焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)pml-rara融合基因的引物對(duì)及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)PML-RARA融合基因的引物對(duì)及包含所述引物對(duì)的試劑盒，該試劑盒能夠一次性檢測(cè)PML-RARA(L form)和PML-RARA(S form)兩種融合基因。通過對(duì)PML-RARA融合基因的mRNA設(shè)計(jì)引物，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄PCR后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，本試劑盒可以實(shí)現(xiàn)PML-RARA融合基因的快速、準(zhǔn)確、高通量的檢測(cè)。
【專利說明】焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)PML-RARA融合基因的引物對(duì)及試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)PML-RARA融合基 因的引物對(duì)，包含所述引物對(duì)的試劑盒及該試劑盒的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] PML-RARA融合基因包括PML-RARA(Lform)、PML-RARA(Sform)等多種類型，常見 于急性早幼粒細(xì)胞白血?。ˋPL)中。
[0003] 當(dāng)前國(guó)內(nèi)外廣泛使用的分子生物學(xué)檢測(cè)PML-RARA融合基因的方法中，熒光原位 雜交技術(shù)（FISH)只能進(jìn)行定性檢測(cè)、操作復(fù)雜；突光定量PCR存在著檢測(cè)通量的局限性，所 以都還不能真正滿足臨床診斷檢測(cè)的需要。傳統(tǒng)的固相生物芯片（Biochip)或基因芯片技 術(shù)存在著可重復(fù)性差、靈敏度不夠好以及操作繁瑣的突出弱點(diǎn)。
[0004] 焦磷酸測(cè)序技術(shù)（Pyrosequencing)是新一代DNA序列分析技術(shù)，具備同時(shí)對(duì)大量 樣品進(jìn)行測(cè)序分析的能力，為高通量、低成本、快速、直觀地進(jìn)行核苷酸分析和臨床檢驗(yàn)提 供了非常理想的技術(shù)操作平臺(tái)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 發(fā)明目的：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提出一種焦磷酸測(cè)序法檢 測(cè)PML-RARA融合基因的引物對(duì)以及含有所述引物對(duì)的試劑盒，可以同時(shí)檢測(cè)PML-RARA(L form)和PML-RARA(Sform)兩種融合基因，具有高靈敏度、高特異性、高準(zhǔn)確度、檢測(cè)迅速 等優(yōu)點(diǎn)。
[0006] 技術(shù)方案：為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明提出了一種焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)PML-RARA 融合基因的引物對(duì)，所述的PML-RARA為PML-RARA(Lform)和PML-RARA(Sform)中的任意 一種或兩種，其特征在于，所述引物對(duì)包括：
[0007] (1)對(duì)于PML-RARA(Lform)基因，
[0008] 擴(kuò)增引物為：
[0009]上游引物：5，-TGGATGGACCGCCTAGCC-3，，
[0010]下游引物：5，-GGCTTGTAGATGCGGGGTAG-3，，
[0011] 其中下游引物的5'端進(jìn)行生物素標(biāo)記；
[0012] 測(cè)序引物為：
[0013] 5， -GGCGCCGGGGAGGCA-3，；
[0014] (2)對(duì)于PML-RARA(Sform)基因：
[0015] 擴(kuò)增引物為：
[0016]上游引物：5，-TGGCTTCGACGAGTTCAA-3，，
[0017]下游引物：5，-GGGCTGGGCACTATCTCTT-3，，
[0018] 其中下游引物的5'端進(jìn)行生物素標(biāo)記；
[0019] 測(cè)序引物：
[0020] 5'-GCTCTGGGTCTCAATG-3'。
[0021] 本發(fā)明進(jìn)一步提出了一種焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)PML-RARA融合基因的試劑盒，所述 試劑盒包括上述引物，即：
[0022] (1)對(duì)于PML-RARA(Lform)基因，
[0023] 擴(kuò)增引物為：
[0024]上游引物：5，-TGGATGGACCGCCTAGCC-3，，
[0025]下游引物：5，-GGCTTGTAGATGCGGGGTAG-3，，
[0026] 其中下游引物的5'端進(jìn)行生物素標(biāo)記；
[0027] 測(cè)序引物為：
[0028] 5，-GGCGCCGGGGAGGCA-3';
[0029] (2)對(duì)于PML-RARA(Sform)基因：
[0030] 擴(kuò)增引物為：
[0031]上游引物：5，-TGGCTTCGACGAGTTCAA-3，，
[0032]下游引物：5，-GGGCTGGGCACTATCTCTT-3，，
[0033] 其中下游引物的5'端進(jìn)行生物素標(biāo)記；
[0034] 測(cè)序引物：
[0035]5'-GCTCTGGGTCTCAATG-3，。
[0036] 更具體地，所述試劑盒還包括質(zhì)控品，所述質(zhì)控品包括陽性對(duì)照品和陰性對(duì)照 品，其中，所述的陽性對(duì)照品為含有PML-RARA(Lform)和PML-RARA(Sform)融合基因的 質(zhì)粒的混合液，所述的陰性對(duì)照作為對(duì)照，與陽性對(duì)照相比，為不含PML-RARA(Lform)和 PML-RARA(Sform)的質(zhì)粒溶液。
[0037] 本發(fā)明還提出了上述引物對(duì)及包含上述引物對(duì)的試劑盒在制備檢測(cè)PML-RARA融 合基因的試劑中的應(yīng)用。
[0038] 有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)PML-RARA融合基因的試 劑盒能夠?qū)崿F(xiàn)快速、簡(jiǎn)便、高效、準(zhǔn)確的檢測(cè)PML-RARA(Lform)和PML-RARA(Sform)融合 基因，為制備用于檢測(cè)PML-RARA(Lform)和PML-RARA(Sform)融合基因的試劑提供了理 論基礎(chǔ)。

【具體實(shí)施方式】
[0039] 實(shí)驗(yàn)材料：
[0040] 引物由invitrogen公司合成；Trizol購(gòu)自invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成試 劑盒購(gòu)置于Fermentas公司；多重PCR試劑盒購(gòu)置于QIAGEN公司；焦磷酸測(cè)序試劑購(gòu)置于 QIAGEN公司。
[0041] 一種焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)PML-RARA融合基因的試劑盒，所述的PML-RARA為 PML-RARA(Lform)和PML-RARA(Sform)中的任意一種或兩種，包括質(zhì)控品和如下引物：
[0042] (1)對(duì)于PML-RARA(Lform)基因，
[0043] 擴(kuò)增引物為：
[0044]上游引物：5，-TGGATGGACCGCCTAGCC-3，，
[0045]下游引物：5，-GGCTTGTAGATGCGGGGTAG-3，，
[0046] 其中下游引物的5'端進(jìn)行生物素標(biāo)記；
[0047]測(cè)序引物為：
[0048] 5，-GGCGCCGGGGAGGCA-3';
[0049] (2)對(duì)于PML-RARA (S form)基因：
[0050] 擴(kuò)增引物為：
[0051]上游引物：5，-TGGCTTCGACGAGTTCAA-3，，
[0052]下游引物：5，-GGGCTGGGCACTATCTCTT-3，，
[0053] 其中下游引物的5'端進(jìn)行生物素標(biāo)記；
[0054] 測(cè)序引物：
[0055] 5'-GCTCTGGGTCTCAATG-3，。
[0056] 其中，質(zhì)控品（質(zhì)控品DNA)包括陽性對(duì)照品和陰性對(duì)照品，所述的陽性對(duì)照品為 含有PML-RARA(L form)和PML-RARA(S form)的質(zhì)粒的混合液；所述的陰性對(duì)照品作為陰 性對(duì)照，與陽性對(duì)照品相比，陰性對(duì)照品為不含PML-RARA(L form)和PML-RARA (S form)的 質(zhì)粒溶液。
[0057] 檢測(cè)方法包括如下步驟：
[0058] ( -）RNA提?。?br> [0059] 取20個(gè)APL患者的臨床樣本；1-20號(hào)患者的臨床樣本分別按照下面的步驟提取 RNA：
[0060] (1)淋巴細(xì)胞提?。喝⌒迈r全血2ml加Iml3wt%檸檬酸鈉，混勻后在4°C下 3000r/min離心10min，取血球?qū)由蠝\黃色層即為淋巴細(xì)胞，得到淋巴細(xì)胞液；
[0061] (2)取1個(gè)離心管（經(jīng)DEPC水處理）加入⑴中的淋巴細(xì)胞液150μ1，然后加 ImlTrizol，室溫放置5min，使其充分裂解；
[0062] (3) 12, 000r/min離心 5min，取上清；
[0063] (4)向上清中加入200μ1氯仿，劇振蕩混勻后室溫放置15min;
[0064] (5) 4°C12,OOOg下離心 15min;
[0065] (6)吸取上層水相，將水相轉(zhuǎn)移至另一離心管中；
[0066] (7)向水相中加入500μ1異丙醇混勻，室溫放置5?IOmin;
[0067] (8)4°C12,OOOg下離心IOmin,棄上清，RNA沉于管底；
[0068] (9)向步驟⑶的管中加入Iml75% (v/v)乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀；
[0069] (10) 4°C8,OOOg離心 5min，盡量棄上清；
[0070](11)室溫晾干或真空干燥5?IOmin ;
[0071] (12)用 50ulRNase-freedH20 溶解RNA樣品，55 ?6(TC，5 ?IOmin ;
[0072] (13)測(cè)OD值定量RNA濃度。
[0073] 按照上述步驟，分別獲得1-20號(hào)樣本的mRNA。
[0074](二）多重逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增：
[0075] 按照如下方法對(duì)上述的1-20號(hào)樣本的mRNA進(jìn)行多重逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增：
[0076] (l)cDNA第一鏈的合成
[0077] ①取一RNase-free的離心管，置于冰上，建立下列反應(yīng)體系；
[0078]TotalRNA 5 ~ 10μg/3μ1
[0079] Oligo(dT) 18Primer(0. 5μg/μI) 1μI
[0080] RNase-freedH20 加至 12μI
[0081] 輕輕混勻反應(yīng)液，用冷凍離心機(jī)稍微離心收集管壁上的反應(yīng)液到管底；
[0082] ②離心管于70°C溫育5分鐘，之后迅速取出置于冰中冷卻，用冷凍離心機(jī)稍微離 心收集管壁上的反應(yīng)液到管底；
[0083] ③將離心管放置于冰上，按順序加入以下反應(yīng)液；
[0084] 5Xreactionbuffer 4 μI
[0085]RNaseInhibitor(20U/μI) IμI
[0086] IOmMdNTPsMix 2 μI
[0087] 輕輕混勻反應(yīng)液，用冷凍離心機(jī)稍微離心收集管壁上的反應(yīng)液到管底；
[0088] ④離心管于37°C溫育5分鐘；
[0089]⑤加入 1μIRevertAidTMReverseTranscriptase(200U/μ1)，終體積為 20μ1;
[0090] ⑥離心管于42°C反應(yīng)60分鐘；
[0091] ⑦離心管于70°C加熱10分鐘終止反應(yīng)，之后迅速取出置于冰中冷卻。
[0092]如此，合成cDNA第一鏈，即模板cDNA(TemplatecDNA)。
[0093] (2)多重PCR
[0094] 采用的是QIAGEN公司的MultiplexPCR試劑盒，體系如下
[0095] TemplatecDNA或質(zhì)控丨丨丨丨'|DNA 10μ1 2xQlAGENMultiplexPCRMasterMix 25μI IOxPrimcrmix 5μ1 RNasc-IVcedHb〇 10μ1 終體積為50μ1
[0096]其中，2XQIAGENMultiplexPCRMasterMix中含熱啟動(dòng)TaqDNA酶、MgClJPdNTP Mix;10XPrimermix為包含上述三種融合基因引物對(duì)的混合物。
[0097]PCR擴(kuò)增程序：95°C15min;94°C30s，55?90s，72?90s，35 個(gè)循環(huán)；72°CIOmin; 4C保溫。
[0098] 通過上述步驟，獲得PCR產(chǎn)物。
[0099](三）焦磷酸測(cè)序
[0100] 首先，用微珠固定PCR產(chǎn)物，其主要是將生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物固定到鏈霉親和素 包被的瓊脂糖微珠（StreptavidinSepharoseHighPerformance)上，包括如下步驟： [0101] (1)輕搖包被鏈霉親和素的瓊脂糖微珠，直至獲得均質(zhì)溶液；
[0102] (2)在一個(gè)試管中混合鏈霉親和素包被的瓊脂糖微珠總量（2μ1/樣品）與結(jié)合緩 沖液（40μ1/樣品），添加超純水至一定體積，該體積與后續(xù)所要添加優(yōu)化好的生物素標(biāo)記 的PCR產(chǎn)物的體積的總和為80μ 1/孔；
[0103] (3)將⑵中得到的一定體積的溶液添加至24孔PCR孔板中；
[0104] (4)根據(jù)孔板設(shè)置，添加5?20μ1優(yōu)化好的生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物至PCR孔板的 每個(gè)孔槽，使其中每孔所含溶液為80μI;
[0105] (5)使用孔板條蓋密封PCR孔板，確保孔槽之間沒有泄漏；
[0106] (6)使用振蕩混合器（HOOrpm)不斷振蕩PCR孔板至少5?10分鐘。
[0107] 經(jīng)過上述步驟，生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物被固定到鏈霉親和素包被的瓊脂糖微珠 上。
[0108] 接著，開始真空工作站準(zhǔn)備工作，包括如下步驟：
[0109] (1)準(zhǔn)備以下試劑：大約50ml70% (v/v)乙醇；大約40ml變性溶液（QIAGEN公 司）；大約50mlIX洗滌緩沖液（QIAGEN公司））；大約50ml超純水；大約70ml超純水；
[0110] (2)打開真空泵：打開真空開關(guān)，進(jìn)行測(cè)試試驗(yàn)，以確定過濾探針是否正常工作；
[0111] (3)每次使用真空泵前要用超純水檢測(cè)過濾探針的通透性，將事先準(zhǔn)備好的裝好 超純水的離心管插在PCR裝置上，將過濾探針降入超純水中，超純水如在20秒內(nèi)被抽空則 表明過濾探針正常，可以使用，反之則需更換過濾探針；
[0112] (4)取下振蕩好的PCR孔板，將樣品放入PCR裝置中，小心降下過濾探針至PCR孔 板中，停留15秒；確保溶液全部被吸走，以捕獲含有固定模板的微珠；
[0113] (5)將真空裝置移至含有70% (v/v)乙醇的第一試劑槽，沖洗過濾探針5秒；
[0114] (6)將真空裝置移至含有變性溶液的第二試劑槽，沖洗過濾探針5秒；
[0115] (7)將真空裝置移至含有洗滌緩沖液的第三試劑槽，沖洗過濾探針10秒；
[0116] (8)抬高真空裝置超過90°垂線5秒，從過濾探針中排液；
[0117] (9)握持真空裝置到Q24孔板上，關(guān)閉裝置上的真空開關(guān)并懸空停留5秒，讓負(fù)壓 散去；
[0118] (10)通過左右輕搖真空裝置，釋放珠子至含3種測(cè)序引物的孔板中；
[0119] (11)在真空裝置關(guān)閉的情況下將真空裝置轉(zhuǎn)移至含有超純水的第四試劑槽，振蕩 10秒；
[0120] (12)降下探針至另一個(gè)含超純水的第五試劑槽中并施加真空，清洗探針，用70ml 超純水沖洗過濾探針；
[0121] (13)抬高真空裝置超過90°垂線5秒，從過濾探針中排液；
[0122] (14)關(guān)閉真空裝置上的開關(guān)，并將其置于靜止（P)位。
[0123] 如此變完成了真空站的準(zhǔn)備工作，接著開始分離DNA單鏈并將樣品釋放到 PyroMarkQ24孔板中，具體地包括如下步驟：
[0124] (1)將PyroMarkQ24孔板放置在預(yù)熱的孔板底座上80°C精確加熱2分鐘；
[0125] (2)從孔板底座上取下孔板，使樣本在室溫下至少冷卻5分鐘。
[0126] 經(jīng)過上述步驟，樣品被杯釋放到PyroMarkQ24孔板中。接著準(zhǔn)備PyroMarkQ24 試劑，按下述步驟進(jìn)行：
[0127] (1)打開PyroMarkQ24試劑盒并取出含有酶和底物凍干粉的小瓶，以及含有核苷 酸的試管；
[0128] (2)按照試劑盒說明書用超純水溶解并分裝酶和底物，所有試劑需恢復(fù)室溫后再 使用；
[0129] (3)依照電腦程序計(jì)算出的體積，向試劑倉(cāng)內(nèi)加入酶、底物和核苷酸A、T、G、C(試 劑倉(cāng)最多使用30次，試劑倉(cāng)在使用前必須是干燥的）。
[0130] 準(zhǔn)備好PyroMarkQ24試劑后，在PyroMarkQ24儀器上按下述步驟進(jìn)行測(cè)試：
[0131] (1)打開PyroMarkQ24 軟件，點(diǎn)擊newassay(新測(cè)試）一newAQassay(新 AQ測(cè)試）一在sequencetoanalyze(待分析序列）中輸入突變點(diǎn)序列，點(diǎn)擊Generate DispensationOrder(產(chǎn)生分配順序），點(diǎn)擊保存；
[0132] (2)點(diǎn)擊newrun(新運(yùn)行）一Instrumentmethod(儀器方法）一007,然后點(diǎn)擊 要測(cè)序的格子，點(diǎn)擊保存至U盤；
[0133] (3)將含有運(yùn)行文件的U盤插入儀器前面的USB端口中；
[0134] (4)把加熱好的孔板放到儀器上；
[0135] (5)將試劑倉(cāng)（酶、底物和核苷酸）的標(biāo)簽面面向自己放入儀器，打開孔板支座架 放入孔板，關(guān)閉孔板支座架和儀器蓋；
[0136] (6)選擇Run(運(yùn)行），并按OK ;
[0137] (7)在進(jìn)入Run(運(yùn)行）后，按select(選擇）選擇要運(yùn)行的文件；
[0138] (8)儀器運(yùn)行結(jié)束并確認(rèn)運(yùn)行文件已保存至U盤后，按close，取出U盤；
[0139] (9)打開儀器，取出試劑倉(cāng)，并對(duì)其進(jìn)行反復(fù)清洗，廢棄孔板；
[0140] (10)當(dāng)儀器不運(yùn)行時(shí)，從主菜單選擇shutdown(關(guān)機(jī)）并按OK;
[0141] (11)當(dāng)Itisnowsafetoturnofftheinstrument(現(xiàn)在可以安全關(guān)機(jī)）出現(xiàn) 時(shí)，即可關(guān)閉儀器，電源開關(guān)位于儀器后面。
[0142](四）結(jié)果分析：
[0143]打開PyromarkQ24 軟件，分析PML-RARA(Lform)和PML-RARA(Sform)融合基因 的類型，分析結(jié)果如下表：
[0144]

【權(quán)利要求】
1. 一種焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)PML-RARA融合基因的引物對(duì)，所述的PML-RARA為 PML-RARA(L form)和PML-RARA(S form)中的任意一種或兩種，其特征在于，所述引物對(duì)包 括： (1) 對(duì)于 PML-RARA (L form)基因， 擴(kuò)增引物為： 上游引物：5' -TGGATGGACCGCCTAGCC-3'， 下游引物：5 ' -GGCTTGTAGATGCGGGGTAG-3 '， 其中下游引物的5'端進(jìn)行生物素標(biāo)記； 測(cè)序引物為： 5，-GGCGCCGGGGAGGCA-3,; (2) 對(duì)于 PML-RARA (S form)基因： 擴(kuò)增引物為： 上游引物：5' -TGGCTTCGACGAGTTCAA-3'， 下游引物：5' -GGGCTGGGCACTATCTCTT-3'， 其中下游引物的5'端進(jìn)行生物素標(biāo)記； 測(cè)序引物： 5' -GCTCTGGGTCTCAATG-3'。
2. -種焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)PML-RARA融合基因的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含 如權(quán)利要求1所述的引物對(duì)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括質(zhì)控品，所述質(zhì)控品 包括陽性對(duì)照品和陰性對(duì)照品。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述的陽性對(duì)照品為含有PML-RARA(L form)和PML-RARA (S form)的質(zhì)粒的混合液，所述的陰性對(duì)照品為不含PML-RARA (L form) 和PML-RARA (S form)的質(zhì)粒溶液。
5. 權(quán)利要求1所述的引物對(duì)在制備檢測(cè)PML-RARA融合基因的試劑中的應(yīng)用。
6. 權(quán)利要求2或3所述的試劑盒在制備檢測(cè)PML-RARA融合基因的試劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104278092SQ201410510654
【公開日】2015年1月14日 申請(qǐng)日期:2014年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月28日
【發(fā)明者】邵棠, 陳慶, 李玲, 段彪 申請(qǐng)人:南京百捷生物科技有限公司