始#777基 因的核苷酸序列為SEQIDNo. 1，優(yōu)化后的#777基因的核苷酸序列為SEQIDNo. 2,測序結(jié) 果見圖1 ; (2)#777基因被合成后克隆至pGH載體上，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a。本實(shí)驗(yàn)室大量 繁殖大腸桿菌DH5a/pGH-MTTl，而后提取質(zhì)粒pGH-MTTl;植物表達(dá)載體pCAMBIA-1302也經(jīng) 過轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a后，繁殖大腸桿菌DH5a/PCAMBIA-1302,提取質(zhì)粒pCAMBIA-1302 ; 具體過程如下： a、從-80°C冰箱取出200ul感受態(tài)DH5a菌體，掌心使其融化后加入pT/pBI121，冰浴 30min，42°C熱休克90sec，迅速放回冰上冷卻2min，加1000ulLB液體培養(yǎng)基，在37°C， 恒溫?fù)u床中180rpm震蕩培養(yǎng)40min。將轉(zhuǎn)化后振蕩培養(yǎng)的菌液6000rpm離心2min,在 超凈臺中棄掉部分上清，留下約300ul培養(yǎng)基，將菌體沉淀吹打起來后，均勻涂布在預(yù)先涂 有抗生素（DH5a/pGH-MTTl100ug/mlAmp;DH5a/pCAMBIA-1302 30ug/mlAmp)的LB固 體培養(yǎng)基上，37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h(先正面放30-60min，而后倒置)。
[0009]b、挑取白色單菌落，轉(zhuǎn)接種于5mlLB液體培養(yǎng)基中（DH5a/pGH-MTTl100ug/ mlAmp;DH5a/pCAMBIA-1302 30ug/mlAmp)，37°C，180rpm振蕩培養(yǎng)過夜。質(zhì)粒提取使 用Biomiga生物技術(shù)公司的"BiomigaEZgene?PlasmidMiniprepKit"。
[0010] A)室溫下lOOOOrpm離心1min,收集菌體，并盡可能吸去上清，加入250ii1Buffer A1 (確保已加入RNaseA)，用移液槍或渦旋震蕩充分懸浮細(xì)菌細(xì)胞； B) 加入250illBufferB1，輕輕的翻轉(zhuǎn)10次以混合均勻，然后靜置5min至溶液粘稠 而澄清； C) 加入350ylBufferN1，立即翻轉(zhuǎn)多次至溶液充分混勻，此時出現(xiàn)白色絮狀沉淀； D) 將離心管轉(zhuǎn)至高速離心機(jī)，在室溫下13000rpm離心10min; E) 小心吸取離心后的上清液至帶有收集管的DNA柱中，室溫下13000rpm離心1min, 倒掉收集管中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中； 卩）向離心柱中加入5001110嫩13811131^€61<確保已加入無水乙醇)，室溫下13000印111 離心1min，倒掉收集管中的廢液，將離心管重新放回收集管中，重復(fù)此步驟； G) 將離心柱放回高速離心機(jī)中，13000rpm室溫下開蓋離心2min，以徹底去除殘留的乙 醇； H) 將離心柱轉(zhuǎn)至一個新的1. 5ml離心管中，向DNA柱的正中間加入5(Tl00ii1的ddH20 或ElutionBuffer,室溫放置2min, 13000rpm離心1min,洗脫質(zhì)粒DNA，直接應(yīng)用或凍 于-20°C。
[0011] (3)表達(dá)質(zhì)粒pCAMBIA-1302 -MTT1 的構(gòu)建 a、用AfcoI和feoRI雙酶切含有#777基因的pGH-MTTl載體及植物表達(dá)載體pCAMBIA-1302,酶切反應(yīng)體系為：

【權(quán)利要求】
1. 一種長鏈金屬硫蛋白植物表達(dá)載體，包括按照蘆葦偏愛密碼子優(yōu)化合成的，適合在 蘆葦中表達(dá)的嗜熱四膜蟲金屬硫蛋白#777基因，及該基因與植物表達(dá)載體pCAMBIA-1302 構(gòu)建而成的表達(dá)質(zhì)粒pCAMBIA-1302-MTTl，其特征在于，所需載體包含： 按照蘆葦偏愛密碼子優(yōu)化合成的長鏈?zhǔn)葻崴哪はx金屬硫蛋白#777核苷酸序列為SEQ ID No. 2,測序結(jié)果見圖1 #777基因連接在表達(dá)質(zhì)粒pCAMBIA-1302上。
2. 如權(quán)利1要求一種金屬硫蛋白植物表達(dá)載體pCAMBIA-1302-MTTl，以清除環(huán)境中有 毒有害重金屬離子而設(shè)計(jì)的表達(dá)載體。
3. -種以在蘆葦中表達(dá)為目的而設(shè)計(jì)的金屬硫蛋白表達(dá)載體。
4. 如權(quán)利要求1、2及3所述的重組#777植物表達(dá)載體的構(gòu)建及可用性驗(yàn)證方法，其特 征在于，包括如下步驟： (1) 利用蘆葦偏愛密碼子表合成能在蘆葦中高效表達(dá)的嗜熱四膜蟲金屬硫蛋白基因 (#777 );基因的5'-端添加Afco I酶切位點(diǎn)，3'-端添加feoR I酶切位點(diǎn)； (2) 基因合成后被克隆至pGH載體上； (3) 用Afco I和feoR I雙酶切含有#777基因的pGH載體及植物表達(dá)載體 pCAMBIA-1302,回收#777基因片段和pCAMBIA-1302載體片段，將二者用DNA T4連接酶連 接,得到表達(dá)質(zhì)粒pCAMBIA-1302-MTTl ; (4) 質(zhì)粒pCAMBIA-1302-MTTl轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌LBA4404,獲得帶有#777基因的根瘤農(nóng) 桿菌； (5) 農(nóng)桿菌侵染煙草NC89獲得轉(zhuǎn)#777基因煙草。
【文檔編號】C12N15/66GK104342451SQ201410544335
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2014年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月15日
【發(fā)明者】王清路, 張 杰, 周彩霞, 劉悅, 竇燁 申請人:王清路