用于同源重組的線性sumo載體的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于同源重組的線性SUMO載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟：(1)合成DNA片段，其中含有限制性內(nèi)切酶識別位點和SUMO標簽的核苷酸序列；(2)設(shè)計帶有限制性內(nèi)切酶識別位點的引物，擴增DNA片段，雙酶切，回收；(3)PCR方法擴增pET表達載體,雙酶切，回收；(4)產(chǎn)物連接，得到載體前體；用限制性內(nèi)切酶SfoI或MscI消化載體前體，得到用于同源重組的線性SUMO載體。本發(fā)明可以以商品化pET表達載體為基礎(chǔ)，基礎(chǔ)載體選擇面廣，方便靈活，重復(fù)性強，獲得的用于同源重組的線性SUMO載體使用方便，方法方便快捷，不會發(fā)生載體自連現(xiàn)象，是表達SUMO融合蛋白的有力工具。
【專利說明】用于同源重組的線性SUMO載體的構(gòu)建方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種用于同源重組的線性SUM0載體 的構(gòu)建方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 基因重組技術(shù)是現(xiàn)代基因工程研究的一項基本技術(shù)，這種操作可把特定的基因整 合到載體上，并使之在受體細胞中增值表達。分離純化供體生物遺傳物質(zhì)，用PCR擴增方法 在兩端加上特定限制酶識別位點，酶切處理后與適當載體連接，形成重組分子，然后轉(zhuǎn)入受 體細胞中增值表達。
[0003] 為了方便表達產(chǎn)物純化，一般在目的蛋白之前加上特定標簽，但有些蛋白的活性 受標簽影響較大，需要在純化后將標簽切除。SUM0蛋白酶以非常特異的方式切割重組蛋白 的SUM0標簽，因此含SUM0標簽的表達載體應(yīng)用廣泛。但目前的使用方法均為在目的蛋白 基因兩端設(shè)計與載體相同的酶切位點，載體和目的基因分別雙酶切后純化回收，再將目的 序列和載體經(jīng)T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)入宿主細胞。操作繁瑣，成本較高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于同源重組的SUM0載體的構(gòu) 建方法。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：
[0006] -種用于同源重組的線性SUM0載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟：
[0007] (1)合成SEQ ID NO. 1所示的第一合成片段，所述第一合成片段的第439-444的 6個核苷酸為限制性內(nèi)切酶Sfol識別序列，第151-441的291個核苷酸為改進后的第一種 SUM0標簽的核苷酸序列；
[0008] (2)設(shè)計帶有限制性內(nèi)切酶識別位點的引物，PCR方法擴增第一合成片段，使第一 合成片段兩端帶有限制性內(nèi)切酶識別位點，雙酶切，回收；
[0009] (3)設(shè)計帶有與步驟⑵相同的限制性內(nèi)切酶識別位點的引物，PCR方法擴增pET 表達載體，得到兩端帶有限制性內(nèi)切酶識別位點的? promoter、T7 terminator外側(cè)的線 性PCR產(chǎn)物，雙酶切，回收；
[0010] (4)將步驟（2)和步驟（3)回收的產(chǎn)物連接，得到第一種載體前體；用限制性內(nèi)切 酶Sfol消化第一種載體前體，得到用于同源重組的線性SUM0載體。
[0011] pET 表達載體優(yōu)選：pET28a、pET28b 或 pET42a。
[0012] 另一種用于同源重組的線性SUMO載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟：
[0013] (1)合成SEQ ID N0. 2所示的第二合成片段，所述第二合成片段的第438-443的 6個核苷酸為限制性內(nèi)切酶MscI識別序列，第151-440的290個核苷酸為改進后的第二種 SUM0標簽的核苷酸序列；
[0014] (2)設(shè)計帶有限制性內(nèi)切酶識別位點的引物，PCR方法擴增第二合成片段，使第二 合成片段兩端帶有限制性內(nèi)切酶識別位點，雙酶切，回收；
[0015] (3)設(shè)計帶有與步驟⑵相同的限制性內(nèi)切酶識別位點的引物，PCR方法擴增pET 表達載體，得到兩端帶有限制性內(nèi)切酶識別位點的? promoter、T7 terminator外側(cè)的線 性PCR產(chǎn)物，雙酶切，回收；
[0016] (4)將步驟（2)和步驟（3)回收的產(chǎn)物連接，得到第二種載體前體；用限制性內(nèi)切 酶MscI消化第二種載體前體，得到用于同源重組的線性SUM0載體。
[0017] pET 表達載體優(yōu)選：pET28a、pET28b 或 pET42a。
[0018] 本發(fā)明的優(yōu)點：本發(fā)明可以以商品化pET系列表達載體為基礎(chǔ)，基礎(chǔ)載體選擇面 廣，方便靈活，重復(fù)性強，可按照實驗室現(xiàn)有載體情況選擇限制性內(nèi)切酶Sfol或限制性內(nèi) 切酶MscI進行酶切。以pET28a載體為例，該載體上沒有限制性內(nèi)切酶MscI識別序列，因 此不用進行突變，將合成片段與PET表達載體PCR擴增產(chǎn)物連接獲得質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶 MscI酶切質(zhì)粒即可獲得用于同源重組的線性SUM0載體。
[0019] 若所選載體中含有相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶識別序列，首先將合成片段與pET表達載 體PCR擴增產(chǎn)物連接獲得質(zhì)粒，再進行點突變，將多余限制性內(nèi)切酶識別序列去除之后，用 限制性內(nèi)切酶Sfol或限制性內(nèi)切酶MscI酶切質(zhì)粒即可獲得用于同源重組的線性SUM0載 體。
[0020] 以本發(fā)明的構(gòu)建方法獲得的用于同源重組的線性SUM0載體使用方便，和帶有多 克隆位點的SUM0環(huán)狀載體相比省去了現(xiàn)有雙酶切載體和目的蛋白核酸序列，然后回收酶 切產(chǎn)物，再進行載體和目的片段的體外連接等步驟，本發(fā)明只需將載體及目的片段以線性 的形式轉(zhuǎn)入載體進行同源重組連接，方法方便快捷，不會發(fā)生載體自連現(xiàn)象，是表達SUM0 融合蛋白的有力工具。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1為實施例2同源重組菌落PCR檢測。其中，第1道為200bp ladder第2至8 道為菌落PCR結(jié)果。
[0022] 圖2為實施例4同源重組菌落PCR檢測。其中，第1道為200bp ladder第2至8 道為菌落PCR結(jié)果。

【具體實施方式】
[0023] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
[0024] 下述的實施例不以任何形式限制本發(fā)明，凡采用等同替換或等效變換的方式所獲 得的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明的保護范圍。
[0025] 為方便起見選擇帶有適合于后期目的蛋白表達標記基因的載體，載體中如果帶有 T7promoter、T7 terminator基因則在其兩端設(shè)計引物，PCR產(chǎn)物為除去T7 promoter、T7 terminator之外的全部序列，并在引物5'端設(shè)計限制性內(nèi)切酶識別位點，如Hind III內(nèi)切 酶識別位點AAGCTT和EcoRI內(nèi)切酶識別位點GAATTC，PCR后回收純化線性載體前體。
[0026] 下面各實施例中的合成片段和引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成。
[0027] 實施例1
[0028] -種用于同源重組的線性SUM0載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟：
[0029] (1)合成SEQ ID NO. 1所述的第一合成片段；第一合成片段的第439-444的6個 核苷酸為限制性內(nèi)切酶Sfol識別序列，第151-441的291個核苷酸為改進后的第一種SUM0 標簽的核苷酸序列；
[0030] (2)設(shè)計第一人工合成序列引物，第二上游引物為： CCAAGCTTCGATCCCGCGAAATT(SEQ ID N0. 5 所示）帶有 Hind III 內(nèi)切酶識別位點 AAGCTT，第 二下游引物為：
[0031] CGGAATTCCAAAAAACCCCTCAAGA(SEQ ID N0. 6 所示）帶有 EcoRI 內(nèi)切酶識別位點 GAATTC，用Phiision?超保真PCR Master Mix擴增目的片段。反應(yīng)體系如下：
[0032] 第…人丨：介成)V段（SEQ丨DN0.丨）丨OOpg/μΙ ΙμΙ ΙΟμΜ第：丨游引物 ΙμΙ !?)μΜ第：下游引物 ΙμΙ 2x Phusion Master Mix 25μΙ 水 22μ1 總體枳 50μ1 反應(yīng)程印：98 Γ 30s 981： 10s 70r 15s 72 Γ 30s 30個循'環(huán) 72'.C 5min
[0033] 用上海生工SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒，回收PCR產(chǎn)物。
[0034] (3)選擇商品化載體pET28a，設(shè)計引物，第一上游引物為：
[0035] CCAAGCTTCGATCCTCTACGCC(SEQ ID N0. 3 所示），帶有 Hind III 內(nèi)切酶識別位點 AAGCTT ;第一下游引物：CGGAATTCCTGAAAGGAGGAACTAT(SEQ ID N0. 4 所示）。帶有 EcoRI 內(nèi) 切酶識別位點GAATTC，用Phusion?超保真PCR Master Mix擴增目的片段，Phusion?超保 真 PCR Master Mix 購自 NEW ENGLAND BioLabs，反應(yīng)體系如下：
[0036] pET28a lOOpg/μΙ ΙμΙ 10μΜ第--上游引物 ΙμΙ 10μΜ第--下游引物 1神 2x Phusion Master Mix 25μΙ 水 22μ1 總體枳 50μ1 反應(yīng)程序：98 °C 30s 98 °C 10s 65 °C 15s
[0037] 72 ? 3min 30個循環(huán) 1TC 5mm
[0038] 用上海生工SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒，回收PCR產(chǎn)物（兩端帶有限制性 內(nèi)切酶識別位點的T7 promoter、T7 terminator外側(cè)的線性PCR產(chǎn)物）。
[0039] (4)用限制性內(nèi)切酶Hind III和EcoR I分別對步驟（2)、（3)的PCR產(chǎn)物進行酶 切，反應(yīng)體系如下：
[0040] NEBuffcr(10x) 5μΙ HindM(10U4il) Ιμ? EcoR I (lOU/μ!) ΙμΙ 步驟（2)產(chǎn)物（步驟（3)產(chǎn)物） 10μΙ 水 33μΙ 總體積 50μ1
[0041] 反應(yīng)條件為37°C 3小時。用上海生工SanPr印柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒，回收酶 切產(chǎn)物。
[0042] (5)用T4 DNA連接酶將酶切產(chǎn)物連接，T4 DNA連接酶購自NEW ENGLAND BioLabs， 反應(yīng)體系如下：
[0043] 10x T4 DNA ligase Buffer 2μ1 瞻切后的步 (2)產(chǎn)物 5μ1 _切后的步_ (3)產(chǎn)物 2μ1 Τ4 DNA ligase ΙμΙ 水 10μ! 總體積 20μΙ
[0044] 反應(yīng)條件為16°C 16小時，得到連接產(chǎn)物（第一種載體前體）。
[0045] (6)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a菌株感受態(tài)細胞，先在液體LB培養(yǎng)基中 37°C，300rpm培養(yǎng)1小時后，在50ng/ml kan抗性LB固體平板培養(yǎng)基上進行篩選，獲得陽性 轉(zhuǎn)化子。并將陽性轉(zhuǎn)化子接種于含有50ng/ml kan的液體LB培養(yǎng)基中，在37°C搖床中振蕩 培養(yǎng)過夜。利用生工生物工程（上海）有限公司所生產(chǎn)的"SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽 提試劑盒"按照其操作說明提取質(zhì)粒DNA。
[0046] (7)序列中除了第一種SUM0標簽核苷酸序列末端的限制性內(nèi)切酶Sfol識別序 列外，還有4個限制性內(nèi)切酶Sfol識別序列GGCGCC，依次設(shè)計引物將這4個GGCGCC改為 GGAGCC，用高保真DNA聚合酶擴增，回收擴增產(chǎn)物，平末端連接。引物序列如下：
[0047] 第三上游引物：TCCCAATACGCAAACCGCC(SEQ ID N0. 7)
[0048] 第三下游引物：GCCAGGGTGGTTTTTCTTTTC(SEQ ID Ν0· 8)
[0049] PCR反應(yīng)體系及程序參照步驟（3)(用第三上、下游引物替換第一上、下游引物）， 純化回收PCR產(chǎn)物，用T4 PNK酶進行磷酸化修飾，T4 PNK購自NEW ENGLAND BioLabs，再 用T4 DNA連接酶連接，連接反應(yīng)參照步驟（5)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a菌株感受 態(tài)細胞，先在液體LB培養(yǎng)基中37°C，300rpm培養(yǎng)1小時后，在50ng/ml kan抗性LB固體平 板培養(yǎng)基上進行篩選，獲得陽性轉(zhuǎn)化子。并將陽性轉(zhuǎn)化子接種于含有50ng/ml kan的液體 LB培養(yǎng)基中，在37°C搖床中振蕩培養(yǎng)過夜。利用生工生物工程（上海）有限公司所生產(chǎn)的 "SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒"按照其操作說明提取質(zhì)粒DNA。
[0050] T4 PNK磷酸化修飾反應(yīng)條件如下：
[0051] T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer 10x 5μ1 PCR 產(chǎn)物 10μ1 ΑΤΡΙΟηιΜ 5μ! T4 Polynucleotide Kinase Ιμ? 水 29μ1 總體積 50μ1
[0052] 反應(yīng)條件為37°C，30min，產(chǎn)物可直接用于連接。
[0053] (8)繼續(xù)修改內(nèi)切酶Sfol識別序列GGCGCC，引物如下：
[0054] 第四上游引物：TCCATCTCCTTGCATGCACCA(SEQ ID N0. 9)
[0055] 第四下游引物：GCCCAACAGTCCCCCGG(SEQ ID Ν0· 10)
[0056] 第五上游引物：TCCTATATCGCCGACATCACCG(SEQ ID Ν0· 11)
[0057] 第五下游引物：GCCAGCAACCGCACCTGTG(SEQ ID NO. 12)
[0058] 第六上游引物：TCCACAGGTGCGGTTGCTG(SEQ ID NO. 13)
[0059] 第六下游引物：GCCGGTGATGCCGGCC(SEQ ID NO. 14)
[0060] 用上述引物依次替換步驟（7)中的引物，其它同步驟（7)。
[0061] (9)經(jīng)過步驟（7)和步驟⑶的突變過程，只剩下第一種SUM0標簽核苷酸序列末 端的限制性內(nèi)切酶Sfol識別序列GGCGCC，用Sfol酶切質(zhì)粒DNA即得到第一種用于同源重 組的線性SUM0載體。
[0062] Sfol反Μ體系如卜： NEBuiTer(lOx) 5μΙ Slol I μ丨 步驟（8)產(chǎn)物 10μΙ 水 3φ1 總缽積 50μ1
[0063] 反應(yīng)條件為37°C 3小時。用上海生工SanPr印柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒，回收酶 切產(chǎn)物即得到第一種用于同源重組的線性SUM0載體。
[0064] pET表達載體選用pET28b時，設(shè)計相應(yīng)的引物，采作本實施例的方法，可以制備得 到相應(yīng)的用于同源重組的線性SUM0載體。
[0065] pET表達載體選用pET42a時，設(shè)計相應(yīng)的引物，采作本實施例的方法，可以制備得 到相應(yīng)的用于同源重組的線性SUMO載體。
[0066] 實施例2
[0067] 以綠色熒光蛋白GFP為例，以同源重組的方式構(gòu)建SUM0-GFP融合蛋白。
[0068] (1)設(shè)計引物擴增GFP基因，并在兩端帶有線性SUM0載體的同源區(qū)域，第七上游引 物為：AGATTGGTGGCATGGTGAGCAAG(SEQ ID N0. 15 所示），第七下游引物為：AGATCCGGCTGCTA TTACTTGTACAGCT(SEQ ID N0. 16 所示）
[0069] PCR反應(yīng)體系如下：
[0070]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于同源重組的線性SUMO載體的構(gòu)建方法，其特征是包括如下步驟： (1) 合成SEQ ID NO. 1所示的第一合成片段，所述第一合成片段的第439-444的6個 核苷酸為限制性內(nèi)切酶Sfol識別序列，第151-441的291個核苷酸為改進后的第一種SUMO 標簽的核苷酸序列； (2) 設(shè)計帶有限制性內(nèi)切酶識別位點的引物，PCR方法擴增第一合成片段，使第一合成 片段兩端帶有限制性內(nèi)切酶識別位點，雙酶切，回收； (3) 設(shè)計帶有與步驟（2)相同的限制性內(nèi)切酶識別位點的引物，PCR方法擴增pET表 達載體，得到兩端帶有限制性內(nèi)切酶識別位點的? promoter、T7 terminator外側(cè)的線性 PCR產(chǎn)物，雙酶切，回收； (4) 將步驟（2)和步驟（3)回收的產(chǎn)物連接，得到第一種載體前體；用限制性內(nèi)切酶 Sfol消化第一種載體前體，得到用于同源重組的線性SUMO載體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于同源重組的線性SUMO載體的構(gòu)建方法，其特征是所 述 pET 表達載體為 pET28a、pET28b 或 pET42a。
3. -種用于同源重組的線性SUMO載體的構(gòu)建方法，其特征是包括如下步驟： (1) 合成SEQ ID NO. 2所示的第二合成片段，所述第二合成片段的第438-443的6個 核苷酸為限制性內(nèi)切酶MscI識別序列，第151-440的290個核苷酸為改進后的第二種SUMO 標簽的核苷酸序列； (2) 設(shè)計帶有限制性內(nèi)切酶識別位點的引物，PCR方法擴增第二合成片段，使第二合成 片段兩端帶有限制性內(nèi)切酶識別位點，雙酶切，回收； (3) 設(shè)計帶有與步驟（2)相同的限制性內(nèi)切酶識別位點的引物，PCR方法擴增pET表 達載體，得到兩端帶有限制性內(nèi)切酶識別位點的? promoter、T7 terminator外側(cè)的線性 PCR產(chǎn)物，雙酶切，回收； (4) 將步驟（2)和步驟（3)回收的產(chǎn)物連接，得到第二種載體前體；用限制性內(nèi)切酶 MscI消化第二種載體前體，得到用于同源重組的線性SUMO載體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種用于同源重組的線性SUMO載體的構(gòu)建方法，其特征是所 述 pET 表達載體為 pET28a、pET28b 或 pET42a。
【文檔編號】C12N15/66GK104140976SQ201410389646
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2014年8月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月8日
【發(fā)明者】田方, 張濤, 徐彬 申請人:天津謙泰生物技術(shù)有限公司