一種與散發(fā)型非綜合征型chd輔助診斷相關(guān)的低頻snv標(biāo)志物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程及生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，公開了一種與散發(fā)型非綜合征型CHD輔助診斷相關(guān)的低頻SNV標(biāo)志物及其應(yīng)用。該標(biāo)志物為rs75423398、rs7527798、rs200531164、rs6756629、rs139026854、rs79043251、rs1801212、rs4956145、rs7689099、rs145248317、rs34525648、rs16891235、rs13194053、rs41269281、rs41270593、rs3130250、rs3130379等41個(gè)低頻SNV的組合。該標(biāo)志物可用于制備散發(fā)型非綜合征型先天性心臟病輔助診斷試劑盒。
【專利說明】一種與散發(fā)型非綜合征型CHD輔助診斷相關(guān)的低頻SNV標(biāo) 志物及其應(yīng)用 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程及生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種與散發(fā)型非綜合征型CHD輔助診 斷相關(guān)的低頻SNV標(biāo)志物及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 先天性心臟?。╟ongenital heart disease, CHD)是由于心臟、血管在胚胎發(fā)育過 程中的障礙所致的心臟、血管形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能、代謝上的異常。在眾多出生缺陷中，CHD占 28%左右，是一種最為常見的先天性疾病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的資料，普遍認(rèn)為CHD的發(fā)病 率在足月、活產(chǎn)的新生兒為0. 60%?0. 80%，在早產(chǎn)、死產(chǎn)或流產(chǎn)的病例中發(fā)病率則更高。 據(jù)測(cè)算，我國(guó)每年新增CHD病例超過13萬例，CHD已成為我國(guó)圍產(chǎn)兒第一位高發(fā)畸形。自 2000年起，圍產(chǎn)期CHD發(fā)生率呈快速上升趨勢(shì)，2011年全國(guó)CHD發(fā)生率為2000年的3. 56 倍。同時(shí)，CHD也是造成嬰幼兒死因或殘疾的主要原因之一，它不但嚴(yán)重危害兒童生存和生 活質(zhì)量，影響家庭幸福和諧，也會(huì)造成巨大的潛在壽命損失和社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
[0003] 流行病學(xué)研究證明，綜合征型的CHD(syndromic CHD)占患者總數(shù)的25%左右，其 余為非綜合征型CHD(non_syndromic CHD)，即表現(xiàn)為心血管畸形而不伴其他系統(tǒng)畸形。非 綜合征型CHD在人群中多數(shù)呈散發(fā)，根據(jù)左、右兩側(cè)心臟及大血管之間有無分流，可分為3 大類：左向右分流型（潛伏青紫型）、右向左分流型（青紫型）、無分流型（無青紫型）。左 向右分流型主要包括：VSD、PDA、ASD等。右向左分流型主要包括：法洛四聯(lián)癥和大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位 等。無分流型主要包括：肺動(dòng)脈口狹窄和主動(dòng)脈縮窄等。引起散發(fā)型非綜合征型CHD的原 因很多，包括孕母感染風(fēng)疹病毒、接觸環(huán)境致畸物、孕期用藥、母體疾病、孕婦吸煙、嗜酒、吸 毒、染色體異常、單基因突變以及多基因缺陷等。值得注意的是，71%患兒可存活到生育年 齡以后，因此，CHD，尤其是散發(fā)型非綜合征型CHD已成為影響我國(guó)兒童身心健康及人口生 存質(zhì)量的重大公共衛(wèi)生問題。
[0004] 目前，先天性心臟病的診斷方法主要為病史詢問、體格檢查、影像學(xué)檢查（彩色多 普勒超聲心動(dòng)圖、X線、多層螺旋CT、磁共振成像）、心導(dǎo)管檢查和心血管造影、放射性核素 心血管造影顯像及心電圖等。然而，現(xiàn)在臨床常用的檢查仍存在一些弊端：多層螺旋CT及X 線對(duì)人體存在一定的輻射危害，不能作為CHD的一線影像檢查途徑；磁共振成像時(shí)間長(zhǎng)（至 少需要30分鐘），檢查噪聲大，且病人的移動(dòng)對(duì)圖像質(zhì)量的影響很大，故不適用于不能合作 的兒童；放射性核素心血管造影注射技術(shù)要求高；心導(dǎo)管檢查及心血管造影作為CHD診斷 的金標(biāo)準(zhǔn)，在臨床先心病確診中居于重要地位，但其屬于有創(chuàng)檢查，操作復(fù)雜，有一定的手 術(shù)風(fēng)險(xiǎn)性，存在引起肺水腫的可能，因此不適合作為常規(guī)篩查手段。
[0005] 心臟發(fā)育是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，其關(guān)鍵時(shí)期為受孕后2?8周，經(jīng)歷了心管形 成、環(huán)化、內(nèi)部分隔、血管連接等過程，每個(gè)階段都受到許多重要基因和信號(hào)通路的調(diào)控。 研究表明，遺傳因素是散發(fā)型非綜合征型CHD的重要病因，其中單核苷酸變異（single nucleotide variant, SNV)起著重要作用。SNV是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異一 A，T，C或G的改變而引起的DNA序列的改變，造成包括人類在內(nèi)的物種之間染色體基因組 的多樣性，是人類可遺傳變異中最常見的一種。SNV的存在被認(rèn)為賦予了個(gè)體不同的表型 性狀，以及對(duì)于環(huán)境暴露、藥物治療等因素的不同反應(yīng)性。SNV包括常見遺傳變異（common variants)和低頻遺傳變異（rare variants),前者最小等位基因頻率>5%，為低外顯率 突變，而后者的最小等位基因頻率< 5%，為高外顯率突變。研究發(fā)現(xiàn)，人類基因組中低頻遺 傳變異的數(shù)目遠(yuǎn)超過常見遺傳變異，并且，低頻遺傳變異能解釋常見復(fù)雜疾病中相當(dāng)大一 部分的遺傳貢獻(xiàn)。因此低頻高外顯性遺傳變異可能是導(dǎo)致個(gè)體對(duì)常見疾病發(fā)病和預(yù)后易感 性差異的重要遺傳基礎(chǔ)。利用疾病易感的低頻高外顯性遺傳標(biāo)志物譜診斷疾病的發(fā)生，靈 敏、準(zhǔn)確和快速，具有廣闊的應(yīng)用前景。近年來，利用低頻高外顯性遺傳標(biāo)志物診斷疾病的 發(fā)生發(fā)展已經(jīng)成為臨床和科研工作者的研究熱點(diǎn)，在腫瘤和心血管疾病等常見重大疾病的 應(yīng)用價(jià)值已初見端倪。
[0006] 然而，目前還沒有將低頻高外顯性遺傳標(biāo)志物應(yīng)用于散發(fā)型非綜合征型先天性心 臟病診斷的報(bào)道，若能篩選出散發(fā)型非綜合征型先天性心臟病易感的低頻高外顯性遺傳標(biāo) 志物作為生物標(biāo)志物，并研制相應(yīng)的診斷試劑盒，對(duì)我國(guó)散發(fā)型非綜合征型先天性心臟病 診斷現(xiàn)狀必將是一次有力的推動(dòng)，也為其藥物篩選、藥效評(píng)價(jià)及靶向治療開辟了新的途徑。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是針對(duì)上述技術(shù)問題，提出一種與散發(fā)型非綜合征型先天性心臟病 輔助診斷相關(guān)的低頻高外顯性遺傳標(biāo)志物及其應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述低頻高外顯性遺傳標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物。
[0009] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述低頻高外顯性遺傳標(biāo)志物的特異性延伸引物。
[0010] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供上述低頻高外顯性遺傳標(biāo)志物及其特異性擴(kuò)增引物 和特異性延伸引物在制備散發(fā)性非綜合征型先天性心臟病輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明第五個(gè)目的是提供散發(fā)型非綜合征型先天性心臟病輔助診斷試劑盒。
[0012] 發(fā)明人通過分離和研究散發(fā)型非綜合征型先天性心臟病患者及與其年齡、性別匹 配的健康對(duì)照外周血DNA中的單核苷酸多態(tài)性，尋找一組與散發(fā)型非綜合征型先天性心臟 病高度相關(guān)的高特異性和敏感性的低頻SNV，并研制出可便于臨床應(yīng)用的散發(fā)型非綜合征 型先天性心臟病輔助診斷試劑盒，為散發(fā)型非綜合征型先天性心臟病的篩查和診斷提供數(shù) 據(jù)支持，為發(fā)現(xiàn)具有潛在治療價(jià)值的新型小分子藥物提供數(shù)據(jù)支持。
[0013] 本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0014] 一種與散發(fā)型非綜合征型先天性心臟病輔助診斷相關(guān)的低頻高外顯性遺傳 標(biāo)志物，該標(biāo)志物為 rs75423398、rs7527798、rs200531164、rs6756629、rsl39026854、 rs79043251、rsl801212、rs4956145、rs7689099、rsl45248317、rs34525648、rsl6891235、 rsl3194053、rs41269281、rs41270593、rs3130250、rs3130379、rs3130785、rs2523480、 rs2524276、rs743400、rsl40770834、rs213212、rs498114、rs45504893、rsl42301665、 rsl42508708、rsl45591245、rsl99643484、rsll07947、rsl326331、rs3781411、rs4353250、 rsl0830430、 rs200700939、 rsl0139931、 rsl87319098、 rsl624825、 rsl49543099、 rs79298157 和 rs9978445 的組合。
[0015] 所述的低頻高外顯性遺傳標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物，這些引物為：
[0016] rs75423398 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:l 和 SEQ ID No:2 ;rs7527798 的擴(kuò)增 引物序列為SEQ ID No:4和SEQ ID No:5;rs200531164的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:7和 SEQIDNo:8;rs6756629 的擴(kuò)增引物序列為SEQIDNo:10和SEQIDNo:ll;rsl39026854 的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No: 13和SEQ ID No: 14 ;rs79043251的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:16和SEQIDNo:17;rsl801212的擴(kuò)增引物序列為SEQIDNo:19和SEQIDNo:20 ; rs4956145 的擴(kuò)增引物序列為SEQIDNo:22和SEQIDNo:23;rs7689099 的擴(kuò)增引物序列 為 SEQ ID No:25 和 SEQ ID No:26 ;rsl45248317 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:28 和 SEQ ID No:29;rs34525648 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:31 和 SEQ ID No:32;rsl6891235 的 擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:34和SEQ ID No:35 ;rsl3194053的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:37 和 SEQ ID No:38 ;rs41269281 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:40 和 SEQ ID No:41; rs41270593的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:43和SEQ ID No:44;rs3130250的擴(kuò)增引物序列 為 SEQ ID No:46 和 SEQ ID No:47 ;rs3130379 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:49 和 SEQ ID No:50;rs3130785 的擴(kuò)增引物序列為SEQIDNo:52和SEQIDNo:53;rs2523480 的擴(kuò)增引 物序列為SEQ ID No:55和SEQ ID No:56 ;rs2524276的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:58和 SEQ ID No:59;rs743400 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:61 和 SEQ ID No:62;rsl40770834 的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:64和SEQ ID No:65;rs213212的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:67 和 SEQ ID No:68;rs498114 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:70 和 SEQ ID No:71; rs45504893的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:73和SEQ ID No:74;rsl42301665的擴(kuò)增引物序 列為 SEQ ID No:76和 SEQ ID No:77 ;rsl42508708 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:79和 SEQ ID No:80;rsl45591245 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:82 和 SEQ ID No:83;rsl99643484 的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:85和SEQ ID No:86;rsll07947的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:88 和 SEQ ID No:89;rsl326331 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:91 和 SEQ ID No:92; rs3781411的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:94和SEQ ID No:95;rs4353250的擴(kuò)增引物序列 為 SEQ ID No:97和 SEQ ID No:98;rsl0830430 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:100和 SEQ ID No:101;rs200700939 的擴(kuò)增引物序列為SEQIDNo:103和SEQIDNo:104;rsl0139931 的 擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:106和SEQ ID No:107;rsl87319098的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:109和 SEQ ID No:110;rsl624825 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:112和 SEQ ID No:113; rsl49543099 的擴(kuò)增引物序列為SEQIDNo:115和SEQIDNo:116;rs79298157 的擴(kuò)增引 物序列為 SEQ ID No: 118 和 SEQ ID No: 119 ;rs9978445 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No: 121 和 SEQ ID No:122。
[0017] 所述的低頻高外顯性遺傳標(biāo)志物的特異性延伸引物，這些引物為：
[0018] rs75423398的延伸引物序列為SEQ ID No:3 ;rs7527798的延伸引物序列為SEQ ID No:6 ;rs200531164的延伸引物序列為SEQ ID No:9 ;rs6756629的延伸引物序列為SEQ ID No: 12 ;rsl39026854的延伸引物序列為SEQ ID No: 15 ;rs79043251的延伸引物序列為SEQ ID No:18 ;rsl801212的延伸引物序列為SEQ ID No:21 ;rs4956145的延伸引物序列為SEQ ID No:24;rs7689099的延伸引物序列為SEQ ID No:27;rsl45248317的延伸引物序列為 SEQ ID No:30;rs34525648的延伸引物序列為SEQ ID No:33;rsl6891235的延伸引物序列 為SEQ ID No:36;rsl3194053的延伸引物序列為SEQ ID No:39;rs41269281的延伸引物序 列為SEQ ID No:42 ;rs41270593的延伸引物序列為SEQ ID No:45 ;rs3130250的延伸引物 序列為SEQ ID No:48;rs3130379的延伸引物序列為SEQ ID No:51;rs3130785的延伸引物 序列為SEQ ID No:54;rs2523480的延伸引物序列為SEQ ID No:57;rs2524276的延伸引物 序列為SEQ ID No:60 ;rs743400的延伸引物序列為SEQ ID No:63 ;rsl40770834的延伸引 物序列為SEQ ID No:66;rs213212的延伸引物序列為SEQ ID No:69;rs498114的延伸引物 序列為 SEQ ID No:72 ;rs45504893 的延伸引物序列為 SEQ ID No:75 ;rsl42301665 的延伸 引物序列為 SEQ ID No:78;rsl42508708 的延伸引物序列為 SEQ ID No:81 ;rsl45591245 的 延伸引物序列為SEQ ID No:84;rsl99643484的延伸引物序列為SEQ ID No:87;rsll07947 的延伸引物序列為SEQ ID No:90;rsl326331的延伸引物序列為SEQ ID No:93;rs3781411 的延伸引物序列為SEQ ID No:96;rs4353250的延伸引物序列為SEQ ID No:99;rsl0830430 的延伸引物序列為SEQ ID No:102 ;rs200700939的延伸引物序列為SEQ ID No:105; rsl0139931的延伸引物序列為SEQ ID No:108;rsl87319098的延伸引物序列為SEQ ID No: 111 ;rs 1624825的延伸引物序列為SEQ ID No: 114 ;rs 149543099的延伸引物序列為SEQ ID No:117;rs79298157的延伸引物序列為SEQ ID No:120;rs9978445的延伸引物序列為 SEQ ID No:123。
[0019] 所述的低頻高外顯性遺傳標(biāo)志物在制備散發(fā)型非綜合征型先天性心臟病輔助診 斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0020] 所述的低頻高外顯性遺傳標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物在制備散發(fā)型非綜合征型先 天性心臟病輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0021] 所述的低頻高外顯性遺傳標(biāo)志物的特異性延伸引物對(duì)在制備散發(fā)型非綜合征型 先天性心臟病輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0022] -種散發(fā)型非綜合征型先天性心臟病輔助診斷試劑盒，該試劑盒用于檢測(cè)外周 血 DNA 中 rs75423398、rs7527798、rs200531164、rs6756629、rsl39026854、rs79043251、 rsl801212、rs4956145、rs7689099、rsl45248317、rs34525648、rsl6891235、rsl3194053、 rs41269281、rs41270593、rs3130250、rs3130379、rs3130785、rs2523480、rs2524276、 rs743400、rsl40770834、rs213212、rs498114、rs45504893、rsl42301665、rsl42508708、 rsl45591245、rsl99643484、rsll07947、rsl326331、rs3781411、rs4353250、rsl0830430、 rs200700939、rsl0139931、rsl87319098、rsl624825、rsl49543099、rs79298157 和 rs9978445〇
[0023] 所述的診斷試劑盒，該試劑盒含有上述特異性擴(kuò)增引物和/或特異性延伸引物。
[0024] 所述診斷試劑盒，該試劑盒還可以包括PCR反應(yīng)常用的酶和試劑，如Taq酶、dNTP 混合液、Mgcl2溶液、去離子水等；還可以含有標(biāo)準(zhǔn)品和/或?qū)φ掌贰?br> [0025] 具體地說，本發(fā)明解決問題的技術(shù)方案包括：（1)建立統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)本庫(kù)和數(shù)據(jù) 庫(kù)：以標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人口學(xué)資料和臨床 資料。（2)基因型檢測(cè)：選擇散發(fā)型非綜合征型先天性心臟病病例，與散發(fā)型非綜合征型先 天性心臟病病例年齡、性別匹配的對(duì)照，利用高密度低頻高外顯性遺傳標(biāo)志物芯片，在全外 顯子范圍內(nèi)找出與散發(fā)型非綜合征型先天性心臟病相關(guān)的低頻高外顯性遺傳標(biāo)志物。（3) 對(duì)篩選出的陽(yáng)性關(guān)聯(lián)低頻遺傳標(biāo)志物，進(jìn)一步采用Sequenom MassARRAY基因分型平臺(tái)進(jìn)行 檢測(cè)，以驗(yàn)證將其應(yīng)用于診斷的可重復(fù)性。（4)散發(fā)型非綜合征型先天性心臟病輔助診斷試 劑盒的研制：根據(jù)散發(fā)型非綜合征型先天性心臟病病例和健康對(duì)照中基因型分布頻率有顯 著差異的低頻高外顯性遺傳標(biāo)志物開發(fā)輔助診斷試劑盒。
[0026] 本發(fā)明人以標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人 口 學(xué)資料、臨床資料等，并米用了 IlluminaInrmiuinKHuman Exome Beadchip (Illumina Inc. , San Diego, CA)芯片進(jìn)行全外顯子區(qū)掃描，初篩陽(yáng)性位點(diǎn)米用Sequenom MassARRAY 時(shí)間飛行質(zhì)譜生物芯片系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證。
[0027] 具體來說研究的實(shí)驗(yàn)方法主要包括以下幾個(gè)部分：
[0028] 1.研究樣本的選擇
[0029] (1)經(jīng)超聲心動(dòng)圖、心臟導(dǎo)管插入術(shù)或手術(shù)明確診斷的非綜合征型先天性心臟病 患者；
[0030] (2)排除合并其他器官先天異常、染色體異?；颊撸?br> [0031] (3)排除一級(jí)親屬患先心病、母親患有糖尿病、苯丙酮尿癥、母親孕期接觸致畸物 (如農(nóng)藥或有機(jī)溶劑）及服用藥物的患者；
[0032] (4)與病例年齡、性別匹配的對(duì)照；
[0033] 本研究共采用7937例符合標(biāo)準(zhǔn)的樣本進(jìn)行研究。
[0034] 2.酚-氯仿法提取外周血基因組DNA，按常規(guī)方法操作。通常能得到20-50ng/y 1 DNA，純度（紫外2600D與2800D比值）在1. 6-2. 0。
[0035] 3. Illumina InHnium? Human Exome Beadchip (IIlumina Inc. , San Diego, CA) 芯片檢測(cè)
[0036] (I)取受試者全基因組DNA樣本；
[0037] (2)在 Illumina ΙιιΠιι?ιπ--3? Human Exome Beadchip (I I lumina Inc. , San Diego, CA)芯片上進(jìn)行全外顯子區(qū)掃描；
[0038] (3)檢測(cè)并比較各基因型在散發(fā)型非綜合征型先天性心臟病病例與健康對(duì)照中的 分別差異。
[0039] 4. Sequenom MassARRAY 基因分型檢測(cè)
[0040] (1)取受試者DNA樣本；
[0041] (2)設(shè)計(jì)遺傳標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物和特異性延伸引物；
[0042] (3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)及產(chǎn)物純化；
[0043] (4)進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)及產(chǎn)物純化；
[0044] (5)檢測(cè)并比較散發(fā)型非綜合征型先天性心臟病病例與健康對(duì)照中不同基因型的 分布差異。
[0045] 5.診斷試劑盒制備方法
[0046] Illumina Infinium O RHuman Exome BeadChip (Illumina Inc. , San Diego, CA) 芯片進(jìn)行全外顯子組掃描和單個(gè)遺傳標(biāo)志物檢測(cè)后確定散發(fā)型非綜合征型先天性心臟病 病例與健康對(duì)照中基因型分布頻率有顯著差異的低頻遺傳標(biāo)志物，作為散發(fā)型非綜合征型 先天性心臟病診斷的指標(biāo)。最后篩選出的與散發(fā)型非綜合征型先天性心臟病發(fā)病有關(guān)的 低頻遺傳標(biāo)志物組成輔助診斷試劑盒（rs75423398、rs7527798、rs200531164、rs6756629、 rsl39026854、rs79043251、rsl801212、rs4956145、rs7689099、rsl45248317、rs34525648、 rsl6891235、rsl3194053、rs41269281、rs41270593、rs3130250、rs3130379、rs3130785、 rs2523480、rs2524276、rs743400、rsl40770834、rs213212、rs498114、rs45504893、 rsl42301665、 rsl42508708、 rsl45591245、 rsl99643484、 rsll07947、 rsl326331、 rs3781411、rs4353250、rsl0830430、rs200700939、rsl0139931、rsl87319098、rsl624825、 rsl49543099、rs79298157和rs9978445)。診斷試劑可以包括這些遺傳標(biāo)志物的特異性擴(kuò) 增引物和/或特異性延伸引物，以及Taq酶、dNTP等試劑。
[0047] 6.統(tǒng)計(jì)分析方法
[0048] 運(yùn)用X 2檢驗(yàn)（用于分類變量）或者student t檢驗(yàn)（用于連續(xù)性變量）比較人 口學(xué)特征等在研究對(duì)象組間分布的差異。用logistic回歸分析中的additive模型進(jìn)行關(guān) 聯(lián)分析。
[0049] 為了進(jìn)一步研究這41個(gè)低頻高外顯性遺傳標(biāo)志物構(gòu)成的綜合指征用于早期診 斷的效果，我們構(gòu)建了一個(gè)數(shù)學(xué)公式，綜合考慮每個(gè)低頻SNV與散發(fā)型非綜合征型先天 性心臟病發(fā)病的正、負(fù)關(guān)聯(lián)情況和聯(lián)系強(qiáng)度。具體來說，我們對(duì)每個(gè)低頻遺傳標(biāo)志物的 三種基因型進(jìn)行評(píng)分，野生純合型="0"，雜合型="1"，變異純合型="2"，以單個(gè)遺傳 標(biāo)志物分析時(shí)的additive模型下的回歸系數(shù)為權(quán)重，綜合考慮每個(gè)低頻遺傳標(biāo)志物的 情況給每個(gè)研究研究對(duì)照確定一個(gè)危險(xiǎn)分值。危險(xiǎn)分值的計(jì)算方法如下：危險(xiǎn)分值= (0· 973Xrs75423398 的評(píng)分）+ (0· 446Xrs7527798 的評(píng)分）+ (1. 027Xrs200531164 的評(píng) 分）+ (0· 848Xrs6756629 的評(píng)分）+ (0· 834Xrsl39026854 的評(píng)分）+ (0· 842Xrs79043251 的評(píng)分）+ (2. 150Xrsl801212 的評(píng)分）+ (0· 443Xrs4956145 的評(píng)分）+ (1. 094Xrs7689099 的評(píng)分）+ (2. 207Xrsl45248317 的評(píng)分）+ (1. 334Xrs34525648 的評(píng) 分）+ (0· 738Xrsl6891235 的評(píng)分）+ (0· 499Xrsl3194053 的評(píng)分）+ (1. 334Xrs41269281 的 評(píng)分）+ (〇· 521 X rs41270593 的評(píng)分）+ (0· 730 X rs3130250 的評(píng)分）+ (0· 501 X rs3130379 的 評(píng)分）+ (〇· 534Xrs3130785 的評(píng)分）+ (0· 742Xrs2523480 的評(píng)分）+ (L 024Xrs2524276 的 評(píng)分）+ (1. 596Xrs743400 的評(píng)分）+ (0· 691Xrsl40770834 的評(píng)分）+ (0· 494Xrs213212 的 評(píng)分）+ (〇· 558Xrs498114 的評(píng)分）+ (0· 940Xrs45504893 的評(píng)分）+ (0· 488Xrsl42301665 的評(píng)分）+ (0.798Xrsl42508708 的評(píng)分）+ (2. 208Xrsl45591245 的評(píng) 分）+ (1. 254Xrsl99643484 的評(píng)分）+ (1. 016Xrsl 107947 的評(píng)分）+ (2. 026Xrsl326331 的 評(píng)分）+ (〇· 406Xrs3781411 的評(píng)分）+ (0· 613Xrs4353250 的評(píng)分）+ (1. 113Xrsl0830430 的評(píng)分）+ (1. 173Xrs200700939 的評(píng)分）+ (0.418Xrsl0139931 的評(píng) 分）+ (1. 671Xrsl87319098 的評(píng)分）+ (1. 662Xrsl624825 的評(píng)分）+ (0· 997Xrsl49543099 的評(píng)分）+ (〇. 619Xrs79298157的評(píng)分）+ (0. 395Xrs9978445的評(píng)分），獲得的危險(xiǎn)分值系 數(shù)以及界限值被直接應(yīng)用于使用外顯子芯片進(jìn)行全外顯子區(qū)掃描的3937例樣本中。（以 rs75423398為例：0. 973為rs75423398的回歸系數(shù)（見表I) ;rs75423398的評(píng)分，野生純 合型="〇"，雜合型="1"，變異純合型="2"，某個(gè)SNV的基因型由儀器檢測(cè)結(jié)果確定；某 個(gè)樣本的總評(píng)分是這些個(gè)SNV分別評(píng)分的總和，單個(gè)SNV的基因型只是計(jì)算評(píng)分的一個(gè)中 間過程，不需要知道具體基因型。）
[0050] 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均通過專門的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件完成（PLINK1. 07)。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性水平 P值設(shè)為〇. 05,所有統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)。
[0051] 以下是本發(fā)明進(jìn)一步的說明：
[0052] 在上述984例符合條件的散發(fā)型非綜合征型先天性心臟病病例及2953例健康對(duì) 照中，兩組年齡、性別均衡可比。我們將這兩組人群經(jīng)Illumina Infmium? Human Exome Beadchip (Illumina Inc, San Diego, CA)芯片進(jìn)行全外顯子區(qū)掃描獲得相關(guān)結(jié)果。
[0053] 根據(jù) Illumina 丨nfiriium? Human Exome Beadchip (Illumina Inc, San Diego, CA) 芯片檢測(cè)，本發(fā)明人檢測(cè)到在"散發(fā)型非綜合征型先天性心臟病病例"組和"健康對(duì)照"組 中基因型分布頻率存在差異的遺傳標(biāo)志物包括：rs75423398、rs7527798、rs200531164、 rs6756629、rsl39026854、rs79043251、rsl801212、rs4956145、rs7689099、rsl45248317、 rs34525648、rsl6891235、rsl3194053、rs41269281、rs41270593、rs3130250、rs3130379、 rs3130785、rs2523480、rs2524276、rs743400、rsl40770834、rs213212、rs498114、 rs45504893、rsl42301665、rsl42508708、rsl45591245、rsl99643484、rsll07947、 rsl326331、rs3781411、rs4353250、rsl0830430、rs200700939、rsl0139931、rsl87319098、 rsl624825、rsl49543099、rs79298157 和 rs9978445。
[0054] 根據(jù)上述檢測(cè)結(jié)果，我們將這41個(gè)與散發(fā)型非綜合征型先天性心臟病發(fā)病相 關(guān)的低頻遺傳標(biāo)志物在另外2000例散發(fā)型非綜合征型先天性心臟病病例和與其年齡、 性別匹配的2000例健康對(duì)照中在Sequenom MassARRAY基因分型平臺(tái)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果與 Illumina Infinium? Human Exome Beadchip (Illumina Inc, San Diego, CA)芯片檢測(cè)一致。
[0055] 單因素和多因素 Logistic回歸分析結(jié)果均表明，這41個(gè)低頻遺傳標(biāo)志物與散發(fā) 型非綜合征型先天性心臟病的發(fā)病存在著顯著關(guān)聯(lián)。
[0056] 進(jìn)一步分析這41個(gè)低頻遺傳標(biāo)志物的組合用于散發(fā)型非綜合征型先天性心臟病 診斷的效果，發(fā)現(xiàn)其組合能夠很好的區(qū)分病例與對(duì)照。
[0057] 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明人制備了一種能用于散發(fā)型非綜合征型先天性心臟病 輔助診斷的試劑盒，包含測(cè)定受試者血標(biāo)本DNA中上述低頻遺傳標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引 物、特異性延伸引物和其他檢測(cè)試劑。
[0058] 具體而言，這41個(gè)低頻遺傳標(biāo)志物的組合，或者這41個(gè)低頻遺傳標(biāo)志物的特異性 擴(kuò)增引物及特異性延伸引物的組合構(gòu)成的相關(guān)診斷試劑盒有助于散發(fā)型非綜合征型先天 性心臟病的輔助診斷，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確掌握患者的疾病狀態(tài)和病情嚴(yán)重程度，及時(shí)采 取更具個(gè)性化的防治方案提供支持。
[0059] 本發(fā)明有益效果：
[0060] 本發(fā)明提供的低頻高外顯性遺傳標(biāo)志物遺傳標(biāo)志物作為散發(fā)型非綜合征型先天 性心臟病輔助判斷的標(biāo)志物的優(yōu)越性在于：
[0061] (1)低頻高外顯性遺傳標(biāo)志物是一種新型基因生物標(biāo)志物，區(qū)別于傳統(tǒng)生物標(biāo)志 物，穩(wěn)定、微創(chuàng)、易于檢測(cè)，將大大提高疾病診斷的敏感性和特異性，該類生物標(biāo)志物的成功 開發(fā)將為散發(fā)型非綜合征型先天性心臟病的診斷和治療開創(chuàng)全新局面，為其他疾病生物標(biāo) 志物的研制提供借鑒。
[0062] (2)遺傳標(biāo)記物試劑盒是一種系統(tǒng)、全面的診斷試劑盒，可用于散發(fā)型非綜合征型 先天性心臟病的輔助診斷，有助于反映患者的疾病狀態(tài)，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確掌握患者病 情、及時(shí)采取更具個(gè)性化的防治方案提供支持。
[0063] (3)采用嚴(yán)密的驗(yàn)證和評(píng)價(jià)體系，本發(fā)明人初期采用全基因組芯片掃描以獲取疾 病相關(guān)的低頻高外顯性遺傳標(biāo)志物譜，并在Sequenom MassARRAY基因分型平臺(tái)上進(jìn)行了驗(yàn) 證；以上方法和策略的應(yīng)用加速和保證了低頻高外顯性遺傳標(biāo)志物生物標(biāo)志物和診斷試劑 盒在臨床上的應(yīng)用，也為其他疾病生物標(biāo)志物的研制提供方法和策略上的借鑒。
[0064] 本發(fā)明通過控制年齡、性別等對(duì)疾病發(fā)展的影響因素，研究低頻高外顯性遺傳標(biāo) 志物在散發(fā)型非綜合征型先天性心臟病輔助診斷的應(yīng)用前景，闡述低頻高外顯性遺傳標(biāo)志 物對(duì)于散發(fā)型非綜合征型先天性心臟病進(jìn)展的影響，揭示其診斷價(jià)值。因此，本發(fā)明獲得了 散發(fā)型非綜合征型先天性心臟病發(fā)病相關(guān)低頻高外顯性遺傳標(biāo)志物譜和特異性標(biāo)志物；通 過遺傳標(biāo)志物和診斷試劑盒的研制和應(yīng)用，可使得散發(fā)型非綜合征型先天性心臟病的診斷 更加方便易行，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確掌握患者病情，為臨床治療效果評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)，并為發(fā) 現(xiàn)具有潛在治療價(jià)值的新型小分子藥物靶標(biāo)提供幫助。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0065] 圖1 :顯示全外顯子組關(guān)聯(lián)研究病例組和對(duì)照組的ROC曲線。
[0066] 顯示散發(fā)型非綜合征型先天性心臟病病例組對(duì)健康對(duì)照組為參照的ROC曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0067] 以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。
[0068] 實(shí)施例1樣品的收集和樣品資料的整理
[0069] 發(fā)明人于2006年開始至2012年從南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院、南京兒童醫(yī)院、 西安西京醫(yī)院收集了大量的散發(fā)型非綜合征型先天性心臟病患者血標(biāo)本，通過對(duì)樣品資料 的整理，發(fā)明人從中選擇了 7937例符合下列標(biāo)準(zhǔn)的樣本全外顯子組芯片掃描和Sequenom MassARRAY基因分型的實(shí)驗(yàn)樣品：
[0070] 1、經(jīng)超聲心動(dòng)圖、心臟導(dǎo)管插入術(shù)或手術(shù)明確診斷的非綜合征型先天性心臟病患 者；
[0071] 2、排除合并其他器官先天異常、染色體異?；颊?；
[0072] 3、排除一級(jí)親屬患先心病、母親患有糖尿病、苯丙酮尿癥、母親孕期接觸致畸物 (如農(nóng)藥或有機(jī)溶劑）及服用藥物的患者；
[0073] 4、與病例年齡、性別匹配的健康對(duì)照；
[0074] 并系統(tǒng)采集了這些樣本的人口學(xué)資料和臨床資料等情況。
[0075] 實(shí)施例2外周血DNA中低頻高外顯性遺傳標(biāo)志物的全外顯子組掃描
[0076] 在上述符合條件的984例散發(fā)型非綜合征型先天性心臟病患者和2953例健 康對(duì)照中，兩組年齡、性別匹配。將這兩組人群經(jīng)Illumina InfiniumK Human Exome Beadchipdllumina Inc.，San Diego, CA)芯片檢測(cè)獲得相關(guān)結(jié)果。具體步驟為：
[0077] 1、向儲(chǔ)存于2ml凍存管中的外周血加入溶血試劑（即裂解液，40份量配置方法如 下：蔗糖219. 72g、氯化鎂2. 02g和曲拉通X-100 (amresco 0694) 20ml混合后，用TrisHcl溶 液定容至2000ml，下同），顛倒混勻后完全轉(zhuǎn)入。
[0078] 2、去除紅細(xì)胞：用溶血試劑將5ml離心管補(bǔ)至4ml，顛倒混勻，4000rpm離心10分 鐘，棄上清。向沉淀中加入4ml溶血試劑，再次顛倒混勻清洗一次，4000rpm離心10分鐘，棄 上清。
[0079] 3、抽提DNA :向沉淀中加 Iml抽提液（每300ml中含有122. 5ml 0.2M氯化鈉， 14. 4ml 0. 5M乙二胺四乙酸，15ml 10%十二烷基硫酸鈉，148. I ml雙蒸水，下同）和8μ1 蛋白酶K，震蕩器上充分震蕩混勻，37°C水浴過夜。
[0080] 4、去除蛋白質(zhì)：加 Iml飽和酚充分混勻（手輕搖15分鐘），4000rpm離心10分鐘， 取上清轉(zhuǎn)入新的5ml離心管中。在上清液中加入等體積氯仿與異戊醇混合液（氯仿：異戊 醇=24 :1，v/v，下同），充分混勻后（手搖15分鐘），4000rpm離心10分鐘，取上清（分入 兩個(gè)I. 5ml的離心管）。
[0081] 5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸鈉60 μ 1，再加入與上清液等體積的冰無 水乙醇，上下輕搖，可見白色絮狀沉淀物，再以12000rpm離心lOmin。
[0082] 6、DNA洗漆：在沉淀中加入冰無水乙醇lml, 12000rpm離心10 min,棄上清后真空 抽干或置于清潔干燥環(huán)境中蒸干。
[0083] 7、測(cè)量濃度：通常能得到20-50ng/ μ I DNA，純度（紫外2600D與2800D比值）在 1. 6~2, 0〇
[0084] 8、進(jìn)行全外顯子組掃描：在 Illumina Infinium? Human Exome Beadchip (Illumina Inc.，San Diego, CA)芯片上進(jìn)行全外顯子區(qū)掃描。
[0085] 9、數(shù)據(jù)分析與處理：在"散發(fā)型非綜合征型先天性心臟病病例"組和"健康對(duì)照" 組中發(fā)現(xiàn)的基因型分布頻率有顯著差異的低頻高外顯性遺傳標(biāo)志物在上文中已經(jīng)羅列出， 結(jié)果見表1。
[0086] 表1.病例組與對(duì)照組全外顯子組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果
[0087]
[0088]

【權(quán)利要求】
1. 一種與散發(fā)型非綜合征型先天性心臟病輔助診斷相關(guān)的低頻高外顯性遺傳標(biāo)志物， 其特征在于該標(biāo)志物為 rs75423398、rs7527798、rs200531164、rs6756629、rsl39026854、 rs79043251、rsl801212、rs4956145、rs7689099、rsl45248317、rs34525648、rsl6891235、 rsl3194053、rs41269281、rs41270593、rs3130250、rs3130379、rs3130785、rs2523480、 rs2524276、rs743400、rsl40770834、rs213212、rs498114、rs45504893、rsl42301665、 rsl42508708、rsl45591245、rsl99643484、rsll07947、rsl326331、rs3781411、rs4353250、 rsl0830430、 rs200700939、 rsl0139931、 rsl87319098、 rsl624825、 rsl49543099、 rs79298157 和 rs9978445 的組合。
2. 權(quán)利要求1所述的低頻高外顯性遺傳標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物，其特征在于該引物 為： rs75423398的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:l和SEQ ID No:2;rs7527798的擴(kuò)增引物序 列為 SEQ ID No:4和 SEQ ID No:5;rs200531164 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:7和 SEQ ID No:8;rs6756629 的擴(kuò)增引物序列為SEQIDNo:10和SEQIDNo:ll;rsl39026854 的擴(kuò)增 引物序列為SEQ ID No: 13和SEQ ID No: 14 ;rs79043251的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No: 16 和 SEQ ID No:17;rsl801212 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:19和SEQ ID No:20;rs4956145 的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:22和SEQ ID No:23;rs7689099的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:25 和 SEQ ID No:26 ;rsl45248317 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:28 和 SEQ ID No:29; rs34525648的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:31和SEQ ID No:32 ;rsl6891235的擴(kuò)增引物 序列為 SEQ ID No :34 和 SEQ ID No :35 ;rsl3194053 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No :37 和 SEQ ID No:38;rs41269281 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:40和SEQ ID No:41;rs41270593 的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:43和SEQ ID No:44;rs3130250的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:46 和 SEQ ID No:47;rs3130379 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:49 和 SEQ ID No:50; rs3130785的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:52和SEQ ID No:53;rs2523480的擴(kuò)增引物序列 為 SEQ ID No :55 和 SEQ ID No :56 ;rs2524276 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No :58 和 SEQ ID No:59;rs743400 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:61 和 SEQ ID No:62;rsl40770834 的擴(kuò)增 引物序列為SEQ ID No :64和SEQ ID No :65 ;rs213212的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No :67和 SEQ ID No:68;rs498114 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:70 和 SEQ ID No:71;rs45504893 的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:73和SEQ ID No:74;rsl42301665的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:76 和 SEQ ID No:77 ;rs 142508708 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:79 和 SEQ ID No:80; rsl45591245 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:82 和 SEQ ID No:83;rsl99643484 的擴(kuò)增引 物序列為SEQ ID No:85和SEQ ID No:86;rsll07947的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:88和 SEQ ID No:89;rsl326331 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:91 和 SEQ ID No:92;rs3781411 的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:94和SEQ ID No:95;rs4353250的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No :97 和 SEQ ID No :98 ;rsl0830430 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No :100 和 SEQ ID No :101 ; rs200700939 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:103 和 SEQ ID No:104;rsl0139931 的擴(kuò)增 引物序列為SEQ ID No:106和SEQ ID No:107 ;rsl87319098的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:109和 SEQ ID No:110;rsl624825 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:112和 SEQ ID No:113; rsl49543099 的擴(kuò)增引物序列為SEQIDNo:115和SEQIDNo:116;rs79298157 的擴(kuò)增引 物序列為 SEQ ID No: 118 和 SEQ ID No: 119 ;rs9978445 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No: 121 和 SEQ ID No:122。
3. 權(quán)利要求1所述的低頻高外顯性遺傳標(biāo)志物的特異性延伸引物序列，其特征在于該 引物為： rs75423398的延伸引物序列為SEQ ID No:3;rs7527798的延伸引物序列為SEQ ID No:6 ;rs200531164的延伸引物序列為SEQ ID No:9 ;rs6756629的延伸引物序列為SEQ ID No: 12 ;rsl39026854的延伸引物序列為SEQ ID No: 15 ;rs79043251的延伸引物序列為SEQ ID No:18 ;rsl801212的延伸引物序列為SEQ ID No:21 ;rs4956145的延伸引物序列為SEQ ID No:24;rs7689099的延伸引物序列為SEQ ID No:27;rsl45248317的延伸引物序列為 SEQ ID No:30;rs34525648的延伸引物序列為SEQ ID No:33;rsl6891235的延伸引物序列 為SEQ ID No:36;rsl3194053的延伸引物序列為SEQ ID No:39;rs41269281的延伸引物序 列為SEQ ID No:42 ;rs41270593的延伸引物序列為SEQ ID No:45 ;rs3130250的延伸引物 序列為SEQ ID No:48;rs3130379的延伸引物序列為SEQ ID No:51;rs3130785的延伸引物 序列為SEQ ID No:54;rs2523480的延伸引物序列為SEQ ID No:57;rs2524276的延伸引物 序列為SEQ ID No:60 ;rs743400的延伸引物序列為SEQ ID No:63 ;rsl40770834的延伸引 物序列為SEQ ID No:66;rs213212的延伸引物序列為SEQ ID No:69;rs498114的延伸引物 序列為 SEQ ID No:72 ;rs45504893 的延伸引物序列為 SEQ ID No:75 ;rsl42301665 的延伸 引物序列為 SEQ ID No:78;rsl42508708 的延伸引物序列為 SEQ ID No:81;rsl45591245 的 延伸引物序列為SEQ ID No:84;rsl99643484的延伸引物序列為SEQ ID No:87;rsll07947 的延伸引物序列為SEQ ID No:90;rsl326331的延伸引物序列為SEQ ID No:93;rs3781411 的延伸引物序列為SEQ ID No:96;rs4353250的延伸引物序列為SEQ ID No:99;rsl0830430 的延伸引物序列為SEQ ID No:102 ;rs200700939的延伸引物序列為SEQ ID No: 105; rsl0139931的延伸引物序列為SEQ ID No:108;rsl87319098的延伸引物序列為SEQ ID No: 111 ;rs 1624825的延伸引物序列為SEQ ID No:114 ;rs 149543099的延伸引物序列為SEQ ID No:117;rs79298157的延伸引物序列為SEQ ID No:120;rs9978445的延伸引物序列為 SEQ ID No:123。
4. 權(quán)利要求1所述的低頻高外顯性遺傳標(biāo)志物在制備散發(fā)型非綜合征型先天性心臟 病輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
5. 權(quán)利要求2所述的低頻高外顯性遺傳標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物在制備散發(fā)型非綜 合征型先天性心臟病輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
6. 權(quán)利要求3所述的低頻高外顯性遺傳標(biāo)志物的特異性延伸引物在制備散發(fā)型非綜 合征型先天性心臟病輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
7. -種與散發(fā)型非綜合征型先天性心臟病輔助診斷相關(guān)的低頻高外顯性遺傳標(biāo)志 物檢測(cè)試劑盒，其特征在于該試劑盒用于檢測(cè)外周血DNA中rs75423398、rs7527798、 rs200531164、rs6756629、rsl39026854、rs79043251、rsl801212、rs4956145、rs7689099、 rsl45248317、rs34525648、rsl6891235、rsl3194053、rs41269281、rs41270593、rs3130250、 rs3130379、 rs3130785、 rs2523480、 rs2524276、 rs743400、 rsl40770834、 rs213212、 rs498114、 rs45504893、 rsl42301665、 rsl42508708、 rsl45591245、 rsl99643484、 rsll07947、rsl326331、rs3781411、rs4353250、rsl0830430、rs200700939、rsl0139931、 rsl87319098、rsl624825、rsl49543099、rs79298157 和 rs9978445。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒含有權(quán)利要求2所述的特 異性擴(kuò)增引物和/或權(quán)利要求3所述的特異性延伸引物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒還包括PCR技術(shù)常用的 試劑。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104263724SQ201410470273
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月15日
【發(fā)明者】胡志斌, 沈洪兵, 沙家豪, 陳亦江, 林苑, 許晶 申請(qǐng)人:南京醫(yī)科大學(xué)