同時分離培養(yǎng)犬骨髓間充質(zhì)干細胞和多功能造血干細胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及犬干細胞分離培養(yǎng)技術(shù)，尤其是體外同時分離培養(yǎng)犬骨髓間充質(zhì)干細胞和多功能造血干細胞的技術(shù)。本發(fā)明的特征在于在分離骨髓單個核細胞的基礎(chǔ)上，貼壁培養(yǎng)原代間充質(zhì)干細胞的同時，采用半量換液，再加入單個核細胞培養(yǎng)懸液的方法，即利用貼壁生長的間充質(zhì)干細胞所提供的造血微環(huán)境培養(yǎng)懸浮生長的多功能造血干細胞，從而達到同時分離培養(yǎng)犬骨髓間充質(zhì)干細胞和多功能造血干細胞的目的。
【專利說明】同時分離培養(yǎng)犬骨髓間充質(zhì)干細胞和多功能造血干細胞的 方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及犬干細胞分離培養(yǎng)技術(shù)，尤其是體外同時分離培養(yǎng)犬骨髓間充質(zhì)干細 胞和多功能造血干細胞的技術(shù)。

【背景技術(shù)】
[0002] 骨髓間充質(zhì)干細胞（Bone marrow mesenchymal stemcells, BMMSCs)是一種存在 于骨髓的非造血干細胞，來源方便、無免疫排斥、具多系分化和高度增殖潛力，近年來在基 礎(chǔ)研究領(lǐng)域、臨床組織器官修復(fù)領(lǐng)域和疾病治療領(lǐng)域呈現(xiàn)出極為誘人的前景；多功能造血 干細胞（Hematopoietic stem cells, HSCs)是骨髓等造血組織中一類原始細胞，具有自 我更新定向分化（即分化成各類成熟血細胞）及歸巢（即靜脈輸注后經(jīng)外周血循環(huán)進入 髓竇，再跨越血管內(nèi)皮屏障并定位于骨髓的血管外間隙）等生物學(xué)功能，對于血液細胞的 再生和重建發(fā)揮著重要作用。
[0003] 傳統(tǒng)分離BMMSCs和HSCs的方法主要包括密度梯度離心法、流式細胞儀分離法、 磁珠分選法等，但局限于所需操作步驟繁瑣，所需時間久，對細胞損傷大，人為因素多，而且 HSCs的體外培養(yǎng)需要加入各種生長因子和誘導(dǎo)因子。因此當(dāng)進行大規(guī)模細胞分離培養(yǎng)時需 要一種省時省力并且高效的細胞分離培養(yǎng)的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于建立一種適用于體外進行大規(guī)模細胞分離培養(yǎng)，能高效同時分 離培養(yǎng)犬BMMSCs和HSCs的方法，為后續(xù)犬類干細胞的研究和臨床應(yīng)用提供物質(zhì)基礎(chǔ)和技 術(shù)支撐。
[0005] 本發(fā)明公開了一種分離培養(yǎng)犬骨髓間充質(zhì)干細胞和多功能造血干細胞的方法，其 特征在于在分離骨髓單個核細胞的基礎(chǔ)上，貼壁培養(yǎng)原代間充質(zhì)干細胞的同時，采用半量 換液，再加入單個核細胞培養(yǎng)懸液的方法，即利用貼壁生長的間充質(zhì)干細胞所提供的造血 微環(huán)境培養(yǎng)懸浮生長的多功能造血干細胞，從而達到同時分離培養(yǎng)犬骨髓間充質(zhì)干細胞和 多功能造血干細胞的目的，具體操作步驟如下 ： 步驟1、BMMSCs和HSCs的體外分離：常規(guī)麻醉實驗犬，髂后上棘備皮、消毒、鋪巾，用 含lml肝素鈉的骨髓穿刺針分2?3點共抽取骨髓約10ml，混勻防凝，迅速轉(zhuǎn)入50ml消毒 離心管，用等量DMEM/F12稀釋混勻；取10支底部加入5ml淋巴細胞分離液的離心管，加入 的淋巴細胞分離液濃度為1.077 g/ml，上層分別貼壁流入等量骨髓稀釋液，封口，控制溫度 4°C，離心機轉(zhuǎn)速為2000 r/min，離心20min去除上層脂肪細胞，吸取中間交界處白膜層細 胞，然后用4°C的10 ml DMEM/F12混勻洗滌界層細胞，再次離心20min，轉(zhuǎn)速2000r/min，去 除上清液，重復(fù)上述洗滌界層細胞步驟1次；用含15% FBS、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈 霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基5ml重懸沉積物； 步驟2、臺盼藍染色測定細胞活力：取0.4g臺盼藍，加入100 ml的0. 1 M PBS溶液中， 配制成 0· 4% 臺盼藍溶液，(λ 1M PBS 溶液配方：NaCl 8g，KC1 (λ 2g，Na2HP04. 12H20 3. 488g， KH2P04 0.2g，加三蒸去離子水至1000 ml，調(diào)整PH值為7. 4,0.22 Mm濾膜過濾除菌。取 0.4%臺盼藍溶液0.5 ml、DMEM/F12培養(yǎng)基0.3 ml和細胞懸液0.2 ml充分混勻，用血球 計數(shù)板計數(shù)活細胞（未著色細胞）和死細胞（著色細胞），共計數(shù)500個細胞，計算細胞活 力，細胞活力（％) =(細胞總數(shù)一著色細胞數(shù)）/細胞總數(shù)X 100%。如臺盼藍染色細胞 活力彡95%，則可進行下一步操作，否則重復(fù)步驟1 (重復(fù)步驟l、BMMSCs和HSCs的體外分 離）； 步驟3、培養(yǎng)貼壁的BMMSCs:首次培養(yǎng)時用含15% FBS、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈 霉素（雙抗）的DMEM/F12培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度，以1 X 106/ml細胞密度5 ml的培養(yǎng)液接種 于25 cm2的一次性細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于溫度37°C，5% C02、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 培養(yǎng)3天后首次換液，去除紅細胞、懸浮生長的骨髓造血干細胞及其它未貼壁的骨髓干細 胞，以后每隔3天換液1次，即換新鮮的含有15% FBS、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素 的DMEM/F12培養(yǎng)液，待細胞生長至70%?80%融合時，用0. 25%胰蛋白酶消化2?3min，用 含10%的FBS及雙抗的DMEM/F12終止消化，反復(fù)吹打瓶壁細胞，制成單細胞懸液按1:3傳 代，倒置顯微鏡逐日觀察，直至貼壁細胞彼此融合鋪滿瓶底時，重復(fù)上述操作，反復(fù)傳代擴 增，收集； 步驟4、培養(yǎng)懸浮生長的HSCs:由于HSCs在體外懸浮生長，且需要基質(zhì)細胞支持的生長 環(huán)境，因此在步驟3培養(yǎng)BMMSCs的過程中，在第二次換液時，棄去細胞瓶內(nèi)的全部上清液， 加入由步驟1、2所得到的細胞懸液，用含10% FBS及雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)液調(diào)整細胞密 度為lX106/ml，吸取5 ml細胞懸液直接接種于貼壁細胞層的上面，此后每6天半量換液， 即從培養(yǎng)瓶中取出2. 5 ml細胞培養(yǎng)懸液，離心20min，轉(zhuǎn)速2000r/min，收集細胞沉淀即為 HSCs，然后再加入2. 5 ml的含10% FBS及雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)液，按此法繼續(xù)培養(yǎng)下去， 倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，直到帖壁的BMMSCs生長至80%融合時，可同時收集懸浮生 長的HSCs和帖壁生長的BMMSCs ; 步驟5、細胞鑒定：（1)形態(tài)學(xué)鑒定：倒置顯微鏡下觀察貼壁生長的BMMSCs呈長梭形 或多邊形的纖維細胞狀，懸浮生長的HSCs呈圓形，細胞光亮，折光性好；（2)流式細胞術(shù)鑒 定：分別取培養(yǎng)的BMMSCs和HSCs，用PBS制成30〇μ1含有2. 5 X 106個的單細胞懸液；分裝 至6只1. 5ml的Eppendof管中，分別加入5〇μ1羊血清封閉30min ;再分別加入鼠源一抗 CD14、CD34、CD44、CDlla、HLA2DR 及對照 PBS 各 5μ1，混勻，反應(yīng) 30min ;PBS 離心洗滌 2 次， 去除未標記上的抗體；各管用PBS配制成99μ1細胞懸液；每管再加入?μ? FITC標記山羊 抗小鼠 IgG(H+L)二抗，混勻，37°C下避光反應(yīng)15min ;PBS離心洗滌2次；每管再加入lml PBS重新混懸細胞，用流式細胞儀檢測細胞表面抗原⑶14、⑶34、⑶44、⑶11a和HLA2DR的 表達；BMMSCs強表達⑶44 (間充質(zhì)干細胞特異性分子抗原），HSCs強表達⑶34 (造血干細 胞特異性分子抗原）； 步驟6、BMMSCs和HSCs的凍存及復(fù)蘇：（1)凍存：每代的BMMSCs和HSCs，除用于延續(xù) 培養(yǎng)和進行相關(guān)實驗所有外，全部凍存。細胞凍存液：10% DMS0,40% FBS，50% DMEM/F12維 持培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為IX l〇6/ml，加入無菌的細胞凍存管中，每管1. 5 ml，應(yīng)用程序降 溫儀凍存于液氮中；（2)復(fù)蘇：從液氮中迅速取出細胞凍存管，立即置入37°C水浴箱，輕輕 搖動使其盡快融化，取出凍存管，用75%乙醇消毒后開啟，吸出細胞懸液，注入離心管，轉(zhuǎn)速 2000r/min，離心20min，去除上清液，用含10% FBS及雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)液重懸細 胞沉淀，置溫度37°C，5% C02、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0006] 本方法在傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的方法上進行了創(chuàng)新和改進，克服了犬干細胞分離時繁瑣 的篩選步驟，犬多功能造血干細胞懸浮于培養(yǎng)液、不易生長、需要加入各種生長因子和誘導(dǎo) 因子的缺陷，使用本發(fā)明的方法能同時分離培養(yǎng)犬骨髓間充質(zhì)干細胞和多功能造血干細 胞，所得到的細胞形態(tài)均一，培養(yǎng)細胞所需時間縮短，分離得到的兩種干細胞純度較高，增 殖較快。本發(fā)明方法為犬類干細胞的研究和應(yīng)用提供了豐富的材料來源，具有廣泛的犬類 臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。

【具體實施方式】
[0007] 實施例1、步驟1、BMMSCs和HSCs的體外分離：常規(guī)麻醉實驗犬，髂后上棘備皮、 消毒、鋪巾，用含lml肝素鈉的骨髓穿刺針分2?3點共抽取骨髓約10ml，混勻防凝，迅速 轉(zhuǎn)入50ml消毒離心管，用等量DMEM/F12稀釋混勻；取10支底部加入5ml淋巴細胞分離 液（1.077 g/ml)的離心管，上層分別小心加入（貼壁流入）等量骨髓稀釋液，封口。4°C， 2000 r/min，離心20min去除上層脂肪細胞，小心吸取中間交界處白膜層細胞。用4°C 10ml DMEM/F12混勻洗滌界層細胞，2000r/min，離心20min，去除上清液，重復(fù)洗滌1次；用含15% FBS、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基5ml重懸沉積物； 步驟2、臺盼藍染色測定細胞活力：取0· 4 %臺盼藍（PBS配制）0· 5 ml、DMEM/F12培 養(yǎng)基0.3 ml和細胞懸液0.2 ml充分混勻，用血球計數(shù)板計數(shù)活細胞（未著色細胞）和死 細胞（著色細胞），共計數(shù)500個細胞，計算細胞活力，細胞活力（％) =(細胞總數(shù)一著色 細胞數(shù)）/細胞總數(shù)X 100%。如臺盼藍染色細胞活力彡95%，則可進行下一步操作，否則重 復(fù)步驟1 ; 步驟3、培養(yǎng)貼壁的BMMSCs :首次培養(yǎng)時用含15% FBS及雙抗（青鏈霉素）的DMEM/F12 培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度，以IX l〇6/ml細胞密度5 ml的培養(yǎng)液接種于直徑為25 cm2的培養(yǎng) 瓶內(nèi)，置37°C，5% C02、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)3天后首次換液，去除紅細胞、 懸浮生長的骨髓造血干細胞及其它未貼壁的骨髓干細胞。以后每隔3天換液1次，細胞生 長至70%?80%融合時，用0. 25%胰蛋白酶+0. 0396EDTA 3 ml消化2?3min，用含10%的 FBS及雙抗的DMEM/F12終止消化，反復(fù)吹打瓶壁細胞，制成單細胞懸液按1:3傳代，倒置顯 微鏡逐日觀察，直至貼壁細胞彼此融合鋪滿瓶底時，重復(fù)上述操作，反復(fù)傳代擴增，收集。
[0008] 步驟4、培養(yǎng)懸浮生長的HSCs :由于HSCs在體外懸浮生長，且需要基質(zhì)細胞支持的 生長環(huán)境，因此在步驟3培養(yǎng)BMMSCs的過程中，在第二次換液時，棄去細胞瓶內(nèi)的全部上清 液，加入由步驟1、2所得到的細胞懸液。用含10% FBS及雙抗（青鏈霉素）的DMEM/F12培 養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為IX l〇6/ml，吸取5 ml細胞懸液直接接種于貼壁細胞層的上面。此后 每6天半量換液，即從培養(yǎng)瓶中取出2. 5 ml細胞培養(yǎng)懸液，2000r/min，離心20min，收集細 胞沉淀即為HSCs。然后再加入2. 5 ml新鮮培養(yǎng)液，按此法繼續(xù)培養(yǎng)下去，倒置顯微鏡觀察 細胞生長情況，直到帖壁的BMMSCs生長至80%融合時，可同時收集懸浮生長的HSCs和帖壁 生長的BMMSCs。
[0009] 步驟5、細胞鑒定：（1)形態(tài)學(xué)鑒定：倒置顯微鏡下觀察貼壁生長的BMMSCs呈長梭 形或多邊形的纖維細胞狀，懸浮生長的HSCs呈圓形，細胞光亮，折光性好。（2)流式細胞術(shù) 鑒定：分別取培養(yǎng)的BMMSCs和HSCs，用PBS制成30〇μ1含有2. 5X 106個的單細胞懸液；分 裝至6只1. 5ml的Eppendof管中，分別加入5〇μ1羊血清封閉30min ;再分別加入鼠源一抗 CD14、CD34、CD44、CD1 la、HLA2DR 及對照 PBS 各 5μ1，混勻，反應(yīng) 30min ;PBS 離心洗滌 2 次， 去除未標記上的抗體。各管用PBS配制成99μ1細胞懸液；每管再加入?μ? FITC標記山羊 抗小鼠 IgG(H+L)二抗，混勻，37°C下避光反應(yīng)15min ;PBS離心洗滌2次；每管再加入lml PBS重新混懸細胞，用流式細胞儀檢測細胞表面抗原⑶14、⑶34、⑶44、⑶11a和HLA2DR的 表達。BMMSCs強表達⑶44 (間充質(zhì)干細胞特異性分子抗原），HSCs強表達⑶34 (造血干細 胞特異性分子抗原）。
[0010] 步驟6、BMMSCs和HSCs的凍存及復(fù)蘇：（1)凍存：每代的BMMSCs和HSCs，除用于 延續(xù)培養(yǎng)和進行相關(guān)實驗所有外，全部凍存。細胞凍存液：10% DMS0,40% FBS，50% DMEM/ F12維持培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為1 X 106/ml，加入無菌的細胞凍存管中，每管1. 5 ml，應(yīng)用程 序降溫儀凍存于液氮中；（2)復(fù)蘇：從液氮中迅速取出細胞凍存管，立即置入37°C水浴箱， 輕輕搖動使其盡快融化，取出凍存管，用75%乙醇消毒后開啟，吸出細胞懸液，注入離心管， 轉(zhuǎn)速2000r/min，離心20min，去除上清液，用含10% FBS及雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)液 重懸細胞沉淀，置溫度37°C，5% C02、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
【權(quán)利要求】
1. 一種分離培養(yǎng)犬骨髓間充質(zhì)干細胞和多功能造血干細胞的方法，其特征在于在分離 骨髓單個核細胞的基礎(chǔ)上，貼壁培養(yǎng)原代間充質(zhì)干細胞的同時，采用半量換液，再加入單個 核細胞培養(yǎng)懸液的方法，即利用貼壁生長的間充質(zhì)干細胞所提供的造血微環(huán)境培養(yǎng)懸浮生 長的多功能造血干細胞，從而達到同時分離培養(yǎng)犬骨髓間充質(zhì)干細胞和多功能造血干細胞 的目的，具體操作步驟如下： 步驟1、BMMSCs和HSCs的體外分離：常規(guī)麻醉實驗犬，髂后上棘備皮、消毒、鋪巾，用 含lml肝素鈉的骨髓穿刺針分2?3點共抽取骨髓約10ml，混勻防凝，迅速轉(zhuǎn)入50ml消毒 離心管，用等量DMEM/F12稀釋混勻；取10支底部加入5ml淋巴細胞分離液的離心管，加入 的淋巴細胞分離液濃度為1.077 g/ml，上層分別貼壁流入等量骨髓稀釋液，封口，控制溫度 4°C，離心機轉(zhuǎn)速為2000 r/min，離心20min去除上層脂肪細胞，吸取中間交界處白膜層細 胞，然后用4°C的10 ml DMEM/F12混勻洗滌界層細胞，再次離心20min，轉(zhuǎn)速2000r/min，去 除上清液，重復(fù)上述洗滌界層細胞步驟1次；用含15% FBS、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈 霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基5ml重懸沉積物； 步驟2、臺盼藍染色測定細胞活力：取0.4g臺盼藍，加入100 ml的0. 1 M PBS溶液中， 配制成 0· 4% 臺盼藍溶液，(λ 1Μ PBS 溶液配方：NaCl 8g，KC1 0· 2g，Na2HP04. 12H20 3. 488g， KH2P04 0. 2g，加三蒸去離子水至1000 ml，調(diào)整PH值為7. 4,0. 22 Mm濾膜過濾除菌； 取0. 4%臺盼藍溶液0. 5 ml、DMEM/F12培養(yǎng)基0. 3 ml和細胞懸液0. 2 ml充分混勻， 用血球計數(shù)板計數(shù)活細胞（未著色細胞）和死細胞（著色細胞），共計數(shù)500個細胞，計算 細胞活力，細胞活力（％) =(細胞總數(shù)一著色細胞數(shù)）/細胞總數(shù)X 100%; 如臺盼藍染色細胞活力>95%，則可進行下一步操作，否則重復(fù)步驟1 (重復(fù)步驟1、 BMMSCs和HSCs的體外分離）； 步驟3、培養(yǎng)貼壁的BMMSCs:首次培養(yǎng)時用含15% FBS、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈 霉素（雙抗）的DMEM/F12培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度，以1 X 106/ml細胞密度5 ml的培養(yǎng)液接種 于25 cm2的一次性細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于溫度37°C，5% C02、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 培養(yǎng)3天后首次換液，去除紅細胞、懸浮生長的骨髓造血干細胞及其它未貼壁的骨髓干細 胞，以后每隔3天換液1次，即換新鮮的含有15% FBS、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素 的DMEM/F12培養(yǎng)液，待細胞生長至70%?80%融合時，用0. 25%胰蛋白酶消化2?3min，用 含10%的FBS及雙抗的DMEM/F12終止消化，反復(fù)吹打瓶壁細胞，制成單細胞懸液按1:3傳 代，倒置顯微鏡逐日觀察，直至貼壁細胞彼此融合鋪滿瓶底時，重復(fù)上述操作，反復(fù)傳代擴 增，收集； 步驟4、培養(yǎng)懸浮生長的HSCs :由于HSCs在體外懸浮生長，且需要基質(zhì)細胞支持的生長 環(huán)境，因此在步驟3培養(yǎng)BMMSCs的過程中，在第二次換液時，棄去細胞瓶內(nèi)的全部上清液， 加入由步驟1、2所得到的細胞懸液，用含10% FBS及雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)液調(diào)整細胞密 度為lX106/ml，吸取5 ml細胞懸液直接接種于貼壁細胞層的上面，此后每6天半量換液， 即從培養(yǎng)瓶中取出2. 5 ml細胞培養(yǎng)懸液，離心20min，轉(zhuǎn)速2000r/min，收集細胞沉淀即為 HSCs，然后再加入2. 5 ml的含10% FBS及雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)液，按此法繼續(xù)培養(yǎng)下去， 倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，直到帖壁的BMMSCs生長至80%融合時，可同時收集懸浮生 長的HSCs和帖壁生長的BMMSCs ; 步驟5、細胞鑒定：（1)形態(tài)學(xué)鑒定：倒置顯微鏡下觀察貼壁生長的BMMSCs呈長梭形 或多邊形的纖維細胞狀，懸浮生長的HSCs呈圓形，細胞光亮，折光性好；（2)流式細胞術(shù)鑒 定：分別取培養(yǎng)的BMMSCs和HSCs，用PBS制成30〇μ1含有2. 5X 106個的單細胞懸液；分裝 至6只1. 5ml的Eppendof管中，分別加入5〇μ1羊血清封閉30min ;再分別加入鼠源一抗 CD14、CD34、CD44、CDlla、HLA2DR 及對照 PBS 各 5μ1，混勻，反應(yīng) 30min ;PBS 離心洗滌 2 次， 去除未標記上的抗體；各管用PBS配制成99μ1細胞懸液；每管再加入?μ? FITC標記山羊 抗小鼠 IgG(H+L)二抗，混勻，37°C下避光反應(yīng)15min ;PBS離心洗滌2次；每管再加入lml PBS重新混懸細胞，用流式細胞儀檢測細胞表面抗原⑶14、⑶34、⑶44、⑶11a和HLA2DR的 表達；BMMSCs強表達⑶44 (間充質(zhì)干細胞特異性分子抗原），HSCs強表達⑶34 (造血干細 胞特異性分子抗原）； 步驟6、BMMSCs和HSCs的凍存及復(fù)蘇：（1)凍存：每代的BMMSCs和HSCs，除用于延續(xù) 培養(yǎng)和進行相關(guān)實驗所有外，全部凍存； 細胞凍存液：10% DMS0,40% FBS，50% DMEM/F12維持培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為1X106/ ml，加入無菌的細胞凍存管中，每管1.5 ml，應(yīng)用程序降溫儀凍存于液氮中；（2)復(fù)蘇：從 液氮中迅速取出細胞凍存管，立即置入37°C水浴箱，輕輕搖動使其盡快融化，取出凍存管， 用75%乙醇消毒后開啟，吸出細胞懸液，注入離心管，轉(zhuǎn)速2000r/min，離心20min，去除上清 液，用含10% FBS及雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)液重懸細胞沉淀，置溫度37°C，5% C02、飽 和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
【文檔編號】C12N5/0789GK104152409SQ201410405353
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月18日
【發(fā)明者】嚴玉霖, 汪登如, 曹景鋒, 陳玲, 嚴梓丹 申請人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)