一種雞卵清提取液細(xì)胞培養(yǎng)基及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種雞卵清提取液細(xì)胞培養(yǎng)基，按照體積百分比由以下組分構(gòu)成：65％-75％的DMEM/F-12 1:1培養(yǎng)基，5％-15％胎牛血清和15％-25％雞卵清提取液。本發(fā)明還提供一種雞卵清提取液細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法，本發(fā)明的雞卵清提取液成本低，獲取容易，當(dāng)添加到細(xì)胞培養(yǎng)基中，可以更好地促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞(包括骨髓來(lái)源和臍帶來(lái)源)生長(zhǎng)與增殖，這樣我們可以減少胎牛血清的比例到10％，再加20％的雞卵清提取液，而間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況會(huì)好于傳統(tǒng)用20％的胎牛血清培養(yǎng)基，而節(jié)約了一半的胎牛血清，成本降低一半，而促細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖作用則更好。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種雞卵清提取液細(xì)胞培養(yǎng)基及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種雞卵清提取液細(xì)胞培養(yǎng)基，本發(fā)明還涉及一種雞卵清提取液細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]間充質(zhì)干細(xì)胞[mesenchymal stem cells,MSC]是干細(xì)胞家族的重要成員，來(lái)源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，屬于多能干細(xì)胞，MSC最初在骨髓中發(fā)現(xiàn)，因其具有多向分化潛能、造血支持和促進(jìn)干細(xì)胞植入、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點(diǎn)而日益受到人們的關(guān)注。如間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、心肌、內(nèi)皮等多種組織細(xì)胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細(xì)胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復(fù)。傳統(tǒng)用于間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基要添加20%的胎牛血清，才能促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞更好地生長(zhǎng)，而胎牛血清價(jià)格昂貴，獲取困難，多依靠進(jìn)口。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種雞卵清提取液細(xì)胞培養(yǎng)基，解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的細(xì)胞培養(yǎng)基價(jià)格昂貴的問(wèn)題。
[0004]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種雞卵清提取液細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法。
[0005]本發(fā)明所采用的第一技術(shù)方案是，一種雞卵清提取液細(xì)胞培養(yǎng)基，按照體積百分比由以下組分構(gòu)成:65%-75%的DMEM/F-12 1:1培養(yǎng)基，5%-15%胎牛血清和15%-25%雞卵清提取液，以上組分總量為100%。
[0006]本發(fā)明的特點(diǎn)還在于，
[0007]雞卵清提取液通過(guò)以下方法獲得:取一個(gè)雞蛋，無(wú)菌分離卵清和卵黃，卵清按1:1加裂解液，充分?jǐn)噭颍娣庞?°C ;凍融3次后離心，離心取上清，4°C保存。
[0008]裂解液配方:45-55mmol/L的氯化鈉，2-8mmol/L的氯化鎂，90-110mmol/L的4-輕乙基哌嗪乙磺酸,0.5-1.5mmol/L的二硫蘇糖醇,0.05-0.15mmol/L的苯甲基磺酰氟和1-3 μ g/mL的抑肽酶。
[0009]4-羥乙基哌嗪乙磺酸的pH為8.2。
[0010]DMEM/F-12 1:1培養(yǎng)基包括2.5mM的L-谷氨酰胺和15mM的4-羥乙基哌嗪乙磺酸。
[0011 ] 本發(fā)明所采用的第二技術(shù)方案是，一種雞卵清提取液細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法，具體按照以下步驟實(shí)施:
[0012]步驟1、取一個(gè)雞蛋，無(wú)菌分離卵清和卵黃，卵清按1:1加裂解液，充分?jǐn)噭?，存放?°C，凍融3次后離心，離心取上清，4°C保存，由此得到的提取液為卵清提取液；提取液標(biāo)記制備時(shí)間，分裝保存于4°C ；
[0013]步驟2、按照體積百分比量取65%-75% DMEM/F-12 1:1培養(yǎng)基，5%-15%胎牛血清和15% -25%雞卵清提取液，制備得到雞卵清提取液細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0014]本發(fā)明的特點(diǎn)還在于，
[0015]裂解液配方:45-55mmol/L的氯化鈉，2-8mmol/L的氯化鎂，90-110mmol/L的4-輕乙基哌嗪乙磺酸,0.5-1.5mmol/L的二硫蘇糖醇,0.05-0.15mmol/L的苯甲基磺酰氟和
1-3 μ g/mL的抑肽酶。
[0016]DMEM/F-12 1:1培養(yǎng)基包括2.5mM的L-谷氨酰胺和15mM的4-羥乙基哌嗪乙磺酸。
[0017]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明的雞卵清提取液成本低，獲取容易，當(dāng)添加到細(xì)胞培養(yǎng)基中，可以更好地促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞(包括骨髓來(lái)源和臍帶來(lái)源)生長(zhǎng)與增殖，這樣我們可以減少胎牛血清的比例到10%，再加20%的雞卵清提取液，而間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況會(huì)好于傳統(tǒng)用20%的胎牛血清培養(yǎng)基，而節(jié)約了一半的胎牛血清，成本降低一半，而促細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖作用則更好。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1是本發(fā)明雞卵清提取液細(xì)胞培養(yǎng)基與傳統(tǒng)的培養(yǎng)基的促間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖的作用的對(duì)比圖。

【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0020]本發(fā)明提供一種雞卵清提取液細(xì)胞培養(yǎng)基，按照體積百分比由以下組分構(gòu)成:65%-75%的DMEM/F-12 1:1培養(yǎng)基(廠家HyClone，含2.5mM L-谷氨酰胺，15mM4_羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) )，5%-15%的胎牛血清(金牌間充質(zhì)干細(xì)胞專(zhuān)用胎牛血清，廠家BI)，20%雞卵清提取液(自制)，以上組分總量為100%。
[0021]雞卵清提取液通過(guò)以下方法獲得:取一個(gè)雞蛋，無(wú)菌分離卵清和卵黃，卵清按1:1加裂解液，充分?jǐn)噭?，存放?°C ;凍融3次后離心，離心取上清，4°C保存。
[0022]裂解液配方:45-55mmol/L的氯化鈉(NaCl)，2-8mmol/L 的氯化鎂(MgCl2)，90-11OmmoI/L的4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，0.5-1.5mmol/L的二硫蘇糖醇(DTT)，0.05-0.15mmol/L 的苯甲基橫酸氟(PMSF)和 1-3 μ g/mL 的抑妝酶(aprotinin)。
[0023]其中，4-羥乙基哌嗪乙磺酸的pH為8.2。
[0024]傳統(tǒng)的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基是用80% DMEM/F-12 1:1培養(yǎng)基，和20 %胎牛血清，胎牛血清價(jià)格昂貴，在該組分中，三種成分都是關(guān)鍵組分。DMEM/F-12 1:1培養(yǎng)基和胎牛血清是傳統(tǒng)組分，而我們加了 15% -25%的雞卵清提取液，是因?yàn)槲覀冊(cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，15% -25%的雞卵清提取液促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，而采用雞卵清提取液，獲取方便，比胎牛血清成本低，效果好。雞卵清提取液大于25%不能很好地促進(jìn)細(xì)胞增殖，小于15%也不能很好地促進(jìn)細(xì)胞增殖，經(jīng)過(guò)我們研究，發(fā)現(xiàn)15% -25%終濃度的雞卵清提取液是最好的促間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的濃度，其中以20%為最佳。
[0025]本發(fā)明還提供一種雞卵清提取液細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法，具體按照以下步驟實(shí)施:
[0026]步驟1、取一個(gè)雞蛋，無(wú)菌分離卵清和卵黃，卵清按1:1加裂解液，充分?jǐn)噭?，存放?°C，凍融3次后離心，離心取上清，4°C保存，裂解液配方:45-55mm0l/L的氯化鈉，
2-8mmol/L的氯化鎂,90_110mmol/L的4-輕乙基哌嗪乙磺酸,0.5-1.5mmol/L的二硫蘇糖醇，0.05-0.15mmol/L的苯甲基磺酰氟和I_3 μ g/mL的抑肽酶，由此得到的提取液為卵清提取液；提取液標(biāo)記制備時(shí)間，分裝保存于4°C ;待用。
[0027]步驟2、按照體積百分比量取65%-75%DMEM/F-12 1:1培養(yǎng)基，5%-15%胎牛血清和15% -25%雞卵清提取液，制備得到雞卵清提取液細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0028]在制備方法中，本方法的關(guān)鍵的試劑是裂解液，裂解液能較好地保存雞卵清提取液，使雞卵清提取液不易污染，也不易降解。
[0029]本方法關(guān)鍵的參數(shù)是整個(gè)提取過(guò)程保證無(wú)菌，裂解液中含二硫蘇糖醇(DTT)，苯甲基磺酰氟(PMSF)，抑肽酶(aprotinin)，它們的作用是保持提取液中蛋白的穩(wěn)定性，而且均可采用國(guó)產(chǎn)試劑，價(jià)格便宜，效果好。經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)，證明裂解液配好后，過(guò)濾除菌，與雞卵清按1:1比例混合后，混勻，并凍融3次后，可有效地提出雞卵清中的有效成分，用于細(xì)胞的共培養(yǎng)。
[0030]實(shí)施例1
[0031]一種雞卵清提取液細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法，具體按照以下步驟實(shí)施:取一個(gè)雞蛋，無(wú)菌分離卵清和卵黃，卵清按1:1加裂解液，充分?jǐn)噭?，存放?°c。凍融3次后離心，離心取上清，4°C保存。裂解液配方:50mmol/L氯化鈉，5mmol/L氯化鎂，100mmol/L4-輕乙基哌嗪乙磺酸(pH8.2), lmmol/L 二硫蘇糖醇,0.lmmol/L苯甲基磺酰氟和2 μ g/mL抑肽酶。由此得到的提取液為卵清提取液，分裝保存于4°C，待用。按照體積百分比量取70% DMEM/F-121:1培養(yǎng)基，10%胎牛血清和20%雞卵清提取液，制備得到雞卵清提取液細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0032]見(jiàn)圖1，利用上述雞卵清提取液細(xì)胞培養(yǎng)基用于間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)，最后促間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖的作用比原來(lái)20%胎牛血清的培養(yǎng)基還要好。
[0033]我們將培養(yǎng)基添加20%雞卵清提取液，在96孔板中將細(xì)胞以每孔50ul (5 X 13個(gè)細(xì)胞)加入，再加入50ul培養(yǎng)基(普通培養(yǎng)基和20%雞卵清提取液培養(yǎng)基)，各加10孔，共培養(yǎng)4天后,加入Promega的檢測(cè)增殖活性的試劑20ul/孔,3小時(shí)后490nm比色,結(jié)果取均值土標(biāo)準(zhǔn)差(η = 10)，普通培養(yǎng)基的OD均值為0.8±0.02，20%雞卵清提取液培養(yǎng)基OD均值為1.3±0.04，結(jié)果表明20%雞卵清提取液培養(yǎng)基促間充質(zhì)干細(xì)胞增殖效果強(qiáng)于普通培養(yǎng)基，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*Ρ〈0.01)。
[0034]實(shí)施例2
[0035]一種雞卵清提取液細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法，具體按照以下步驟實(shí)施:取一個(gè)雞蛋，無(wú)菌分離卵清和卵黃，卵清按I: I加裂解液，充分?jǐn)噭?，存放?°c，凍融3次后離心，離心取上清,4°C保存,裂解液配方:45mmol/L的氯化鈉，8mmol/L的氯化鎂,90mmol/L的4-輕乙基哌嗪乙磺酸(pH8.2), 1.5mmol/L的二硫蘇糖醇,0.05mmol/L的苯甲基磺酰氟和3 μ g/mL的抑肽酶。由此得到的提取液為卵清提取液；卵清提取液標(biāo)記制備時(shí)間，分裝保存于4°C ;按照體積百分比量取65% DMEM/F-12 1:1培養(yǎng)基，15%胎牛血清和20%雞卵清提取液，制備得到雞卵清提取液細(xì)胞培養(yǎng)基，DMEM/F-12 1:1培養(yǎng)基包括2.5mM的L-谷氨酰胺和15mM的HEPES。
[0036]實(shí)施例3
[0037]—種雞卵清提取液細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法，具體按照以下步驟實(shí)施:取一個(gè)雞蛋，無(wú)菌分離卵清和卵黃，卵清按I: I加裂解液，充分?jǐn)噭?，存放?°c，凍融3次后離心，離心取上清，4°C保存,裂解液配方:55mmol/L的氯化鈉，2mmol/L的氯化鎂，110mmol/L的4-輕乙基哌嗪乙磺酸(pH8.2), 0.5mmol/L的二硫蘇糖醇,0.15mmol/L的苯甲基磺酰氟和I μ g/mL的抑肽酶。由此得到的提取液為卵清提取液；卵清提取液標(biāo)記制備時(shí)間，分裝保存于4°C ；按照體積百分比量取75% DMEM/F-12 1:1培養(yǎng)基，5%胎牛血清和20%雞卵清提取液，制備得到雞卵清提取液細(xì)胞培養(yǎng)基，DMEM/F-12 1:1培養(yǎng)基包括2.5mM的L-谷氨酰胺和15mM的HEPES。
[0038]實(shí)施例4
[0039]一種雞卵清提取液細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法，具體按照以下步驟實(shí)施:取一個(gè)雞蛋，無(wú)菌分離卵清和卵黃，卵清按I: I加裂解液，充分?jǐn)噭?，存放?°c，凍融3次后離心，離心取上清,4°C保存,裂解液配方:48mmol/L的氯化鈉，4mmol/L的氯化鎂,95mmol/L的4-輕乙基哌嗪乙磺酸(pH8.2), 0.8mmol/L的二硫蘇糖醇,0.08mmol/L的苯甲基磺酰氟和1.5 μ g/mL的抑肽酶。由此得到的提取液為卵清提取液；卵清提取液標(biāo)記制備時(shí)間，分裝保存于4°C ；按照體積百分比量取73% DMEM/F-12 1:1培養(yǎng)基，12%胎牛血清和15%雞卵清提取液，制備得到雞卵清提取液細(xì)胞培養(yǎng)基，DMEM/F-12 1:1培養(yǎng)基包括2.5mM的L-谷氨酰胺和15mM的 HEPES。
[0040]實(shí)施例5
[0041]一種雞卵清提取液細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法，具體按照以下步驟實(shí)施:取一個(gè)雞蛋，無(wú)菌分離卵清和卵黃，卵清按I: I加裂解液，充分?jǐn)噭?，存放?°c，凍融3次后離心，離心取上清，4°C保存,裂解液配方:52mmol/L的氯化鈉，6mmol/L的氯化鎂，105mmol/L的4-輕乙基哌嗪乙磺酸(pH8.2),0.12mmol/L的二硫蘇糖醇,0.12mmol/L的苯甲基磺酰氟和2.5 μ g/mL的抑肽酶。由此得到的提取液為卵清提取液；卵清提取液標(biāo)記制備時(shí)間，分裝保存于4°C;按照體積百分比量取67% DMEM/F-12 1:1培養(yǎng)基，8%胎牛血清和25%雞卵清提取液，制備得到雞卵清提取液細(xì)胞培養(yǎng)基，DMEM/F-12 1:1培養(yǎng)基包括2.5mM的L-谷氨酰胺和15mM的HEPES。
【權(quán)利要求】
1.一種雞卵清提取液細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，按照體積百分比由以下組分構(gòu)成:65% -75%的DMEM/F-12 1:1培養(yǎng)基，5% -15%胎牛血清和15% -25%雞卵清提取液，以上組分總量為100%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞卵清提取液細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述雞卵清提取液通過(guò)以下方法獲得:取一個(gè)雞蛋，無(wú)菌分離卵清和卵黃，卵清按1:1加裂解液，充分?jǐn)噭颍娣庞?°C ;凍融3次后離心，離心取上清，4°C保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雞卵清提取液細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述裂解液配方:45_55mmol/L的氯化鈉,2_8mmol/L的氯化鎂,90_110mmol/L的4-輕乙基哌嗪乙磺酸，0.5-1.5mmol/L的二硫蘇糖醇，0.05-0.15mmol/L的苯甲基磺酰氟和1_3 μ g/mL的抑肽酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的雞卵清提取液細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述4-羥乙基哌嗪乙磺酸的PH為8.2。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞卵清提取液細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述DMEM/F-121:1培養(yǎng)基包括2.5mM的L-谷氨酰胺和15mM的4-羥乙基哌嗪乙磺酸。
6.一種雞卵清提取液細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于，具體按照以下步驟實(shí)施: 步驟1、取一個(gè)雞蛋，無(wú)菌分離卵清和卵黃，卵清按1:1加裂解液，充分?jǐn)噭?，存放?°C，凍融3次后離心，離心取上清，4°C保存，由此得到的提取液為卵清提取液；提取液標(biāo)記制備時(shí)間，分裝保存于4°C ； 步驟2、按照體積百分比量取65% -75% DMEM/F-12 1:1培養(yǎng)基，5% -15%胎牛血清和15% -25%雞卵清提取液，制備得到雞卵清提取液細(xì)胞培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的雞卵清提取液細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于，所述裂解液配方:45_55mmol/L的氯化鈉,2_8mmol/L的氯化鎂,90_110mmol/L的4-輕乙基哌嗪乙磺酸，0.5-1.5mmol/L的二硫蘇糖醇，0.05-0.15mmol/L的苯甲基磺酰氟和1_3 μ g/mL的抑肽酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的雞卵清提取液細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于，所述DMEM/F-12 1:1培養(yǎng)基包括2.5mM的L-谷氨酰胺和15mM的4-羥乙基哌嗪乙磺酸。
【文檔編號(hào)】C12N5/0775GK104342403SQ201410424441
【公開(kāi)日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2014年8月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月26日
【發(fā)明者】阮光萍, 潘興華, 姚翔, 劉菊芬, 王金祥 申請(qǐng)人:成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院