一種與非吸煙女性肺癌輔助診斷相關(guān)的snp標(biāo)志物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程及腫瘤醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，公開了一種與非吸煙女性肺癌輔助診斷相關(guān)的SNP標(biāo)志物及其應(yīng)用。該標(biāo)志物為rs10051970、rs10087140、rs10483845、rs11233751、rs11643408、rs11732247、rs1255485、rs12612657、rs1535271、rs166402、rs16935064、rs17040797、rs17073021、rs17623941、rs17670695、rs2550911、rs40395、rs4454390、rs4640379等25個SNP的組合。該標(biāo)志物可用于制備非吸煙女性肺癌輔助診斷試劑盒。
【專利說明】一種與非吸煙女性肺癌輔助診斷相關(guān)的SNP標(biāo)志物及其應(yīng) 用 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程及腫瘤醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及非吸煙女性肺癌輔助診斷相關(guān)的SNP 標(biāo)志物及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致人類死亡最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率增長 迅速，尤其在女性中，近年來流行病學(xué)調(diào)查顯示女性肺癌發(fā)病率上升超過了男性。據(jù)國際癌 癥研究署（IARC)估計，在女性人群中，2012年肺癌新發(fā)病例58. 3萬人，死亡49. 1萬人，位 居全球范圍內(nèi)腫瘤發(fā)病率第四和死亡率第二。由于環(huán)境污染、生活方式的改變，長期暴露于 環(huán)境煙草煙霧廚房油煙等，近二十年來，我國女性人群，尤其是家庭主婦的肺癌發(fā)病率顯著 上升，僅2000年至2005年間，中國女性肺癌患者從12萬增至17萬，增加了 38. 4%，據(jù)估 計，2012年我國女性肺癌發(fā)病率為20. 4/10萬，死亡率為18. 0/10萬，超過發(fā)達(dá)的工業(yè)化國 家水平。由此可見，肺癌是威脅全球及我國女性生命和健康的重要疾病之一，是亟待解決的 重大公共衛(wèi)生問題。
[0003] 目前，對肺癌的一級預(yù)防（病因預(yù)防）尚無明確、有效的預(yù)防措施，但如果能加強(qiáng) 二級預(yù)防，做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療，則可以明顯改善疾病預(yù)后，提高肺癌患者的5年 生存率。因此，爭取早期診斷是肺癌防治的重點。目前肺癌早期診斷的方法主要有影像學(xué) 檢查（胸部X線檢查、胸部CT、核磁共振、正電子發(fā)射計算機(jī)體層掃描）、微創(chuàng)介入檢查（支 氣管鏡檢、熒光纖維支氣管鏡檢、超聲纖維支氣管鏡檢等）、痰液脫落細(xì)胞學(xué)檢查、腫瘤生物 標(biāo)記等。但是現(xiàn)在臨床常用的胸部X線、胸部CT和纖維支氣管鏡檢存在一些弊端。胸部X 線檢查難以發(fā)現(xiàn)，或難以鑒定局部粘膜上較小的腫瘤；胸部CT不能確定病變的性質(zhì)，可能 存在假陽性或假陰性。纖維支氣管鏡檢對腫瘤的浸潤深度、有無轉(zhuǎn)移了解不清。另外目前 臨床所用肺癌標(biāo)志物的特異性不強(qiáng)，血清癌胚抗原（CEA)在肺癌早期多不增高，對診斷意 義不大。病理活組織檢查作為肺癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，雖然在臨床肺癌確診中居于重要地位，但 由于需要有創(chuàng)取活檢組織，不適宜作為臨床健康篩查的手段。
[0004] 盡管主動吸煙為肺癌的主要病因已經(jīng)得到證實，但其不足以解釋非吸煙肺癌患者 的流行病學(xué)特征，而女性肺癌多以非吸煙者為主，肺腺癌為主要病理類型。肺癌家庭聚集性 的研究顯示，遺傳因素在非吸煙女性肺癌的發(fā)生中同樣扮演重要角色。雙生子研究表明，肺 癌是遺傳與環(huán)境共同作用的結(jié)果，同等環(huán)境暴露下，具有不同遺傳背景的個體對肺癌的易 感性不同。其中單核苷酸多態(tài)（single nucleotide polymorphism, SNP)起重要作用。SNP 是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異引起的DNA序列多態(tài)性，它是人類可遺傳的變異 中最常見的一種。SNP的存在賦予了個體不同的表型性狀，以及對于環(huán)境暴露、藥物治療等 因素的不同反應(yīng)性，因此SNP可能是導(dǎo)致個體對常見疾病發(fā)病和預(yù)后易感性差異的重要遺 傳基礎(chǔ)。利用疾病易感的SNP譜診斷疾病的發(fā)生，靈敏、準(zhǔn)確和快速，具有廣闊的應(yīng)用前景。 近年來，利用SNP診斷疾病的發(fā)生發(fā)展已經(jīng)成為臨床和科研工作者的研究熱點，在腫瘤和 心腦血管疾病等常見重大疾病的應(yīng)用價值已初見端倪。
[0005] 然而，目前還沒有將SNP應(yīng)用于非吸煙女性肺癌診斷的報道，若能篩選出非吸煙 女性肺癌易感的SNP作為生物標(biāo)志物，并研制相應(yīng)的診斷試劑盒，對我國非吸煙女性肺癌 診斷現(xiàn)狀必將是一次有力的推動，也為其藥物篩選、藥效評價及靶向治療開辟了新的途徑。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對上述技術(shù)問題，提出一種與非吸煙女性肺癌輔助診斷相關(guān)的 SNP標(biāo)志物及其應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的第二個目的是提供上述SNP標(biāo)志物的特異性引物。
[0008] 本發(fā)明的第三個目的是提供上述SNP標(biāo)志物及其特異性引物在制備非吸煙女性 肺癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明第四個目的是提供非吸煙女性肺癌輔助診斷試劑盒。
[0010] 發(fā)明人通過分離和研究非吸煙女性肺癌患者及與其年齡匹配的非吸煙女性健康 對照外周血DNA中的單核苷酸多態(tài)性，尋找一組與非吸煙女性肺癌高度相關(guān)的高特異性和 敏感性的SNP，并研制出可便于臨床應(yīng)用的非吸煙女性肺癌輔助診斷試劑盒，為非吸煙女性 肺癌的篩查和診斷提供數(shù)據(jù)支持，為發(fā)現(xiàn)具有潛在治療價值的新型小分子藥物提供數(shù)據(jù)支 持。
[0011] 本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0012] 一種與非吸煙女性肺癌輔助診斷相關(guān)的SNP標(biāo)志物，該標(biāo)志物為rsl0051970、 rsl0087140、rsl0483845、rsll233751、rsll643408、rsll732247、rsl255485、rsl2612657、 rsl535271、 rsl66402、 rsl6935064、 rsl7040797、 rsl7073021、 rsl7623941、 rsl7670695、 rs2550911、rs40395、rs4454390、rs4640379、rs4812681、rs6438722、rs7692314、 rs7755507、rs796102 和 rs8182116 的組合。
[0013] 所述的SNP標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物，該引物為：
[0014] rsl0051970 的引物序列為 SEQ ID No :1 和 SEQ ID NO :2 ;
[0015] rsl0087140 的引物序列為 SEQ ID No :4 和 SEQ ID No :5 ;
[0016] rsl0483845 的引物序列為 SEQ ID No :7 和 SEQ ID No :8 ;
[0017] rsll233751 的引物序列為 SEQ ID No :10 和 SEQ ID No :11 ;
[0018] rsll643408 的引物序列為 SEQ ID No :13 和 SEQ ID No :14 ;
[0019] rsll732247 的引物序列為 SEQ ID No :16 和 SEQ ID No :17 ;
[0020] rsl255485 的引物序列為 SEQ ID No :19 和 SEQ ID No :20 ;
[0021] rsl2612657 的引物序列為 SEQ ID No :22 和 SEQ ID No :23 ;
[0022] rsl535271 的引物序列為 SEQ ID No :25 和 SEQ ID No :26 ;
[0023] rs 166402 的引物序列為 SEQ ID No : 28 和 SEQ ID No : 29 ;
[0024] rsl6935064 的引物序列為 SEQ ID No :31 和 SEQ ID No :32 ;
[0025] rsl7040797 的引物序列為 SEQ ID No :34 和 SEQ ID No :35 ;
[0026] rsl7073021 的引物序列為 SEQ ID No :37 和 SEQ ID No :38 ;
[0027] rsl7623941 的引物序列為 SEQ ID No :40 和 SEQ ID No :41 ;
[0028] rsl7670695 的引物序列為 SEQ ID No :43 和 SEQ ID No :44 ;
[0029] rs2550911 的引物序列為 SEQ ID No :46 和 SEQ ID No :47 ;
[0030] rs40395 的引物序列為 SEQ ID No :49 和 SEQ ID No :50 ;
[0031] rs4454390 的引物序列為 SEQ ID No :52 和 SEQ ID No :53 ;
[0032] rs4640379 的引物序列為 SEQ ID No :55 和 SEQ ID No :56 ;
[0033] rs4812681 的引物序列為 SEQ ID No :58 和 SEQ ID No :59 ;
[0034] rs6438722 的引物序列為 SEQ ID No :61 和 SEQ ID No :62 ;
[0035] rs7692314 的引物序列為 SEQ ID No :64 和 SEQ ID No :65 ;
[0036] rs7755507 的引物序列為 SEQ ID No :67 和 SEQ ID No :68 ;
[0037] rs796102 的引物序列為 SEQ ID No :70 和 SEQ ID No :71 ;
[0038] rs8182116 的引物序列為 SEQ ID No :73 和 SEQ ID No :74。
[0039] 所述的SNP標(biāo)志物的特異性延伸引物，該引物為：
[0040] rsl0051970 的引物序列為 SEQ ID NO :3 ;rsl0087140 的引物序列為 SEQ ID N0:6;rsl0483845 的引物序列為 SEQ ID N0:9;rsll233751 的引物序列為 SEQ ID NO: 12 ;rsl 1643408 的引物序列為 SEQ ID NO: 15 ;rsl 1732247 的引物序列為 SEQ ID NO: 18;rsl255485 的引物序列為 SEQ ID N0:21;rsl2612657 的引物序列為 SEQ ID NO: 24;rsl535271 的引物序列為 SEQ ID N0:27;rsl66402 的引物序列為 SEQ ID N0:30; rsl6935064 的引物序列為 SEQ ID N0:33;rsl7040797 的引物序列為 SEQ ID N0:36; rsl7073021 的引物序列為 SEQ ID N0:39;rsl7623941 的引物序列為 SEQ ID N0:42; rsl7670695的引物序列為SEQIDN0:45;rs2550911 的引物序列為SEQIDN0:48;rs40395 的引物序列為SEQ ID NO :51 ;rs4454390的引物序列為SEQ ID NO :54 ;rs4640379的引物 序列為SEQ ID NO :57 ;rs4812681的引物序列為SEQ ID NO :60 ;rs6438722的引物序列為 SEQ ID N0:63;rs7692314 的引物序列為 SEQ ID N0:66;rs7755507 的引物序列為 SEQ ID NO :69 ;rs796102 的引物序列為 SEQ ID NO :72 ;rs8182116 的引物序列為 SEQ ID NO :75。
[0041] 所述的SNP標(biāo)志物在制備非吸煙女性肺癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0042] 所述的SNP標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物在制備非吸煙女性肺癌輔助診斷試劑盒中 的應(yīng)用。
[0043] 所述的SNP標(biāo)志物的特異性延伸引物在制備非吸煙女性肺癌輔助診斷試劑盒中 的應(yīng)用。
[0044] 一種非吸煙女性肺癌輔助診斷試劑盒，該試劑盒用于檢測外周血DNA中 rsl0051970、rsl0087140、rsl0483845、rsll233751、rsll643408、rsll732247、rsl255485、 rsl2612657、rsl535271、rsl66402、rsl6935064、rsl7040797、rsl7073021、rsl7623941、 rsl7670695、rs2550911、rs40395、rs4454390、rs4640379、rs4812681、rs6438722、 rs7692314、rs7755507、rs796102 和 rs8182116。
[0045] 所述的診斷試劑盒，該試劑盒含有上述特異性擴(kuò)增引物和/或特異性延伸引物。
[0046] 所述診斷試劑盒，該試劑盒還包括PCR技術(shù)常用的試劑，如Taq酶、dNTP混合液、 Mgcl2溶液、去離子水等；還可以含有標(biāo)準(zhǔn)品和/或?qū)φ掌贰?br> [0047] 具體地說，本發(fā)明解決問題的技術(shù)方案包括：（1)建立統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)本庫和數(shù)據(jù) 庫：以標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人口學(xué)資料和臨床 資料。（2)基因型檢測：選擇非吸煙女性肺癌病例及與其年齡匹配的非吸煙女性健康對照， 利用高密度SNP芯片，在全基因組范圍內(nèi)找出與非吸煙女性肺癌相關(guān)的SNP。（3)對篩選出 的陽性關(guān)聯(lián)SNP，進(jìn)一步在另外的樣本中進(jìn)行檢測，以判斷其關(guān)聯(lián)的穩(wěn)定性。（4)非吸煙女 性肺癌輔助診斷試劑盒的研制：根據(jù)非吸煙女性肺癌病例和非吸煙女性健康對照中基因型 分布頻率有顯著差異的SNP開發(fā)SNP輔助診斷試劑盒。
[0048] 本發(fā)明人以標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人口 學(xué)資料、臨床資料等，并采用了 Affymetrix6. 0芯片進(jìn)行全基因組掃描，SequenomMassARRAY 基因分型進(jìn)行單個位點的檢測等。
[0049] 具體來說研究的實驗方法主要包括以下幾個部分：
[0050] 1.研究樣本的選擇
[0051] (1)臨床確診為非吸煙女性肺癌；
[0052] (2)與病例年齡匹配的非吸煙女性健康對照；
[0053] 本研究共采用1822例符合標(biāo)準(zhǔn)的樣本進(jìn)行研究。
[0054] 2.酚-氯仿法提取外周血基因組DNA，按常規(guī)方法操作。通常能得到20_50ng/y 1 DNA，純度（紫外2600D與2800D比值）在1. 6-2. 0。
[0055] 3. Affymetrix 6. 0 芯片檢測
[0056] (1)取受試者全基因組DNA樣本；
[0057] (2)在Affymetrix 6.0芯片（購于美國昂飛公司，下同）上進(jìn)行全基因組掃描；
[0058] (3)檢測并比較各基因型在非吸煙女性肺癌病例與健康對照中的分布差異。
[0059] 4.單個 SNP 的 Sequenom MassARRAY 基因分型
[0060] (1)取受試者DNA樣本；
[0061] (2)設(shè)計單個SNP的特異性引物；
[0062] (3)進(jìn)行 PCR 反應(yīng)；
[0063] (4)檢測并比較非吸煙女性肺癌病例與健康對照中不同基因型的分布差異。
[0064] 5.診斷試劑盒制備方法
[0065] Affymetrix6. 0芯片進(jìn)行全基因組掃描和單個SNP檢測后確定非吸煙女性肺 癌病例與健康對照中基因型分布頻率有顯著差異的SNP，作為非吸煙女性肺癌診斷的指 標(biāo)。最后篩選出的與非吸煙女性肺癌發(fā)病有關(guān)的SNP組成輔助診斷試劑盒（rsl0051970、 rsl0087140、rsl0483845、rsll233751、rsll643408、rsll732247、rsl255485、rsl2612657、 rsl535271、rsl66402、rsl6935064、rsl7040797、rsl7073021、rsl7623941、rsl7670695、 rs2550911、rs40395、rs4454390、rs4640379、rs4812681、rs6438722、rs7692314、 rs7755507、rs796102和rs8182116)。診斷試劑可以包括這些SNP的特異性引物和Taq酶、 dNTP 等。
[0066] 6.統(tǒng)計分析方法
[0067] 運用X 2檢驗（用于分類變量）或者student t檢驗（用于連續(xù)性變量）比較人 口學(xué)特征等在研究對象組間分布的差異。用logistic回歸分析中的additive模型進(jìn)行關(guān) 聯(lián)分析。
[0068] 為了進(jìn)一步研究這25個SNP構(gòu)成的綜合指征用于早期診斷的效果，我們構(gòu)建了 一個數(shù)學(xué)公式，綜合考慮每個SNP與非吸煙女性肺癌發(fā)病的正、負(fù)關(guān)聯(lián)情況和聯(lián)系強(qiáng)度。 具體來說，我們對每個SNP的三種基因型進(jìn)行評分，野生純合型="0"，雜合型="1"，變 異純合型="2"，以單個SNP分析時的additive模型下的回歸系數(shù)為權(quán)重，綜合考慮每 個SNP的情況給每個研究對象確定一個危險分值。危險分值的計算方法如下：危險分值 = (0· 66Xrs 10051970 的評分）+ (0· 58Xrs 10087140 的評分）+ (0· 63Xrs 10483845 的評 分）+ (0· 70Xrsl 1233751 的評分）+ (-L 19Xrsl 1643408 的評分）+ (0· 69Xrsl 1732247 的 評分）+ (〇· 71Xrsl255485 的評分）+ (0· 62Xrsl2612657 的評分）+ (0· 55Xrsl535271 的 評分）+ (〇· 82Xrsl66402 的評分）+ (0· 81Xrsl6935064 的評分）+ (0· 58Xrsl7040797 的 評分）+ (〇· 82Xrsl7073021 的評分）+ (0· 53Xrsl7623941 的評分）+ (0· 70Xrsl7670695 的評分）+ (〇. 56 X rs2550911 的評分）+ (0. 52 X rs40395 的評分）+ (0. 55 X rs4454390 的 評分）+ (〇· 80Xrs4640379 的評分）+ (0· 61Xrs4812681 的評分）+ (0· 72Xrs6438722 的 評分）+ (〇· 79Xrs7692314 的評分）+ (0· 84Xrs7755507 的評分）+ (0· 55Xrs796102 的評 分）+ (0.78Xrs8182116的評分），獲得的危險分值系數(shù)以及界限值被直接應(yīng)用于全基因組 關(guān)聯(lián)研究的796例樣本中。（以rsl0051970為例：0. 66為rsl0051970的回歸系數(shù)（見表 I) ;rsl0051970的評分，野生純合型= "0"，雜合型="1"，變異純合型="2"，某個SNP的基 因型由儀器檢測結(jié)果確定；某個樣本的總評分是這些個SNP分別評分的總和，單個SNP的基 因型只是計算評分的一個中間過程，不需要知道具體基因型。）
[0069] 統(tǒng)計學(xué)分析均通過專門的統(tǒng)計學(xué)分析軟件完成（PLINK1. 07)。統(tǒng)計學(xué)顯著性水平 P值設(shè)為〇. 05,所有統(tǒng)計學(xué)檢驗均為雙側(cè)檢驗。
[0070] 以下是本發(fā)明進(jìn)一步的說明：
[0071] 在上述228例符合條件的非吸煙女性肺癌病例及568例非吸煙女性健康對照中， 兩組年齡均衡可比。我們將這兩組人群經(jīng)Affymetrixe. 0芯片進(jìn)行全基因組掃描獲得相關(guān) 結(jié)果。
[0072] 根據(jù)Affymetrixe.O芯片檢測，本發(fā)明人檢測到在"非吸煙女性肺癌病例"組 和"非吸煙女性健康對照"組中基因型分布頻率存在差異的SNP包括：rsl0051970、 rsl0087140、rsl0483845、rsll233751、rsll643408、rsll732247、rsl255485、rsl2612657、 rsl535271、rsl66402、rsl6935064、rsl7040797、rsl7073021、rsl7623941、rsl7670695、 rs2550911、rs40395、rs4454390、rs4640379、rs4812681、rs6438722、rs7692314、 rs7755507、rs796102 和 rs8182116。
[0073] 根據(jù)上述檢測結(jié)果，我們將這25個與非吸煙女性肺癌發(fā)病相關(guān)的SNP在另外502 例非吸煙女性肺癌病例和與其年齡匹配的524例非吸煙女性健康對照中進(jìn)行了單個SNP的 檢測，結(jié)果與芯片檢測一致。
[0074] 單因素和多因素 Logistic回歸分析結(jié)果均表明，這25個SNP與非吸煙女性肺癌 的發(fā)病存在著顯著關(guān)聯(lián)。
[0075] 進(jìn)一步分析這25個SNP的組合用于非吸煙女性肺癌診斷的效果，發(fā)現(xiàn)其組合能夠 很好的區(qū)分病例與對照。
[0076] 根據(jù)上述實驗結(jié)果，本發(fā)明人制備了一種能用于非吸煙女性肺癌輔助診斷的試劑 盒，包含測定受試者血標(biāo)本DNA中上述SNP的特異性引物和其他檢測試劑。
[0077] 具體而言，這25個SNP的組合，或者這25個SNP的特異性引物的組合構(gòu)成的相關(guān) 診斷試劑盒有助于非吸煙女性肺癌的輔助診斷，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確掌握患者的疾病狀態(tài) 和病情嚴(yán)重程度，及時采取更具個性化的防治方案提供支持。
[0078] 本發(fā)明有益效果：
[0079] 本發(fā)明提供的SNP標(biāo)志物作為非吸煙女性肺癌輔助判斷的標(biāo)志物的優(yōu)越性在于：
[0080] (I)SNP是一種新型基因生物標(biāo)志物，區(qū)別于傳統(tǒng)生物標(biāo)志物，穩(wěn)定、微創(chuàng)、易于檢 測，將大大提高疾病診斷的敏感性和特異性，該類生物標(biāo)志物的成功開發(fā)將為非吸煙女性 肺癌的診斷和治療開創(chuàng)全新局面，為其他疾病生物標(biāo)志物的研制提供借鑒。
[0081] (2) SNP試劑盒是一種系統(tǒng)、全面的診斷試劑盒，可用于非吸煙女性肺癌的輔助診 斷，有助于反映患者的疾病狀態(tài)，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確掌握患者病情、及時采取更具個性化 的防治方案提供支持。
[0082] (3)采用嚴(yán)密的驗證和評價體系，本發(fā)明人初期采用全基因組芯片掃描以獲取疾 病相關(guān)的SNP譜，并應(yīng)用Sequenom MassARRAY基因分型方法在大樣本中進(jìn)行了驗證；以上 方法和策略的應(yīng)用加速和保證了 SNP生物標(biāo)志物和診斷試劑盒在臨床上的應(yīng)用，也為其他 疾病生物標(biāo)志物的研制提供方法和策略上的借鑒。
[0083] 本發(fā)明通過控制年齡等對疾病發(fā)展可能的影響因素，研究SNP在非吸煙女性肺癌 輔助診斷的應(yīng)用前景，闡述SNP對于非吸煙女性肺癌進(jìn)展的影響，揭示其診斷價值。因此， 本發(fā)明獲得了非吸煙女性肺癌發(fā)病相關(guān)SNP譜和特異性標(biāo)志物；通過SNP生物標(biāo)志物和診 斷試劑盒的研制和應(yīng)用，可使得非吸煙女性肺癌的診斷更加方便易行，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn) 確掌握患者病情，為臨床治療效果評價奠定基礎(chǔ)，并為發(fā)現(xiàn)具有潛在治療價值的新型小分 子藥物靶標(biāo)提供幫助。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0084] 圖1 :顯示全基因組關(guān)聯(lián)研究病例組和對照組的ROC曲線。
[0085] 顯示非吸煙女性肺癌病例組對健康對照組為參照的ROC曲線。

【具體實施方式】
[0086] 實施例1樣品的收集和樣品資料的整理
[0087] 發(fā)明人于2005月4月開始至2011年12月從南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院和江蘇 省腫瘤醫(yī)院收集了大量的非吸煙女性肺癌患者血標(biāo)本，通過對樣品資料的整理，發(fā)明人從 中選擇了 1822例符合下列標(biāo)準(zhǔn)的樣本全基因組芯片掃描和單個SNP Sequenom MassARRAY 基因分型的實驗樣品：
[0088] 1、病理組織學(xué)確診的非吸煙女性肺癌患者；
[0089] 2、與病例年齡匹配的非吸煙女性健康對照；
[0090] 并系統(tǒng)采集了這些樣本的人口學(xué)資料和臨床資料等情況。
[0091] 實施例2外周血DNA中SNP的全基因組掃描
[0092] 在上述符合條件的228例非吸煙女性肺癌患者和568例非吸煙女性健康對照中， 兩組年齡匹配。將這兩組人群經(jīng)Affymetrixe. 0芯片檢測獲得相關(guān)結(jié)果。具體步驟為：
[0093] 1、向儲存于2ml凍存管中的外周血加入溶血試劑（即裂解液，40份量配置方法如 下：蔗糖219. 72g、氯化鎂2. 02g和曲拉通X-100 (amresco 0694) 20ml混合后，用TrisHcl溶 液定容至2000ml，下同），顛倒混勻后完全轉(zhuǎn)入。
[0094] 2、去除紅細(xì)胞：用溶血試劑將5ml離心管補(bǔ)至4ml，顛倒混勻，4000rpm離心10分 鐘，棄上清。向沉淀中加入4ml溶血試劑，再次顛倒混勻清洗一次，4000rpm離心10分鐘，棄 上清。
[0095] 3、抽提DNA :向沉淀中加 Iml抽提液（每300ml中含有122. 5ml 0.2M氯化鈉， 14. 4ml 0.5M乙二胺四乙酸，15ml 10%十二燒基硫酸鈉，148. Iml雙蒸水，下同）和8μ1蛋 白酶Κ，震蕩器上充分震蕩混勻，37°C水浴過夜。
[0096] 4、去除蛋白質(zhì)：加 Iml飽和酚充分混勻（手輕搖15分鐘），4000rpm離心10分鐘， 取上清轉(zhuǎn)入新的5ml離心管中。在上清液中加入等體積氯仿與異戊醇混合液（氯仿：異戊 醇=24 :1，v/v，下同），充分混勻后（手搖15分鐘），4000rpm離心10分鐘，取上清（分入 兩個I. 5ml的離心管）。
[0097] 5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸鈉 60 μ 1，再加入與上清液等體積的冰無水 乙醇，上下輕搖，可見白色絮狀沉淀物，再以12000rpm離心lOmin。
[0098] 6、DNA洗漆：在沉淀中加入冰無水乙醇1ml，12000rpm離心IOmin,棄上清后真空抽 干或置于清潔干燥環(huán)境中蒸干。
[0099] 7、測量濃度：通常能得到20-50ng/ μ I DNA，純度（紫外2600D與2800D比值）在 1. 6~2, 0〇
[0100] 8、進(jìn)行全基因組掃描：在Affymetrix 6. O芯片（購于美國昂飛公司，下同）上進(jìn) 行全基因組掃描。
[0101] 9、數(shù)據(jù)分析與處理：在"非吸煙女性肺癌病例"組和"非吸煙女性健康對照"組中 發(fā)現(xiàn)的基因型分布頻率有顯著差異的SNP在上文中已經(jīng)羅列出，結(jié)果見表1。
[0102] 表1病例組與對照組全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果
[0103]
[0104]

【權(quán)利要求】
1. 一種與非吸煙女性肺癌輔助診斷相關(guān)的SNP標(biāo)志物，其特征在于該標(biāo)志物為 rsl0051970、rsl0087140、rsl0483845、rsll233751、rsll643408、rsll732247、rsl255485、 rsl2612657、rsl535271、rsl66402、rsl6935064、rsl7040797、rsl7073021、rsl7623941、 rsl7670695、rs2550911、rs40395、rs4454390、rs4640379、rs4812681、rs6438722、 rs7692314、rs7755507、rs796102 和 rs8182116 的組合。
2. 權(quán)利要求1所述的SNP標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物，其特征在于該引物為： rsl0051970 的引物序列為 SEQ ID No :1 和 SEQ ID NO :2 ; rsl0087140 的引物序列為 SEQ ID No :4 和 SEQ ID No :5 ; rsl0483845 的引物序列為 SEQ ID No :7 和 SEQ ID No :8 ; rsll233751 的引物序列為 SEQ ID No :10 和 SEQ ID No :11 ; rsll643408 的引物序列為 SEQ ID No :13 和 SEQ ID No :14 ; rsll732247 的引物序列為 SEQ ID No :16 和 SEQ ID No :17 ; rsl255485 的引物序列為 SEQ ID No :19 和 SEQ ID No :20 ; rsl2612657 的引物序列為 SEQ ID No :22 和 SEQ ID No :23 ; rsl535271 的引物序列為 SEQ ID No :25 和 SEQ ID No :26 ; rs 166402 的引物序列為 SEQ ID No :28 和 SEQ ID No :29 ; rsl6935064 的引物序列為 SEQ ID No :31 和 SEQ ID No :32 ; rsl7040797 的引物序列為 SEQ ID No :34 和 SEQ ID No :35 ; rsl7073021 的引物序列為 SEQ ID No :37 和 SEQ ID No :38 ; rsl7623941 的引物序列為 SEQ ID No :40 和 SEQ ID No :41 ; rsl7670695 的引物序列為 SEQ ID No :43 和 SEQ ID No :44 ; rs2550911 的引物序列為 SEQ ID No :46 和 SEQ ID No :47 ; rs40395 的引物序列為 SEQ ID No :49 和 SEQ ID No :50 ; rs4454390 的引物序列為 SEQ ID No :52 和 SEQ ID No :53 ; rs4640379 的引物序列為 SEQ ID No :55 和 SEQ ID No :56 ; rs4812681 的引物序列為 SEQ ID No :58 和 SEQ ID No :59 ; rs6438722 的引物序列為 SEQ ID No :61 和 SEQ ID No :62 ; rs7692314 的引物序列為 SEQ ID No :64 和 SEQ ID No :65 ; rs7755507 的引物序列為 SEQ ID No :67 和 SEQ ID No :68 ; rs796102 的引物序列為 SEQ ID No :70 和 SEQ ID No :71 ; rs8182116 的引物序列為 SEQ ID No :73 和 SEQ ID No :74。
3. 權(quán)利要求1所述的SNP標(biāo)志物的特異性延伸引物，其特征在于該引物為： rs 10051970 的引物序列為 SEQ ID NO:3 ;rs 10087140 的引物序列為 SEQ ID NO: 6 ;rsl0483845 的引物序列為 SEQ ID NO :9 ;rsll233751 的引物序列為 SEQ ID NO : 12 ;rsl 1643408 的引物序列為 SEQ ID NO :15 ;rsl 1732247 的引物序列為 SEQ ID NO: 18;rsl255485 的引物序列為 SEQ ID N0:21;rsl2612657 的引物序列為 SEQ ID NO: 24;rsl535271 的引物序列為SEQIDN0:27;rsl66402 的引物序列為SEQIDN0:30; rsl6935064 的引物序列為SEQIDN0:33;rsl7040797 的引物序列為SEQIDN0:36; rsl7073021 的引物序列為SEQIDN0:39;rsl7623941 的引物序列為SEQIDN0:42; rsl7670695的引物序列為SEQIDN0:45;rs2550911 的引物序列為SEQIDN0:48;rs40395 的引物序列為SEQ ID NO :51 ;rs4454390的引物序列為SEQ ID NO :54 ;rs4640379的引物 序列為SEQ ID NO :57 ;rs4812681的引物序列為SEQ ID NO :60 ;rs6438722的引物序列為 SEQIDN0:63;rs7692314 的引物序列為SEQIDN0:66;rs7755507 的引物序列為SEQID NO :69 ;rs796102 的引物序列為 SEQ ID NO :72 ;rs8182116 的引物序列為 SEQ ID NO :75。
4. 權(quán)利要求1所述的SNP標(biāo)志物在制備非吸煙女性肺癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
5. 權(quán)利要求2所述的SNP標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物在制備非吸煙女性肺癌輔助診斷試 劑盒中的應(yīng)用。
6. 權(quán)利要求3所述的SNP標(biāo)志物的特異性延伸引物在制備非吸煙女性肺癌輔助診斷試 劑盒中的應(yīng)用。
7. -種非吸煙女性肺癌輔助診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒用于檢測外周血DNA中 rsl0051970、rsl0087140、rsl0483845、rsll233751、rsll643408、rsll732247、rsl255485、 rsl2612657、rsl535271、rsl66402、rsl6935064、rsl7040797、rsl7073021、rsl7623941、 rsl7670695、rs2550911、rs40395、rs4454390、rs4640379、rs4812681、rs6438722、 rs7692314、rs7755507、rs796102 和 rs8182116。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒含有權(quán)利要求2所述的特 異性擴(kuò)增引物和/或權(quán)利要求3所述的特異性延伸引物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒還包括PCR技術(shù)常用的 試劑。
【文檔編號】C12N15/11GK104293919SQ201410470274
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月15日
【發(fā)明者】沈洪兵, 胡志斌, 靳光付, 馬紅霞, 戴俊程, 朱猛 申請人:南京醫(yī)科大學(xué)