一種制備纖維素酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種以芒草作為里氏木霉發(fā)酵用碳源和產(chǎn)酶誘導(dǎo)物來制備纖維素酶的方法。本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明制備纖維素酶的方法，其制備成本低，制備過程易控制，對環(huán)境無污染，可適應(yīng)規(guī)模化生產(chǎn)的需要。
【專利說明】一種制備纖維素酶的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種制備纖維素酶的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]纖維素酶在生物質(zhì)能源產(chǎn)業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景和市場，尤其在化石能源日益枯竭、污染日趨嚴(yán)重的今天，利用纖維素酶處理木質(zhì)纖維素原料(包括農(nóng)作物秸桿、林業(yè)廢棄物以及新一代能源作物)，轉(zhuǎn)化單糖，進(jìn)而發(fā)酵生產(chǎn)乙醇等可再生和無污染液體燃料，是解決能源危機(jī)和環(huán)境污染的重要途徑之一。然而，生物質(zhì)能源產(chǎn)業(yè)的發(fā)展卻長期面臨轉(zhuǎn)化成本高，特別是纖維素酶生產(chǎn)成本高的技術(shù)瓶頸。因此,研發(fā)低成本、高活性纖維素酶的生產(chǎn)工藝意義重大。
[0003]纖維素酶是多組分酶系，主要包括葡聚糖內(nèi)切酶、葡聚糖外切酶、β -葡萄糖苷酶，可協(xié)同作用降解纖維素產(chǎn)生纖維二糖和葡萄糖。生產(chǎn)纖維素酶的微生物包括真菌、細(xì)菌、放線菌等，但目前主要還是絲狀真菌為主，其中里氏木霉是應(yīng)用最廣泛的纖維素酶生產(chǎn)菌，其酶系較全，且為胞外酶，易分離提純，還可直接用于酶解。
[0004]國內(nèi)也不乏纖維素酶生產(chǎn)技術(shù)的報(bào)道，如專利200910091969.3公開的技術(shù)方案是采用先堿液蒸煮，后酸解并水洗中和玉米秸桿作為碳源發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶，但堿液蒸煮秸桿會產(chǎn)生大量黑液，對環(huán)境造成污染，不適合于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)；再如專利201110203924.8公開的技術(shù)方案是用里氏木霉以微晶纖維素作為碳源液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶，但考慮到一噸微晶纖維素的市售價(jià)要兩萬多元，使得中小型生產(chǎn)企業(yè)對此望而卻步。
[0005]芒草為多年生草本植物，具有產(chǎn)量大、抗逆性強(qiáng)、纖維素含量高等優(yōu)良能源作物的特點(diǎn)，芒草的纖維素和半纖維素含量可高達(dá)80%，而且結(jié)構(gòu)致密，是替代昂貴的微晶纖維素和纖維素含量較低而灰分較高的作物秸桿，用于生產(chǎn)纖維素酶的優(yōu)質(zhì)原料。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種低成本，易操作并可規(guī)模化制備纖維素酶的方法。
[0007]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
一種制備纖維素酶的方法，其包括以下步驟:
種子培養(yǎng):將里氏木霉孢子接種于PDA平板，于28~30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5~7d，將PDA平板上活化的孢子用無菌生理鹽水洗脫后，制成18個/mL孢子懸液，按照1%的接種量接入種子培養(yǎng)基中，于27~29°C、攪拌槳轉(zhuǎn)速18(T220r/min、通氣量0.9~1.1vvm的2L發(fā)酵罐中培養(yǎng)24tT48h，得種子液；
發(fā)酵培養(yǎng):將上述種子液按照5%的接種量接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于27~29°C、攪拌槳轉(zhuǎn)速18(T220r/min、通氣量0.9~1.1vvm的1L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐中培養(yǎng)192~240h ；
其中，上述種子培養(yǎng)基包括:10g/L葡萄糖、0.49g/L酵母粉、1.96g/L KH2PO4、1.37g/L(NH4)2SO4^0.294g/L 尿素和 0.294g/L MgSO4.7H20，其 PH 調(diào)至 4.8 ；上述產(chǎn)酶培養(yǎng)基包括:3(T50g/L芒草、1.4g/L酵母粉、lg/L葡萄糖、5.6g/L KH2PO4,
3.92g/L (NH4)2SO4^0.84g/L 尿素、0.84g/L MgSO4.7Η20、0.84g/L CaCl2、20g 吐溫-80 和lml/L微量元素母鹽,其pH調(diào)至4.8。
[0008]上述微量元素母鹽包括:14g/LFeSO4.7Η20、4.37g/L MnSO4.7Η20、3.92 g/LZnSO4.7Η20 和 5.6 g/L CoCl2。
[0009]上述產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的芒草是經(jīng)預(yù)處理后的芒草，該預(yù)處理步驟為:將粗粉至f 2cm的芒草與水按1.5:10的比例混合后，放入水熱反應(yīng)釜中，加熱至16(T200°C，維持l(T20min，降溫后取出晾干。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明以芒草作為里氏木霉發(fā)酵用碳源和產(chǎn)酶誘導(dǎo)物進(jìn)行纖維素酶的制備，制備成本低，制備過程易控制，對環(huán)境無污染，可適應(yīng)規(guī)?；a(chǎn)的需要。
[0010]【具體實(shí)施方式】:
下面結(jié)合各實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但不是對本發(fā)明的限制:
實(shí)施例1 一種制備纖維素酶的方法，其包括以下步驟:
種子培養(yǎng):將里氏木霉孢子接種于PDA平板，于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d,將PDA平板上活化的孢子用無菌生理鹽水洗脫后，制成18個/mL孢子懸液，按照1%的接種量接入種子培養(yǎng)基中，于27°C、攪拌槳轉(zhuǎn)速180r/min、通氣量0.9vvm的2L發(fā)酵罐中培養(yǎng)48h，得種子液，其中，種子培養(yǎng)基包括:10g/L葡萄糖、0.49g/L酵母粉、1.96g/L KH2PO4U.37g/L(NH4)2SO4^0.294g/L 尿素和 0.294g/L MgSO4.7H20，其 PH 調(diào)至 4.8 ；
芒草預(yù)處理:將粗粉至f 2cm的芒草與水按1.5:10的比例混合后，放入水熱反應(yīng)釜中，加熱至160°C，維持20min，降溫取出晾干，測得其中的纖維素含量為48.6%，半纖維素的含量為14.8% ；
制備產(chǎn)酶培養(yǎng)基:將30g/L經(jīng)預(yù)處理后的芒草、1.4g/L酵母粉、lg/L葡萄糖、5.6g/LKH2PO4,3.92g/L (NH4)2S04、0.84g/L 尿素、0.84g/L MgSO4.7Η20、0.84g/L CaCl2、20g 吐溫-80和lml/L微量元素母鹽充分混合均勻，制成產(chǎn)酶培養(yǎng)基，并調(diào)節(jié)其pH至4.8，其中，微量元素母鹽包括:14g/L FeSO4.7Η20、4.37g/L MnSO4.7Η20、3.92 g/L ZnSO4.7Η20 和 5.6g/L CoCl2 ；
發(fā)酵培養(yǎng):將種子液按照5%的接種量接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于27~29°C、攪拌槳轉(zhuǎn)速18(T220r/min、通氣量0.9~1.1vvm的1L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐中培養(yǎng)192~240h，培養(yǎng)過程中用1.5M的氨水調(diào)控pH4.8，從48h開始補(bǔ)料，144h補(bǔ)至90 g/L芒草，192h發(fā)酵結(jié)束，得酶液。
[0011]根據(jù)Ghose濾紙酶活力測定方法，在50°C水浴條件下，取0.5ml上述得到的酶液，與Iml的pH4.8乙酸緩沖液混勻后，在60min內(nèi)水解50mg的whatman N0.1濾紙(IcmX6cm)，測得酶液的酶活力為11.lFPU/mL。
[0012]實(shí)施例2
一種制備纖維素酶的方法，其包括以下步驟:
種子培養(yǎng):將里氏木霉孢子接種于PDA平板，于29°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6d，將PDA平板上活化的孢子用無菌生理鹽水洗脫后，制成18個/mL孢子懸液，按照1%的接種量接入種子培養(yǎng)基中，于28°C、攪拌槳轉(zhuǎn)速200r/min、通氣量Ivvm的2L發(fā)酵罐中培養(yǎng)30h，得種子液，其中，種子培養(yǎng)基包括:10g/L葡萄糖、0.49g/L酵母粉、1.96g/L KH2PO4U.37g/L (NH4)2SO4,
0.294g/L 尿素和 0.294g/L MgSO4.7H20,其 PH 調(diào)至 4.8 ；
芒草預(yù)處理:將粗粉至f 2cm的芒草與水按1.5:10的比例混合后，放入水熱反應(yīng)釜中，加熱至180°C，維持15min，降溫取出晾干，測得其中的纖維素含量為55.1%，半纖維素的含量為8.2% ；
制備產(chǎn)酶培養(yǎng)基:將40g/L經(jīng)預(yù)處理后的芒草、1.4g/L酵母粉、lg/L葡萄糖、5.6g/LKH2PO4,3.92g/L (NH4)2S04、0.84g/L 尿素、0.84g/L MgSO4.7Η20、0.84g/L CaCl2、20g 吐溫-80和lml/L微量元素母鹽充分混合均勻，制成產(chǎn)酶培養(yǎng)基，并調(diào)節(jié)其pH至4.8，其中，微量元素母鹽包括:14g/L FeSO4.7Η20、4.37g/L MnSO4.7Η20、3.92 g/L ZnSO4.7Η20 和 5.6g/L CoCl2 ； 發(fā)酵培養(yǎng):將種子液按照5%的接種量接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于27~29°C、攪拌槳轉(zhuǎn)速18(T220r/min、通氣量0.9~1.1vvm的1L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐中培養(yǎng)192~240h，培養(yǎng)過程中用
1.5M的氨水調(diào)控pH4.8，從48h開始補(bǔ)料，144h補(bǔ)至90 g/L芒草，192h發(fā)酵結(jié)束，得酶液。
[0013]依據(jù)實(shí)施例1中的酶活力測定方法，測得本實(shí)施例中酶液的酶活力為16.0FPU/mL。
[0014]實(shí)施例3
一種制備纖維素酶的方法，其包括以下步驟:
種子培養(yǎng):將里氏木霉孢子接種于PDA平板，于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d，將PDA平板上活化的孢子用無菌生理鹽水洗脫后，制成18個/mL孢子懸液，按照1%的接種量接入種子培養(yǎng)基中，于29°C、攪拌槳轉(zhuǎn)速220r/min、通氣量1.1vvm的2L發(fā)酵罐中培養(yǎng)24h，得種子液，其中，種子培養(yǎng)基包括:10g/L葡萄糖、0.49g/L酵母粉、1.96g/L KH2PO4U.37g/L(NH4)2SO4^0.294g/L 尿素和 0.294g/L MgSO4.7H20，其 PH 調(diào)至 4.8 ；
芒草預(yù)處理:將粗粉至f 2cm的芒草與水按1.5:10的比例混合后，放入水熱反應(yīng)釜中，加熱至200°C，維持15min，降溫取出晾干，測得其中的纖維素含量為65.2%，半纖維素幾乎沒有；
制備產(chǎn)酶培養(yǎng)基:將50g/L經(jīng)預(yù)處理后的芒草、1.4g/L酵母粉、lg/L葡萄糖、5.6g/LKH2PO4,3.92g/L (NH4)2S04、0.84g/L 尿素、0.84g/L MgSO4.7Η20、0.84g/L CaCl2、20g 吐溫-80和lml/L微量元素母鹽充分混合均勻，制成產(chǎn)酶培養(yǎng)基，并調(diào)節(jié)其pH至4.8，其中，微量元素母鹽包括:14g/L FeSO4.7Η20、4.37g/L MnSO4.7Η20、3.92 g/L ZnSO4.7Η20 和 5.6g/L CoCl2 ；
發(fā)酵培養(yǎng):將種子液按照5%的接種量接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于27~29°C、攪拌槳轉(zhuǎn)速18(T220r/min、通氣量0.9~1.1vvm的1L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐中培養(yǎng)192~240h，培養(yǎng)過程中用
1.5M的氨水調(diào)控pH4.8，從48h開始補(bǔ)料，144h補(bǔ)至90 g/L芒草，192h發(fā)酵結(jié)束，得酶液。
[0015]依據(jù)實(shí)施例1中的酶活力測定方法，測得本實(shí)施例中酶液的酶活力為22.1FPU/mL。
【權(quán)利要求】
1.一種制備纖維素酶的方法，其特征在于，包括以下步驟: 種子培養(yǎng):將里氏木霉孢子接種于PDA平板，于28~30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5~7d，將PDA平板上活化的孢子用無菌生理鹽水洗脫后，制成18個/mL孢子懸液，按照1%的接種量接入種子培養(yǎng)基中，于27~29°C、攪拌槳轉(zhuǎn)速18(T220r/min、通氣量0.9~1.1vvm的2L發(fā)酵罐中培養(yǎng)24tT48h，得種子液； 發(fā)酵培養(yǎng):將上述種子液按照5%的接種量接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于27~29°C、攪拌槳轉(zhuǎn)速18(T220r/min、通氣量0.9~1.1vvm的1L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐中培養(yǎng)192~240h ； 其中，所述種子培養(yǎng)基包括:10g/L葡萄糖、0.49g/L酵母粉、1.96g/L KH2PO4U.37g/L(NH4)2SO4^0.294g/L 尿素和 0.294g/L MgSO4.7H20，其 PH 調(diào)至 4.8 ； 所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基包括:3(T50g/L芒草、1.4g/L酵母粉、lg/L葡萄糖、5.6g/L KH2PO4,3.92g/L (NH4)2SO4^0.84g/L 尿素、0.84g/L MgSO4.7Η20、0.84g/L CaCl2、20g 吐溫-80 和lml/L微量元素母鹽,其pH調(diào)至4.8。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備纖維素酶的方法，其特征在于，所述微量元素母鹽包括:14g/L FeSO4.7Η20、4.37g/L MnSO4.7Η20、3.92 g/L ZnSO4.7Η20 和 5.6 g/L CoCl2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備纖維素酶的方法，其特征在于，所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的芒草是經(jīng)預(yù)處理后的芒草，該預(yù)處理步驟為:將粗粉至f2cm的芒草與水按1.5:10的比例混合后，放入水熱反應(yīng)釜中，加熱至16(T200°C，維持l(T20min，降溫后取出晾干。
【文檔編號】C12N9/42GK104164413SQ201410405319
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年8月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月18日
【發(fā)明者】牛堃, 楊文慧, 秦榮輝 申請人:江蘇迪因生物科技有限公司