一種構(gòu)建橈足類全長cDNA文庫的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種構(gòu)建橈足類全長cDNA文庫的方法。本發(fā)明以少量橈足類個體為材料提取高質(zhì)量的RNA后，以Modified oligo dT為引物，反轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA；然后以橈足類的信使RNA反式剪接前導Spliced leader簡稱為SL的序列為基礎(chǔ)，設(shè)計正向簡并引物Copepod SL，以Modified oligo dT上接頭Adaptor序列為反向引物，以第一鏈cDNA為模板，進行25-35個循環(huán)的PCR擴增，經(jīng)過常規(guī)的連接轉(zhuǎn)化克隆過程，獲得該橈足類的全長cDNA文庫。本發(fā)明橈足類全長cDNA文庫構(gòu)建方法所需樣品量少，效率高，方法簡便，易于操作，適用于橈足類分子生態(tài)學研究，方便和促進功能基因的快速、準確篩選。
【專利說明】一種構(gòu)建橈足類全長cDNA文庫的方法
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種構(gòu)建橈足類全長CDNA文庫的方法。

【背景技術(shù)】
[0003]橈足類是廣泛存在于海洋和淡水環(huán)境中的小型甲殼動物。作為次級生產(chǎn)力的重要組成部分，橈足類是水生生態(tài)系統(tǒng)食物網(wǎng)中的重要環(huán)節(jié)，在初級生產(chǎn)者和更高營養(yǎng)級之間起著承上啟下的作用；另外，橈足類通過攝食、呼吸和排泄等過程成為微食物環(huán)的重要環(huán)節(jié)。對海洋學者來說，研究及預(yù)測海洋生物個體及更大尺度上對環(huán)境變化的響應(yīng)是一項極大的挑戰(zhàn)，而在分子水平上深入認識個體及群體的響應(yīng)是探究生物對環(huán)境變化適應(yīng)機制的關(guān)鍵。橈足類具有個體小，生命周期短、對環(huán)境變化敏感，生活史策略多樣，分布廣泛等特點，是研究各種重要生物過程分子機制的理想實驗生物。遺憾的是，由于橈足類基因組的復(fù)雜性，其基因信息非常匱乏，針對橈足類基因組結(jié)構(gòu)及基因表達調(diào)控機制的研究很少。
[0004]轉(zhuǎn)錄組測序研究是全基因組測序的替代手段。橈足類不同發(fā)育階段及應(yīng)對環(huán)境變化的轉(zhuǎn)錄組特征研究是認識其生活史和生理功能調(diào)控機制的關(guān)鍵。全長cDNA序列是鑒定基因功能所必須的。通過在線或本地的序列比對、編碼區(qū)預(yù)測、識別功能蛋白結(jié)構(gòu)域等方法可大大提高鑒定已知或未知蛋白編碼基因的幾率。當非模式生物或野外樣品轉(zhuǎn)錄組中大量序列與已報道的DNA數(shù)據(jù)庫中序列無明確匹配時，全長cDNA序列尤其重要。在前人的研究中已發(fā)現(xiàn)眼蟲、線蟲、扁形動物、刺胞動物、輪蟲、海鞘、甲藻等生物中存在信使RNA的剪接前導(Spliced leader, SL)反式剪接現(xiàn)象。由于SL序列在成熟的mRNA上普遍存在，為得到cDNA的全長序列提供了方便；同時SL序列具有譜系特異性，因此在涉及譜系特異性的轉(zhuǎn)錄組研究，尤其當目標種與其它生物共存時，SL序列是非常有用的工具。
[0005]構(gòu)建全長cDNA文庫是篩選功能基因全長cDNA序列的重要方法，是進行功能基因組學研究的基本手段。常規(guī)的構(gòu)建全長cDNA文庫的方法普遍存在材料用量多、耗時長、步驟繁瑣的特點。由于橈足類等小型甲殼動物個體小，單個體RNA含量少，常規(guī)的全長cDNA文庫構(gòu)建法通常需要幾千個個體，通過野外采樣的方法難以獲得足夠數(shù)量。另外，橈足類體表經(jīng)常有寄生性纖毛蟲，真菌類，藻類等生物附著，橈足類本身也攝食各種各樣的餌料生物,常規(guī)的cDNA文庫構(gòu)建方法無法排除這些生物的存在對橈足類cDNA文庫序列造成的污染。因此建立一種適用于橈足類的、可高效構(gòu)建全長cDNA文庫的方法將極大提高其功能基因組學研究的效率。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對上述【技術(shù)領(lǐng)域】的現(xiàn)狀，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建橈足類全長cDNA文庫的方法，以實現(xiàn)構(gòu)建橈足類全長cDNA文庫所需樣品量少，效率高，方法簡便，易于操作，適用于橈足類分子生態(tài)學研究，方便和促進功能基因的快速、準確篩選。
[0007]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案予以實現(xiàn):
一種構(gòu)建橈足類全長cDNA文庫的方法，具體步驟包括如下:
(1)橈足類RNA的提取:以橈足類個體為材料提取高質(zhì)量的RNA，所需橈足類個體少量即可；
(2)反轉(zhuǎn)錄:以Modifiedoligo dT為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈；
其中所述 cDNA 第一鏈的合成引物 Modified oligo dT: 5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)16VN-3’ ；
(3)PCR擴增:利用橈足類反式剪切前導序列SL設(shè)計正向引物Cop印odSL，與Modifiedoligo dT上接頭序列構(gòu)成的反向引物Adaptor組成引物對，以cDNA第一鏈為模板，PCR擴增25-35個循環(huán)；
其中所述橈足類反式剪切前導序列SL: 5’ -GTCTAAWACGACCAAGCTWAffffTTGCTTGATTCACTTCWWYAAGAG-3，;
其中PCR擴增體系引物組合包括如下:
所述正向引物 Cop印od SL: 5’ -GTCTAAWACGACCAAGCTWAffffTTGCTTGATTCACTTCWWYAAGA
G-3’
所述反向引物 Adaptor: 5，-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3，
(4)cDNA文庫的構(gòu)建:將PCR反應(yīng)產(chǎn)物回收進行常規(guī)的連接轉(zhuǎn)化克隆過程。
[0008]進一步的，上述構(gòu)建橈足類全長cDNA文庫的方法中，步驟(3)所述PCR擴增體系總體積為25 μ L，包括如下組分:
1XBuffer2.5 μ L
25mM dNTPs2 μ L
5 μ M Copepod SLI μ L
5 μ M AdaptorI μ L
2.5U/μ I Hot start Taq 0.2 μ L cDNA 模板IyL
超純水17.5 μ L
1XBuffer中含Mg2+, 2.5U/ μ I Hot start Taq酶的體積不列入擴增體系內(nèi)。
[0009]進一步的，上述構(gòu)建橈足類全長cDNA文庫的方法中，步驟(3)所述PCR擴增包括如下反應(yīng)程序:
第一階段，變性95°C，2min ；
第二階段，95°C/15s，68°C/30s，72°C/2.5min，5 個循環(huán)；
第三階段，95°C/15s，60°C/30s，72°C/2.5min，20-30 個循環(huán)；
第四階段，72° C，1min ；
第五階段，15° C保溫。
[0010]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比有許多優(yōu)點和積極效果:
1.所需樣品量少，可構(gòu)建單只橈足類的全長CDNA文庫，為研究橈足類個體對環(huán)境變化的響應(yīng)機制提供了重要工具；方法簡單，耗時短，合成cDNA第一鏈后，利用本發(fā)明中的特定引物對進行擴增，再將PCR產(chǎn)物進行常規(guī)的連接轉(zhuǎn)化克隆，即可完成文庫構(gòu)建。
[0011]2.本發(fā)明中所用的SL序列具有譜系特異性，當目標橈足類與環(huán)境中其它物種共同存在時，構(gòu)建SL-cDNA文庫可方便的獲取目標種的轉(zhuǎn)錄組信息。
[0012]3.SL- cDNA文庫中基因種類豐富，皆為全長序列，通過在線或本地的序列比對，編碼區(qū)預(yù)測，識別功能蛋白結(jié)構(gòu)域等方法可大大提高識別已知或未知蛋白編碼基因的幾率。
[0013]結(jié)合附圖閱讀本發(fā)明的【具體實施方式】后，本發(fā)明的其他特點和優(yōu)點將變得更加清
λ.Μ
/E.ο
[0014]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為使用本發(fā)明擴增太平洋紡錘水蚤dariia)的全長cDNA的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。
[0016]圖2為使用本發(fā)明獲得的太平洋紡錘水蚤無機焦磷酸酶(Inorganicpyrophosphatase)全長 cDNA 序列及 Blastx 結(jié)果。
[0017]圖3為使用本發(fā)明獲得的太平洋紡錘水蚤超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase)全長cDNA序列及Blastx結(jié)果。
[0018]圖4為使用本發(fā)明得到的太平洋紡錘水蚤cDNA文庫基因功能注釋分類(分子功能)圖。

【具體實施方式】
[0019]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步詳細的描述。
[0020]實施例1
利用上述方法快速高效的構(gòu)建了太平洋紡錘水蚤全長cDNA文庫，并基于NCBI數(shù)據(jù)庫和Blast2Go軟件對文庫進行了分析。具體步驟如下:
(一)橈足類RNA提取:
提取高質(zhì)量的橈足類總RNA，步驟簡述如下:
(I)樣品固定。橈足類樣品使用Trizol試劑在1.5ml離心管(a)中進行固定。
[0021](2)樣品勻漿。將管(a)中大部分Trizol轉(zhuǎn)移至離心管(b)中，用研磨棒勻漿樣品。將Trizol轉(zhuǎn)移回管(a)中，轉(zhuǎn)移過程中潤洗研磨棒，混勻后離心，上清液轉(zhuǎn)移至管(b)。再次研磨1-2次。
[0022](3)上清液轉(zhuǎn)移回管(a)中，加入200 μ I氯仿，渦旋混勻lmin, 4° C 1000g離心15min。
[0023](4)在管(C)加入等體積的苯酚/氯仿(體積比為5:2)的抽提液，將管(a)中上清液小心轉(zhuǎn)移到抽提液中，渦旋混勻，4° C 1000g離心5min。重復(fù)這一步驟2次，最后一次離心時溫度調(diào)整到室溫，得到粗RNA溶液。
[0024](5)在粗RNA溶液中加入等體積的100%乙醇，混勻，過柱子(Zymo)。
[0025](6) 350 μ I 的 prewash buffer 清洗柱子(Zymo)兩次。
[0026](7) 500 μ I 的 washing buffer 清洗柱子(Zymo)—次。
[0027](8) 40 μ IDEPC 水溶解 RNA。
[0028](9)使用 NanoDrop ? 2000C (Thermo Scientific)分光光度計測定 RNA 溶液濃度。
[0029](二)cDNA 第一鏈合成:
(1)在管中依次加入下述組分建立反應(yīng)體系:
RNA8μ L(l.5μ g)
dNTP Mix (1mM)I μ L
Modified oligo dT (100 μ M) I μ L
(2)65° C溫育5 min，冰上放置2min ；
(3)依次加入下述組分于上述10μ L混合體系中，并混勻，42°C溫育Ih ；
5XBuffer4 μ L
MgC12(25mM)4μ L
DEPC 水IyL
ImProm-1I ? Reverse Transcriptase IuL
(4)70°C，1min終止反應(yīng)，進行純化或保存在-20°C。
[0030](三)純化cDNA第一鏈
使用 DNA Clean & ConcentratorTM-25 Kit (Zymo)進行 cDNA 的純化。
[0031](四)橈足類全長cDNA的PCR擴增 PCR體系擴增組分比例如下:
10X Buffer(MgC12 plus)2.5 μ L
dNTPs(25mM)2 μ L
正向引物 Copepod SL (5 μ M) IyL 反向引物 Adaptor (5 μ M) IuL Hotstart Taq (2.5U/μ L)0.2 μ L
cDNA 模板IyL
超純水17.5yL
PCR擴增條件如下:95° C變性2分鐘；95° C變性15秒，68° C退火30秒，72° C延伸2.5分鐘，共計5個循環(huán)；95° C變性15秒，60° C退火30秒，72° C延伸2.5分鐘，共計20個循環(huán)；72°C延伸10分鐘；15°C保溫。
[0032]該過程循環(huán)數(shù)與起始RNA含量有關(guān):若RNA〈30ng，需反應(yīng)30個循環(huán)，若RNA30-300ng，需反應(yīng)25個循環(huán)，若RNA>300ng，則20個循環(huán)即可。
[0033](五)瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物
(I)凝膠電泳:制備濃度為1%的凝膠進行電泳。
[0034](2)切膠:在弱紫外光下將含有PCR產(chǎn)物的凝膠切下，置于離心管中。
[0035](3)在離心管中加入3倍體積的6M NaI溶液，放入恒溫金屬浴中55°C融化。
[0036](4)使用 DNA Clean & ConcentratorTM-25 Kit (Zymo)試劑盒進行純化。
[0037]圖1為使用本發(fā)明擴增太平洋紡錘水蚤的全長cDNA的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。
[0038](六)連接、轉(zhuǎn)化與克隆培養(yǎng)
使用Invitrogen Τ0Ρ0 cloning試劑盒進行膠回收產(chǎn)物連接、轉(zhuǎn)化與克隆培養(yǎng)。
[0039](七)質(zhì)粒提取與測序
克隆培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒DNA，并送至基因測序公司進行測序。
[0040](A)序列分析
結(jié)果顯示，使用本發(fā)明獲得了太平洋紡錘水蚤全長CDNA文庫中部分基因的全長CDNA序列。所得到的編號I無機焦磷酸酶的全長cDNA序列具體如序列表中序列I所示；所得到的編號2超氧化物歧化酶的全長cDNA序列具體如序列表中序列2所示。
[0041]圖2為使用本發(fā)明獲得的太平洋紡錘水蚤無機焦磷酸酶全長cDNA序列及Blastx結(jié)果。
[0042]圖3為使用本發(fā)明獲得的太平洋紡錘水蚤超氧化物歧化酶全長cDNA序列及Blastx 結(jié)果。
[0043]綜上所述，本發(fā)明建立了一種構(gòu)建橈足類全長cDNA文庫的方法，具體包括合成cDNA第一鏈的反轉(zhuǎn)錄引物和cDNA第一鏈進行PCR擴增的引物組合(Cop印od SL:5’-GTCTAAWACGACCAAGCTWAWWTTGCTTGATTCACTTCffffYAAGAG-3’、Adaptor:5’ -GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’)、PCR擴增組分和比例、PCR擴增程序三個方面。利用本技術(shù)已成功進行了包括太平洋紡錘水蚤、中華哲水蚤、背針胸刺水蚤等在內(nèi)的多種橈足類的全長cDNA文庫構(gòu)建，使用的橈足類數(shù)目1-100只不等，結(jié)果表明:本方法所需材料少，少量的橈足類即可完成文庫構(gòu)建；通過PCR反應(yīng)，可擴增cDNA中0.3-3kb的序列；通過質(zhì)?？寺y序，可得到上述橈足類位于細胞中不同部位，參與不同的分子功能和生物學過程的全長基因cDNA序列。這將為研究不同橈足類在環(huán)境壓力下的基因表達，進而研究其在分子水平上的適應(yīng)機制提供了重要基礎(chǔ)，必將大大推動橈足類基因組學和轉(zhuǎn)錄組學的研究。
[0044]以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其進行限制；盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，依然可以對前述實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明所要求保護的技術(shù)方案的精神和范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種構(gòu)建橈足類全長CDNA文庫的方法，其特征在于:具體步驟包括如下: (1)橈足類RNA的提取:以橈足類個體為材料提取高質(zhì)量的RNA，所需橈足類個體少量即可； (2)反轉(zhuǎn)錄:以Modifiedoligo dT為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈； 其中所述 cDNA 第一鏈的合成引物 Modified oligo dT: 5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)16VN-3’ ； (3)PCR擴增:利用橈足類反式剪切前導序列SL設(shè)計正向簡并引物Cop印od SL，與Modified oligo dT上的Adaptor組成引物對，以cDNA第一鏈為模板，PCR擴增25-35個循環(huán)； 其中所述橈足類反式剪切前導序列SL序列為:5’-GTCTAAWACGACCAAGCTWAWWTTGCTTGATTCACTTCWWYAAGAG-3，; 其中PCR擴增體系引物組合包括如下: 所述正向簡并引物 Cop印od SL 序列為:5’-GTCTAAWACGACCAAGCTWAWWTTGCTTGATTCACTTCWWYAAGAG-3， 所述反向引物 Adaptor 序列為:5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’ (4)cDNA文庫的構(gòu)建:將PCR反應(yīng)產(chǎn)物回收進行常規(guī)的連接轉(zhuǎn)化克隆等過程。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種構(gòu)建橈足類全長cDNA文庫的方法，其特征在于:所述步驟(3)中PCR擴增體系的總體積為25 μ L，包括如下組分: 1XBuffer2.5 μ L 25mM dNTPs2 μ L 5 μ M Copepod SLI μ L 5 μ M AdaptorI μ L
2.5U/μ L Hot start Taq 0.2 μ L
cDNA 模板IyL
超純水 17.5 μ L
1XBuffer 中含 Mg2+。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種構(gòu)建橈足類全長cDNA文庫的方法，其特征在于:所述步驟(3) PCR擴增包括如下反應(yīng)程序: 第一階段，變性95°C，2min ； 第二階段，95°C/15s，68°C/30s，72°C/2.5min，5 個循環(huán)； 第三階段，95°C/15s，60°C/30s，72°C/2.5min，20-30 個循環(huán)； 第四階段，72° C，1min ； 第五階段，15° C保溫。
【文檔編號】C12N15/10GK104278023SQ201410496556
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月25日
【發(fā)明者】劉光興, 張寰, 楊菲菲, 徐東暉, 黃有松, 衣曉燕 申請人:中國海洋大學