一種能特異性檢測Mur抗原基因的試劑及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種能特異性檢測Mur抗原基因的試劑及檢測方法，該試劑由2×預(yù)混液、Mur上游引物、Mur下游引物、內(nèi)參上游引物、內(nèi)參下游引物和無DNA酶/RNA酶的水組成，通過將血液基因組與試劑混合進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，再將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定得到檢測結(jié)果。通過上述方式，本發(fā)明為特異性檢測Mur抗原基因的試劑及檢測方法，利用了Mur抗原基因特異性的引物建立了簡便快速、敏感特異的檢測Miltenberger血型中Mur抗原基因的PCR-SSP方法，該方法檢測結(jié)果準(zhǔn)確，有利于大規(guī)模、自動(dòng)化的對Mur抗原進(jìn)行篩檢，可為臨床上Mur抗原的檢測和鑒定及配血工作提供有效的參考，保障輸血安全。
【專利說明】一種能特異性檢測Mur抗原基因的試劑及檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種分子生物學(xué)檢測試劑及方法，特別是涉及一種用于Miltenberger 血型系統(tǒng)中Mur抗原的特異性基因檢測試劑和方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 1927年Landsteiner和Levine發(fā)現(xiàn)了人類MNS血型，該血型系統(tǒng)抗原的多態(tài)性數(shù) 目僅次于Rh血型系統(tǒng)。Miltenberger血型系統(tǒng)是MNS系統(tǒng)中一類相對稀有的子系統(tǒng)，是 因血型糖蛋白A (GPA)和血型糖蛋白B (GPB)編碼基因發(fā)生重組交換而形成的一組變異抗 原，由 Mia、Vw、Mur、Hil、Hut、MUT、Hop、Nob、DANE、TSEN 和 MINY 共 11 種抗原交叉組成 11 種不同的表現(xiàn)型。其中Mia和Mur這兩種抗原因常引起急性溶血性輸血反應(yīng)和新生兒溶血 病而愈加受到臨床重視。
[0003] Mur抗原（MNSlO)在西方人群中呈現(xiàn)低頻率分布，臨床研究意義不大。但在亞洲人 群中卻具有較高的分布頻率，約占人口總數(shù)的5%?10%，其中泰國為9. 7%，香港和臺(tái)灣分別 為6. 28%和7. 3%，廣州為6. 59%，合肥為1. 87%。
[0004] 分析表明，Mur的產(chǎn)生是由于GYPB假外顯子片段被GYPA外顯子3的5'端和內(nèi)含 子3的3'端替換，生成了復(fù)合外顯子GYP (B-A-B)，使得GYPA片段替換的是GYPB假外顯子 上無功能的剪接位點(diǎn)，該位點(diǎn)被GYPA上功能性的剪接位點(diǎn)替換后，可以表達(dá)新的復(fù)合外顯 子。也有學(xué)者認(rèn)為GYPB的假外顯子3編碼生成了 N端第34?41位，氨基酸特異性序列 34YPAHTANE41 表達(dá) Mur 抗原。由于 GP (B-A-B) Mur、GP (B-A-B) Hop、GP (B-A-B) Bun 中均含 有被GYPA插入片段激活的GYPB假外顯子的表達(dá)產(chǎn)物，故都表達(dá)Mur抗原，這給Mur的基因 檢測提供了分子基礎(chǔ)及理論依據(jù)。
[0005] 目前，國際上和國內(nèi)都沒有針對Mur抗原特異性的基因檢測產(chǎn)品。而且，基于 PCR-SSP的基因檢測方法，突破了血清學(xué)方法依賴譜細(xì)胞和單克隆抗體的限制，適合于大標(biāo) 本和自動(dòng)化檢測，可以針對性的對某特定地區(qū)或者某些特定人群進(jìn)行大范圍的篩檢，也可 以為臨床上Mur抗原的檢測和鑒定及配血工作提供有效的參考。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題是提供一種能特異性檢測Mur抗原基因的試劑及檢 測方法，該方法簡便快速、敏感特異且結(jié)果可靠。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的一個(gè)技術(shù)方案是：提供一種能特異性檢測 Mur抗原基因的試劑及檢測方法,包括2X預(yù)混液、Mur上游引物、Mur下游引物、內(nèi)參上游 引物、內(nèi)參下游引物和無 DNA酶/RNA酶的水，所述Mur上游引物和Mur下游引物為2條特 異性寡核苷酸引物，所述Mur上游引物為5' ACATATCCAGCTCATACTGC 3'，所述Mur下游引物 為 5' CTAAGAACATACCGGTTT 3'。
[0008] 在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述內(nèi)參上游引物和內(nèi)參下游引物為2條特異性寡 核苷酸引物，所述內(nèi)參上游引物為5' CCTAATAGTGCGGTGGTG 3'，所述內(nèi)參下游引物為5' TGAGGTGACTGCGTGGA 3,。
[0009] 在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述2X預(yù)混液由Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、 MgCl2、反應(yīng)緩沖液和染料配制而成。
[0010] 提供一種能特異性檢測Mur抗原基因的方法，包括步驟為：將血液基因組與所述 能特異性檢測Mur抗原基因的試劑混合進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，再將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定。
[0011] 在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述PCR反應(yīng)體系中各組分的比例為：當(dāng)所述PCR反 應(yīng)體系為25 μ L時(shí)，所述2 X預(yù)混液為12. 5 μ L，所述濃度為10 μ M/L的Mur上游引物為 0.5 μ L，所述濃度為10 μ M/L的Mur下游引物為0.5 μ L，所述濃度為10 μ M/L的內(nèi)參上游 引物為0.5 μ L,所述濃度為ΙΟμΜ/L的內(nèi)參下游引物為0.5 μ L,所述血液基因組為20-50 ng，所述無 DNA酶/RNA酶的水補(bǔ)足至25 μ L，所述PCR反應(yīng)體系為25 μ L或50 μ L。
[0012] 在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述方法中陽性對照是將陽性對照基因與所述能特 異性檢測Mur抗原基因的試劑混合進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，再將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳得到結(jié)果，所 述陽性對照基因?yàn)楹蠱ur抗原基因的DNA片段。
[0013] 在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中,所述Mur上游引物和Mur下游引物的PCR產(chǎn)物大小 為250 bp，所述內(nèi)參上游引物和內(nèi)參下游引物的PCR產(chǎn)物大小為100 bp。
[0014] 在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述電泳鑒定是在1. 5%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行的。
[0015] 在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述Mur上游引物、所述Mur下游引物、所述內(nèi)參上 游引物和所述內(nèi)參下游引物所用的退火溫度為56. 5°C。
[0016] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的能特異性檢測Mur抗原基因的試劑及檢測方法， 利用了 Mur抗原基因特異性的引物建立了簡便快速、敏感特異的檢測Miltenberger血型中 Mur抗原基因的PCR-SSP方法，該方法突破了傳統(tǒng)血清學(xué)檢測方法的限制，檢測結(jié)果準(zhǔn)確， 有利于大規(guī)模、自動(dòng)化的對Mur抗原進(jìn)行篩檢，也可以為臨床上Mur抗原的檢測和鑒定及配 血工作提供有效的參考，保障臨床上的輸血安全。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例描述中所需要使 用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對于 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它 的附圖，其中： 圖1是本發(fā)明的空白對照、陽性對照、人血液基因組經(jīng)過特異性檢測Mur抗原基因后的 結(jié)果示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面將對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施 例僅是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其它實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范 圍。
[0019] 實(shí)施方案：涉及的試劑有：試劑盒中包括250 μ L的2X預(yù)混液、I mL無 RNA酶/ DNA酶水、25 μ L濃度為10 μ Μ/L的Mur上游引物和25 μ L濃度為10 μ Μ/L的Mur下游 引物、25 μ L濃度為10 μ M/L的內(nèi)參上游引物和25 μ L濃度為10 μ M/L的內(nèi)參下游引 物，25 μ L陽性對照。
[0020] 2Χ預(yù)混液是近岸蛋白質(zhì)科技有限公司的產(chǎn)品，其成分是由Taq DNA聚合酶、dNTP 混合物、MgCl2以及反應(yīng)緩沖液和染料預(yù)先配制成的混合物。
[0021] 所述Mur上游引物和Mur下游引物為2條特異性寡核苷酸引物，所述Mur上游引 物為 5 ' ACATATCCAGCTCATACTGC 3 '，所述 Mur 下游引物為 5 ' CTAAGAACATACCGGTTT 3 '。 所述內(nèi)參上游引物和內(nèi)參下游引物為2條特異性寡核苷酸引物，所述內(nèi)參上游引物為5' CCTAATAGTGCGGTGGTG 3'，所述內(nèi)參下游引物為 5' TGAGGTGACTGCGTGGA 3'。
[0022] 本實(shí)施例中陰性對照為無 RM酶/DNA酶水對照，即為空白對照；陽性對照為本發(fā) 明中構(gòu)建的含有Mur抗原基因的DNA片段；取人的新鮮抗凝血200 μ L，按照血液基因組提 取試劑盒的操作步驟，提取人的血液基因組，利用NanoDrop 2000測定血液基因組的濃度 以及純度。
[0023] 將試劑盒中的試劑按比例加入，反應(yīng)體系可以為25 μ L或50 μ L，具體比例見下 表：

【權(quán)利要求】
1. 一種能特異性檢測Mur抗原基因的試劑，其特征在于，包括2X預(yù)混液、Mur上 游引物、Mur下游引物、內(nèi)參上游引物、內(nèi)參下游引物和無DNA酶/RNA酶的水，所述 Mur上游引物和Mur下游引物為2條特異性寡核苷酸引物，所述Mur上游引物為5' ACATATCCAGCTCATACTGC 3'，所述 Mur 下游引物為 5' CTAAGAACATACCGGITT 3'。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于，所述內(nèi)參上游引物和內(nèi)參下游引物為2條 特異性寡核苷酸引物，所述內(nèi)參上游引物為5' CCTAATAGTGCGGTGGTG 3'，所述內(nèi)參下游引 物為 5' TGAGGTGACTGCGTGGA 3'。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于，所述2X預(yù)混液由Taq DNA聚合酶、dNTP 混合物、MgCl2、反應(yīng)緩沖液和染料配制而成。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性檢測Mur抗原基因的方法，其特征在于，包括步驟為： 將血液基因組與所述能特異性檢測Mur抗原基因的試劑混合進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，再將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于，所述PCR反應(yīng)體系中各組分的比例 為：當(dāng)所述PCR反應(yīng)體系為25 yL時(shí)，所述2X預(yù)混液為12. 5 yL，所述濃度為10iiM/L 的Mur上游引物為0.5 iiL，所述濃度為10 yM/L的Mur下游引物為0.5 iiL，所述濃度為 10yM/L的內(nèi)參上游引物為0. 5 yL，所述濃度為10iiM/L的內(nèi)參下游引物為0. 5 yL，所 述血液基因組為20-50 ng，所述無DNA酶/RNA酶的水補(bǔ)足至25 iiL，所述PCR反應(yīng)體系為 25 u L 或 50 u L。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于，所述方法中陽性對照是將陽性對照 基因與所述能特異性檢測Mur抗原基因的試劑混合進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，再將PCR產(chǎn)物進(jìn)行 電泳得到結(jié)果，所述陽性對照基因?yàn)楹蠱ur抗原基因的DNA片段。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于，所述Mur上游引物和Mur下游引物的 PCR產(chǎn)物大小為250 bp，所述內(nèi)參上游引物和內(nèi)參下游引物的PCR產(chǎn)物大小為100 bp。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于，所述電泳鑒定是在1. 5%的瓊脂糖凝 膠中進(jìn)行的。
9. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于，所述Mur上游引物、所述Mur下游引 物、所述內(nèi)參上游引物和所述內(nèi)參下游引物所用的退火溫度為56. 5°C。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104372073SQ201410393026
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年8月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月12日
【發(fā)明者】魏雙施, 李勇, 蒙青林, 王紅梅, 段生寶, 田晶晶, 丁少華, 陳曄洲, 李冬 申請人:中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所