一種球孢白僵菌菌株gzgy-1-3及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種球孢白僵菌菌株（Beaueriabassaria(Balsamo)Vuillemin)GZGY-1-3,該菌株的培養(yǎng)方法，由該菌株制備的孢子粉，以及該孢子粉在制備生防制劑中的應(yīng)用，所述生防制劑可用于煙粉虱、西花薊馬、蔥蚜和/或桃蚜的防治。使用該生防制劑能對高溫環(huán)境下的昆蟲進(jìn)行防治，且防治效果好，田間防治效果均高于75%。
【專利說明】-種球孢白僵菌菌株GZGY-1-3及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種球孢白僵菌菌株GZGY-1-3及其在 防治煙粉虱，西花薊馬，桃蚜和蔥蚜上的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 煙粉風(fēng) Bemisa tabaci (Gennadius),西花薊馬 Frankliniella occidentalis (Pergand)和桃姆Myzus persicae (Sulzer)均是世界性的重要農(nóng)業(yè)害蟲，寄 主包括蔬菜，花舟和煙草等多種經(jīng)濟(jì)作物。蔥姆Neotox optera formosana (Takahashi)是 近年來我國蔥、蒜和韭菜上為害逐年加重的害蟲之一。這些害蟲的共同特點(diǎn)通過刺吸或銼 吸式口器取食植物汁液對作物造成嚴(yán)重的直接為害，更為嚴(yán)重的是，它們作為植物病毒病 的傳播媒介給溫室和露地多種作物造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。這些害蟲的防治通常以化學(xué)防治 為主，而它們對化學(xué)合成的殺蟲劑抗性的發(fā)展引起人們對其它害蟲防治策略的興趣，其中 微生物防治可能扮演著重要角色（Biological control of Bemisia tabaci with fungi. Faria M，Wraight SP.Crop Prot. 2001. 20 :767-778.)。
[0003] 在眾多的微生物防治因子中，蟲生真菌是防治具有刺吸式（或銼吸式）口器 昆蟲的最有前途的一種病原物，因?yàn)樗哂兄苯哟┩咐ハx表皮侵染的獨(dú)特作用方式 (Biological control of Bemisia tabaci with fungi. Faria M, Wraight SP.Crop Prot. 2001. 20 :767-778.)。盡管有大量研究篩選出對這些害蟲高毒力的真菌菌株，但是這 些實(shí)驗(yàn)大多是在真菌的適宜溫度下完成的。煙粉虱、蔥蚜等均為喜溫昆蟲，在炎熱的夏季種 群發(fā)生達(dá)到最高峰；西花薊馬和桃蚜對高溫的喜好和耐受能力雖然不如前兩種昆蟲，但它 們在田間自然發(fā)生時(shí)的溫度也經(jīng)常超出了真菌的適宜溫度范圍。不利環(huán)境溫度能降低真 菌對于寄主昆蟲的侵染效率（Selection of Beauveria bassiana isolates for control of the whiteflies Bemisia tabaci and Trialeurodes vaporariorum on the basis of their virulence, thermal requirements, and toxicogenic activity. Quesada-Moraga E，Maranhao E. A. A et al. Biological Control. 2006. 36:274-287·)。以前的研究證明 了同一種真菌的不同菌株間有著顯著的耐熱性差異（Cold activity of Beauveria and Metarhizium, and thermotolerance of Beauveria. Fernandes E. K. K. , Rangel D. E. N. et al. Journal of Invertebrate Pathology. 2008. 98 :69-78.對西花薊馬高效的球抱白僵菌 菌株篩選及產(chǎn)孢特性研究[J].李銀平，雷仲仁，王海鴻.中國生物防治學(xué)報(bào).2013. 29(2): 219-226.)。因此，為了將蟲生真菌有效地應(yīng)用到害蟲的綜合治理中，不僅要考慮它對靶標(biāo) 害蟲的毒力，還要考慮它對于害蟲發(fā)生棲境溫度的適合度。此外，產(chǎn)孢量也是真菌能否大量 生產(chǎn)和實(shí)際應(yīng)用的重要考核指標(biāo)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 球抱白僵菌（Beauveria bassiana(Balsamo)Vuillemin)是侵染許多種昆蟲的常 見的病原物，大量的研究證明有許多有效侵染煙粉虱、西花薊馬，桃蚜和蔥蚜的菌株。為了 能在高溫環(huán)境下，例如大棚環(huán)境（其溫度可高達(dá)42-46攝氏度）下有效防治靶標(biāo)昆蟲，以及 將篩選出的菌株大量生產(chǎn)和應(yīng)用。本申請進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)，包括（a)篩選了 21株不同地 理位置和寄主來源的白僵菌菌株對靶標(biāo)昆蟲的致病性，（b)根據(jù)（a)的結(jié)果，比較了高致病 性菌株的產(chǎn)孢量，（c)根據(jù)（a)和（b)的結(jié)果，檢查了高致病性，高產(chǎn)孢量菌株的孢子對高 溫的耐受性。最終，我們篩選出了 GZGY-1-3性狀優(yōu)良的菌株可以作為上述靶標(biāo)昆蟲的有效 生防菌株。
[0005] 因此，本申請?zhí)峁┮环N球抱白僵菌（Beaueria bassaria(Balsamo)Vuillemin)菌 株GZGY-1-3,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3 號，保藏號為CGMCC No. 9254,保藏日期為2014年5月28日，屬于叢梗孢目，叢梗孢科，球孢 白僵菌屬。
[0006] 本發(fā)明還提供一種上述菌株的培養(yǎng)方法。
[0007] 優(yōu)選的，所述培養(yǎng)方法包括以下步驟：
[0008] 將球孢白僵菌GZGY-1-3接種于薩氏培養(yǎng)基SDAY上，所述薩氏培養(yǎng)基SDAY含 有1%的蛋白胨、1%的酵母膏，4%的葡萄糖和2%的瓊脂。優(yōu)選的，培養(yǎng)條件為保持溫度 25-27°C，培養(yǎng)7-10d，生產(chǎn)出活化好的GZGY-1-3的孢子粉。
[0009] 本發(fā)明還提供一種菌株GZGY-1-3的孢子粉，所述孢子粉由上述菌株GZGY-1-3經(jīng) 上述培養(yǎng)方法培養(yǎng)制備而成。
[0010] 本發(fā)明還提供一種上述活化孢子粉在制備生防制劑中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述孢子 粉和其他的殺蟲劑聯(lián)合應(yīng)用。 toon] 本發(fā)明還提供一種制備生防制劑的方法。將上述孢子粉經(jīng)過一級種子液培養(yǎng)、二 級種子液培養(yǎng)、固相發(fā)酵和孢子粉的干燥和收獲步驟制備而成。
[0012] 優(yōu)選的，所述步驟為以下步驟：
[0013] (1) 一級種子液的培養(yǎng)
[0014] 種取上述活化好的GZGY-1-3的孢子粉，接入薩氏培養(yǎng)液SDY得到種子液，所述 薩氏培養(yǎng)液SDY含有1%的蛋白胨、1%的酵母膏，4%的葡萄糖，種子液的初始孢子濃度為 I. OX IO6個(gè)· πιΓ1，在25°C、120r · mirT1條件下振蕩培養(yǎng)48hr，得到一級種子液。
[0015] ⑵二級種子液的培養(yǎng)
[0016] 將一級種子液按5%的接種量接入薩氏培養(yǎng)液SDY培養(yǎng)液，在7升液體發(fā)酵罐中培 養(yǎng)。加入發(fā)酵液體積的0.5%豆油，培養(yǎng)溫度為25-271：，轉(zhuǎn)速為100-200印111，初始溶氧量為 50%以上。培養(yǎng)40hr后得到二級種子液。
[0017] (3)固相發(fā)酵
[0018] 用開水浸泡大米30分鐘，撈出控去多余水份，121°C滅菌30分鐘后，按IOOg大米 加入15ml二級種子液的比例接菌，發(fā)酵器具為20 X 30cm的塑料袋。接種后鋪放于25-26°C 的條件下培養(yǎng)7-10d。
[0019] ⑷孢子粉的干燥和收獲
[0020] 固相發(fā)酵后的物料置于30°C下干燥3d，再用孢子收獲機(jī)，例如Mycoharvester Company，UK的收獲機(jī)，收獲孢子粉。
[0021] 本發(fā)明還提供一種生防制劑，由上述方法制備而成。
[0022] 本發(fā)明還提供一種上述生防制劑在防治靶標(biāo)昆蟲的應(yīng)用，所述靶標(biāo)昆蟲為煙粉 虱、西花薊馬、蔥蚜和/或桃蚜。優(yōu)選的所述昆蟲生活在高溫環(huán)境。更優(yōu)選的，所述高溫環(huán) 境為42-46°C的大棚環(huán)境。
[0023] 本發(fā)明還提供一種防治靶標(biāo)昆蟲的方法，所述方法包括向易感作物噴灑上述生防 制劑，所述靶標(biāo)昆蟲為煙粉虱、西花薊馬、蔥蚜和/或桃蚜。優(yōu)選的所述昆蟲生活在高溫環(huán) 境。更優(yōu)選的，所述高溫環(huán)境為42_46°C的大棚環(huán)境。
[0024] 本發(fā)明篩選得到的菌株侵染率高，致病力強(qiáng)，對煙粉虱4齡若蟲8天內(nèi)的累積死亡 率達(dá)到86. 5%，致死中時(shí)LT5tl為4. 31天；對西花薊馬2日齡成蟲8天內(nèi)的累積死亡率達(dá)到 84. 3%，致死中時(shí)LT5tl為4. 17天；對蔥蚜1日齡成蟲5天內(nèi)的累積死亡率達(dá)到95%，致死 中時(shí)LT5tl為2. 75天；對桃蚜1日齡成蟲5天內(nèi)的累積死亡率達(dá)到91. 7%，致死中時(shí)LT5tl為 2. 93天；產(chǎn)孢量高，為3. 87X IO8個(gè)孢子/cm2 ;耐熱性好，45°C處理2h后，GZGY-1-3的相對 萌發(fā)率仍然高達(dá)60. 6%。其各項(xiàng)綜合指標(biāo)表現(xiàn)良好，可以有效的防治煙粉虱、西花薊馬、蔥 蚜和桃蚜，尤其適合在大棚等高溫環(huán)境下應(yīng)用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1 :球孢白僵菌對煙粉虱4齡若蟲8天的累計(jì)死亡率和致死中時(shí)LT5tl(MeaniSE)
[0026] 圖2 :不同球孢白僵菌菌株的產(chǎn)孢量
[0027] 圖3 :不同菌株的耐熱性比較

【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)例不能作為本發(fā)明的限制， 在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，所作的修改或替換均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別 指明，下述實(shí)施方案中的手段為本領(lǐng)域所熟知的常規(guī)手段。
[0029] 實(shí)施例1篩選毒力高的菌株
[0030] 1. 1昆蟲種群
[0031] 煙粉虱于2013年從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廊坊科研基地的溫室大棚中的煙草上采集， 并在本試驗(yàn)室中用甘藍(lán)苗飼養(yǎng)2-3代。甘藍(lán)苗放在養(yǎng)蟲籠（40X40X30cm)中，飼養(yǎng)條件 為26±2°C，光周期為12 : 12(L : D)。為了使甘藍(lán)葉片上有足夠且均勻的煙粉虱若蟲用 于球孢白僵菌的毒力試驗(yàn)，試驗(yàn)時(shí)挑選高約25cm，長有5-6片嫩葉的甘藍(lán)幼苗，置于養(yǎng)蟲籠 中，48h后取出并驅(qū)趕所有成蟲，使每片葉片上約有100-150只卵。取出后的幼苗放入光照 培養(yǎng)箱，條件為26±1°C、12 : 12(L : D)，待煙粉虱的卵發(fā)育成4齡若蟲時(shí)剪下葉片待用。
[0032] 西花薊馬最初于2006年從門頭溝區(qū)碧坤蔬菜種植基地的茄子上采集，并在本試 驗(yàn)室中用菜豆豆莢多代飼養(yǎng)。豆莢放在兩端開口的玻璃筒中，兩端用尼龍紗封口。飼養(yǎng)條 件26±2°C，光周期為12 : 12(L : D)。其間不規(guī)律地從田間采集個(gè)數(shù)不等的個(gè)體放入本 種群中，以防種群衰退。
[0033] 蔥蚜于2014年4月從北京市順義區(qū)植保站實(shí)驗(yàn)基地的韭菜大棚中采集，然后在本 實(shí)驗(yàn)室用亜菜飼養(yǎng)。飼養(yǎng)時(shí)，將育有亜菜的花盆置于養(yǎng)蟲籠中（40 X 40 X 30cm)，然后將米集 的蔥蚜接種上。飼養(yǎng)條件為26°C、光周期12 : 12(L : D)。
[0034] 桃蚜于2014年4月從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研溫室內(nèi)的甘蘭苗上采集，并在本試驗(yàn)室 中用甘蘭苗飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件26±2°C，光周期為12 : 12(L : D)。
[0035] I. 2供試菌株
[0036] 本試驗(yàn)所用菌株來源于全國各地被白僵菌天然侵染的昆蟲上。采集的菌株經(jīng)分離 后接種于斜面培養(yǎng)基上并在4°C條件下儲存于本試驗(yàn)室。
[0037]

【權(quán)利要求】
1. 一種球抱白僵菌（Beaueria bassaria(Balsamo)Vuillemin)菌株GZGY-1-3,其特征 在于，該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CGMCC No. 9254,保藏日期為2014 年5月28日，屬于叢梗孢目，叢梗孢科，球孢白僵菌屬。
2. 權(quán)利要求1的球孢白僵菌菌株GZGY-1-3的培養(yǎng)方法，其特征在于，將菌株GZGY-1-3 接種于薩氏培養(yǎng)基SDAY上進(jìn)行培養(yǎng)，所述薩氏培養(yǎng)基SDAY含有1 %的蛋白胨、1 %的酵母 膏，4%的葡萄糖和2%的瓊脂。
3. 如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)方法將球孢白僵菌GZGY-1-3 接種于薩氏培養(yǎng)基SDAY上，保持溫度25-27°C，培養(yǎng)7-10d，生產(chǎn)出活化好的GZGY-1-3的孢 子粉。
4. 一種菌株GZGY-1-3的孢子粉，其特征在于，所述孢子粉由權(quán)利要求2-3任意培養(yǎng)方 法培養(yǎng)制備而成。
5. 權(quán)利要求4的孢子粉在制備生防制劑中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述孢子粉和其他的殺蟲 劑聯(lián)合應(yīng)用。
6. -種包含菌株GZGY-1-3的生防制劑的制備方法，其特征在于，將權(quán)利要求4的孢子 粉經(jīng)過一級種子液培養(yǎng)、二級種子液培養(yǎng)、固相發(fā)酵和孢子粉的干燥和收獲步驟制備而成。
7. 如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述步驟為以下步驟： (1) 一級種子液的培養(yǎng) 取活化好的GZGY-1-3的孢子粉，接入薩氏培養(yǎng)液SDY得到種子液，所述薩氏培養(yǎng)液 SDY含有1 %的蛋白胨、1 %的酵母膏，4%的葡萄糖，種子液的初始孢子濃度為I. OX IO6 個(gè)· πιΓ1，在25°C、120r · mirT1條件下振蕩培養(yǎng)48hr，得到一級種子液。 (2) 二級種子液的培養(yǎng) 將一級種子液按5%的接種量接入薩氏培養(yǎng)液SDY培養(yǎng)液，在7升液體發(fā)酵罐中培養(yǎng)。 加入發(fā)酵液體積的〇. 5%豆油，培養(yǎng)溫度為25-27°C，轉(zhuǎn)速為100_200rpm，初始溶氧量為 50%以上。培養(yǎng)40hr后得到二級種子液。 (3) 固相發(fā)酵 用開水浸泡大米30分鐘，撈出控去多余水份，121°C滅菌30分鐘后，按IOOg大米加入 15ml二級種子液的比例接菌，發(fā)酵器具為20X 30cm的塑料袋。接種后鋪放于25-26°C的條 件下培養(yǎng)7-10d。 (4) 孢子粉的干燥和收獲 固相發(fā)酵后的物料置于30°C下干燥3d，再用孢子收獲機(jī)收獲孢子粉。
8. -種生防制劑，所述生防制劑由權(quán)利要求6-7任意方法制備而成。
9. 權(quán)利要求8所述生防制劑在防治靶標(biāo)昆蟲的應(yīng)用，所述靶標(biāo)昆蟲為煙粉虱、西花薊 馬、蔥蚜和/或桃蚜。優(yōu)選的所述昆蟲生活在高溫環(huán)境。更優(yōu)選的，所述高溫環(huán)境為42-46°C 的大棚環(huán)境。
10. -種防治靶標(biāo)昆蟲的方法，所述方法包括向易感作物噴灑權(quán)利要求8所述生防制 齊U，所述靶標(biāo)昆蟲為煙粉虱、西花薊馬、蔥蚜和/或桃蚜。優(yōu)選的所述昆蟲生活在高溫環(huán)境。 更優(yōu)選的，所述高溫環(huán)境為42-46°C的大棚環(huán)境。
【文檔編號】C12N1/14GK104212724SQ201410449467
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月1日
【發(fā)明者】王海鴻, 王登杰, 張?zhí)? 李雪, 雷仲仁 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所