一種綿羊y染色體特異微衛(wèi)星位點(diǎn)檢測試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種綿羊Y染色體特異微衛(wèi)星位點(diǎn)檢測試劑盒及應(yīng)用，該試劑盒包括待測樣品模板DNA:0.6yL;特異微衛(wèi)星上游引物：0.2yL;下游引物：0.2yL;核酸擴(kuò)增體系6XBuffer1yL、dNTP0.8yL、TaqDNA聚合酶0.2yL，最后加ddH20至10uL的混合物。本發(fā)明是在綿羊Y染色體特異區(qū)域篩選出的一個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，該位點(diǎn)經(jīng)應(yīng)用在公羊上能夠擴(kuò)增出產(chǎn)物，而在母羊樣本上無擴(kuò)增產(chǎn)物。經(jīng)進(jìn)一步研究公羊群體，具有一定多態(tài)性，說明利用該位點(diǎn)既可以進(jìn)行綿羊早期胚胎性別鑒定，有可以用于綿羊父系起源進(jìn)化研究。
【專利說明】-種綿羊Y染色體特異微衛(wèi)星位點(diǎn)檢測試劑盒及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種綿羊Y染色體特異微衛(wèi)星位點(diǎn)檢測試劑盒 及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 常染色體微衛(wèi)星和mtDNA標(biāo)記研究家養(yǎng)動物的起源，忽略了父本的遺傳效應(yīng)，有 一定局限性。近年來，Underhill P A等許多研究者意識到Y(jié)染色體上的遺傳標(biāo)記是研究 物種起源、進(jìn)化和遷移理想的工具。作為父系遺傳的染色體，絕大部分為非重組區(qū)，故單倍 型保持完整，不易受重組和回復(fù)突變影響，突變率低，比微衛(wèi)星標(biāo)記更能穩(wěn)定遺傳，是進(jìn)化 事件的忠實(shí)記錄者。再者，由于染色體為單倍體，其有效群體大小遠(yuǎn)小于常染色體位點(diǎn)，較 易產(chǎn)生生物群體特異的單倍型。
[0003] 關(guān)于綿羊Y染色體微衛(wèi)星分子遺傳標(biāo)記研究，國內(nèi)外文獻(xiàn)僅發(fā)現(xiàn)SRYM18 -個(gè)復(fù)合 微衛(wèi)星位點(diǎn)，而選用近緣物種牛的Y染色體微衛(wèi)星位點(diǎn)（INRA124、INRA126、INRA189)在綿 羊Y染色體上的應(yīng)用研究，結(jié)果該位點(diǎn)引物在公羊和母羊均能擴(kuò)增出產(chǎn)物，說明無特異性， 對于Y chromosome microsatellite DNA mark研究在人、牛（水牛）、馬上研究較多。因 此，需要挖掘綿羊Y染色體潛在微衛(wèi)星位點(diǎn)，作為綿羊早期胚胎性別鑒定和遺傳進(jìn)化研究。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明提供一種綿羊Y染色體特異微衛(wèi)星位點(diǎn) 檢測試劑盒及其應(yīng)用。其技術(shù)方案如下：
[0005] -種綿羊Y染色體特異微衛(wèi)星位點(diǎn)檢測試劑盒，包括待測樣品模板DNA :0. 6 y L ; 特異微衛(wèi)星上游引物：〇. L ;下游引物：0. L ;核酸擴(kuò)增體系6XBuffer I ii L、dNTP 0. 8 ii L、TaqDNA聚合酶0. 2 ii L，最后加ddH20至10 ii L的混合物。
[0006] 一種本發(fā)明所述綿羊Y染色體特異微衛(wèi)星位點(diǎn)檢測試劑盒的應(yīng)用，包括以下步 驟：待測樣品DNA提取、PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳檢測、SDS-PAGE檢測和PCR產(chǎn)物測 序，具體為：
[0007] (1)待測樣品DNA提取，選取公羊和母羊血液樣品，利用酚-氯仿法提取待測樣品 基因組DNA，經(jīng)純度檢測，稀釋至lOOng，以滿足PCR擴(kuò)增要求。
[0008] (2) PCR擴(kuò)增在本試劑盒中加入待測DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件是94°C預(yù)變 性3分鐘，94°C變性30秒，58. 5°C退火30秒，72°C延伸30秒，共30個(gè)循環(huán)。
[0009] (3) PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳檢測，取PCR產(chǎn)物2 ii L和6 X Buffer3 ii L混勻加入2 %瓊 脂糖凝膠中，在電壓120V，電流80A下電泳30分鐘，經(jīng)紫外檢測拍照，結(jié)果公羊均有擴(kuò)增產(chǎn) 物，母羊無擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0010] (4)SDS-PAGE檢測，取公羊PCR產(chǎn)物與變性劑去離子甲酰胺，以3 : 7的比例混合， 在95°C條件下變性10分鐘，然后在10%丙烯酰胺凝膠電泳22小時(shí)，經(jīng)固定-染色-脫色 后，凝膠成像儀拍照，電泳條件是電壓220V，內(nèi)外環(huán)境溫度是17°C。
[0011] (5) PCR產(chǎn)物測序，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送生物公司測序，驗(yàn)證是否具有微衛(wèi)星特征， 測序結(jié)果附后。
[0012] 本發(fā)明的有益效果：
[0013] 本發(fā)明是在綿羊Y染色體特異區(qū)域篩選出的一個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，該位點(diǎn)經(jīng)應(yīng)用在公 羊上能夠擴(kuò)增出產(chǎn)物，而在母羊樣本上無擴(kuò)增產(chǎn)物。經(jīng)進(jìn)一步研究公羊群體，具有一定多態(tài) 性，說明利用該位點(diǎn)既可以進(jìn)行綿羊早期胚胎性別鑒定，有可以用于綿羊父系起源進(jìn)化研 究。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1為PCR反應(yīng)條件；
[0015] 圖2為瓊脂糖檢測結(jié)果；圖2a為公母羊樣本瓊脂糖電泳檢測結(jié)果圖，M :表示 MARK ; S :公羊樣本；早：母羊樣本，圖2b為公羊樣本瓊脂糖電泳檢測結(jié)果圖，M :表示MARK ; 古：公羊樣本；
[0016] 圖3為公羊樣本PCR產(chǎn)物SDS-PAGE結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。
[0018] 血液基因組DNA提?。ú捎脗鹘y(tǒng)酚-氯仿抽提法）
[0019] (1)冷凍血液在室溫融化以后，取500 ill移至離心管中，加入等體積PBS緩沖液， 混合，充分搖動，12000rpm離心IOmin,棄去上清液。
[0020] (2)再取500 ill血液移至離心管中，加入等體積PBS緩沖液，混合，充分搖動， 12000rpm離心IOmin,棄去上清液。
[0021] (3)加入500 UlDNA抽提緩沖液（20% SDS)，重懸沉淀物。
[0022] (4)加入蛋白酶K至終濃度為IOOii g/ml，混勻，用封口膜封住，55°C水浴過夜。
[0023] (5)將溶液冷卻至室溫，加入等體積苯酚，緩慢的顛倒離心管10分鐘，直至兩相混 合形成乳池液，12000rpm離心IOmin,吸上清。
[0024] (6)取上清，再加入等體積苯酚：氯仿：異戊醇（25 : 24 : 1)，緩慢的顛倒離心 管 lOmin，12000rpm 離心 lOmin，吸上清。
[0025] (7)取上清，加入等體積氯仿：異戊醇（24 : 1)，緩慢的顛倒離心管lOmin， 12000rpm離心lOmin，吸上清。
[0026] (8)取上清，加入2倍體積的無水冰乙醇沉淀DNA，緩慢的轉(zhuǎn)動離心管，可見白色 DNA沉淀。
[0027] (9) 12000rpm離心IOmin ;棄上清，然后加4°C預(yù)冷的70 %乙醇洗兩次，12000rpm 離心IOmin,棄上清。
[0028] (10)將DNA干燥（注意不能太干燥）。
[0029] (11)加適量TE溶解，_20°C冷凍保存?zhèn)溆谩?br> [0030] Y染色體微衛(wèi)星引物設(shè)計(jì)
[0031] 利用近緣物種Y染色體特異序列比對，尋找哺乳動物Y染色體具有微衛(wèi)星特征的 保守序列，再利用Primer5. O設(shè)計(jì)引物，引物如下：
[0032] 上游引物：5' -GITGAGGACTCTTGCATCTG-3'，如 SEQ ID NO :1 所示。
[0033] 下游引物：3，-CACAGGCCTAGAAGAITGAG-5，，如 SEQ ID NO :2 所示。
[0034] 重復(fù)序列（GT) n
[0035] PCR擴(kuò)增及結(jié)果檢測
[0036] ( 一）反應(yīng)體系（10 U L)
[0037] 6 X Buffer ：1 U L
[0038] dNTP ：0. 8u L
[0039] 上游引物：0.2 ii L [0040]下游引物：0.2iiL
[0041] TaqDNA 聚合酶：0? 2 ii L
[0042] 模板DNA:0.6uL
[0043] 加 ddH20 至 10 U L
[0044] (二）反應(yīng)條件如圖1所示。
[0045] (三）瓊脂糖檢測結(jié)果如圖2所示。
[0046] 該引物在公羊能擴(kuò)增出產(chǎn)物，但在母羊樣本中未擴(kuò)增出產(chǎn)物
[0047] (四）該位點(diǎn)PCR產(chǎn)物SDS-PAGE分析結(jié)果如圖3所示。
[0048] 圖3經(jīng)分析，說明該位點(diǎn)具有一定多態(tài)性，可作為綿羊父系起源進(jìn)化研究。
[0049] (五）測序結(jié)果如SEQ ID NO :3所示。

【權(quán)利要求】
1. 一種綿羊Y染色體特異微衛(wèi)星位點(diǎn)檢測試劑盒，其特征在于，包括待測樣品模板 DNA :0. 6 ii L ;特異微衛(wèi)星上游引物：0. 2 ii L ;下游引物：0. 2 ii L ;核酸擴(kuò)增體系6XBuffer I ii L、dNTP 0? 8 ii L、TaqDNA 聚合酶 0? 2 ii L，最后加 CldH2O 至 10 ii L 的混合物。
2. -種權(quán)利要求1所述綿羊Y染色體特異微衛(wèi)星位點(diǎn)檢測試劑盒的應(yīng)用，其特征在于， 包括以下步驟：待測樣品DNA提取、PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳檢測、SDS-PAGE檢測和 PCR產(chǎn)物測序，具體為： (1) 待測樣品DNA提取，選取公羊和母羊血液樣品，利用酚-氯仿法提取待測樣品基因 組DNA，經(jīng)純度檢測，稀釋至lOOng，以滿足PCR擴(kuò)增要求； (2) PCR擴(kuò)增在本試劑盒中加入待測DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件是94°C預(yù)變性3 分鐘，94°C變性30秒，58. 5°C退火30秒，72°C延伸30秒，共30個(gè)循環(huán)； (3) PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳檢測，取PCR產(chǎn)物2 ii L和6 X Buf fer3 ii L混勻加入2 %瓊脂糖 凝膠中，在電壓120V，電流80A下電泳30分鐘，經(jīng)紫外檢測拍照，結(jié)果公羊均有擴(kuò)增產(chǎn)物，母 羊無擴(kuò)增產(chǎn)物； (4) SDS-PAGE檢測，取公羊PCR產(chǎn)物與變性劑去離子甲酰胺，以3 : 7的比例混合，在 95°C條件下變性10分鐘，然后在10%丙烯酰胺凝膠電泳22小時(shí)，經(jīng)固定-染色-脫色后， 凝膠成像儀拍照，電泳條件是電壓220V，內(nèi)外環(huán)境溫度是17°C ; (5) PCR產(chǎn)物測序，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送生物公司測序，驗(yàn)證是否具有微衛(wèi)星特征。
【文檔編號】C12Q1/68GK104212891SQ201410415448
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年8月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月22日
【發(fā)明者】王玉濤, 韓建林, 羅玉柱, 郭麗君 申請人:王玉濤