基于mRNA響應(yīng)的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)變速流控制方法及系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于mRNA響應(yīng)的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)變速流控制方法及系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)協(xié)同調(diào)控循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的生物濾器與微生物響應(yīng)。通過獲取功能微生物氨氧化菌AOB(Ammonia?Oxidizing?Bacteria)的mRNA實(shí)時(shí)表達(dá)量，在AOB的mRNA響應(yīng)高表達(dá)時(shí)間段，提高系統(tǒng)流速，在響應(yīng)低表達(dá)時(shí)間段，降低系統(tǒng)流速。本發(fā)明從工廠化養(yǎng)殖水處理工藝與微生物響應(yīng)協(xié)同調(diào)控的角度出發(fā)，解決了現(xiàn)有養(yǎng)殖水處理生物濾器處理效率低、運(yùn)行能耗偏大等問題。
【專利說明】基于mRNA響應(yīng)的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)變速流控制方法及系統(tǒng)

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖水處理技術(shù)，尤其涉及一種工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)生物濾器 高效精準(zhǔn)節(jié)能的變速流控制方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)因具有資源節(jié)約、環(huán)境友好的特點(diǎn)，已成為世界范圍內(nèi)大 力推崇發(fā)展的水產(chǎn)養(yǎng)殖模式。在超高密度集約化養(yǎng)殖條件下，其系統(tǒng)的核心處理技術(shù)為生 物過濾，方式主要為通過配置生物濾器，利用定向富集在濾料表面的微生物完成水體主要 污染物總氨氮TAN(Total Ammonia Nitrogen)與亞硝酸鹽（NOf-N)的去除。其過程主要 通過功能微生物群的硝化作用，將總氮氮TAN等通過氨氧化細(xì)菌AOB (Ammonia Oxidizing Bacteria)具有的氨單加氧酶催化氧化為羥胺，再由羥胺氧化為中間產(chǎn)物亞硝酸鹽，最后由 亞硝酸鹽氧化菌NOB (Nitrite Oxidizing Bacteria)將亞硝酸氧化成對養(yǎng)殖對象相對無害 的硝酸鹽（NCV-N)，全反應(yīng)限速步奏為式①，相關(guān)化學(xué)簡式如下：
[0003] NH3+02+2H+ - ΝΗ20Η+Η20 ①
[0004] ΝΗ20Η+Η20 - Ν02>5Γ ②
[0005] N(T+C02+0· 502 - Ν(Γ ③
[0006] 在實(shí)際生產(chǎn)實(shí)踐中，系統(tǒng)養(yǎng)殖規(guī)模（餌料投喂量）與生物濾器的有效容積均已固 定，其生物濾器總處理性能主要與流速有關(guān)。為維持高密度養(yǎng)殖負(fù)荷下較適宜的水質(zhì)條 件，系統(tǒng)運(yùn)行過程需要較高的流速，通常循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的水力停留時(shí)間HRT (Hydrau 1 ic Retention Time)為0· 5_lh，即生物濾器日均循環(huán)24-48次。
[0007] 然而上述生物濾器恒速運(yùn)行方法仍然面臨如下弊端：在穩(wěn)定運(yùn)行的循環(huán)水養(yǎng)殖系 統(tǒng)內(nèi)，生物濾器內(nèi)污染物總氨氮TAN主要源于養(yǎng)殖對象排氨，而相關(guān)的排氨速率則主要與 飼料量及投喂節(jié)律有關(guān)，系統(tǒng)水質(zhì)日變化呈現(xiàn)相對"峰-谷"濃度，因此維持系統(tǒng)較高恒速 流動，雖可確保水質(zhì)穩(wěn)定，但在污染物濃度峰值時(shí)間段內(nèi)，生物濾器基質(zhì)來源因流速恒定受 限，在谷值時(shí)間段，則因低基質(zhì)濃度使其處于低效運(yùn)行，故生物濾器單次循環(huán)處理效率偏 低。為達(dá)到總污染物處理量，系統(tǒng)需維持較高流速，從而造成整體能耗偏高。
[0008] 由于循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水體始終處于內(nèi)部循環(huán)，故其某時(shí)間節(jié)點(diǎn)的污染物濃度值為 養(yǎng)殖對象排氨、生物濾器處理后的最終結(jié)果，若以此為依據(jù)實(shí)現(xiàn)變速流控制，其信息來源滯 后，僅從表觀層面被動改變系統(tǒng)流速，無法有效提高系統(tǒng)生物濾器單次處理效能，其需依靠 犧牲系統(tǒng)水質(zhì)實(shí)現(xiàn)節(jié)能。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于mRNA響應(yīng)的循環(huán)水養(yǎng)殖系 統(tǒng)變速流控制方法及系統(tǒng)，從而實(shí)現(xiàn)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)運(yùn)行節(jié)能降耗。
[0010] 本發(fā)明通過檢測單投喂周期內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)生物濾器內(nèi)濾料表面功能微生物 Α0Β編碼氨單加氧酶的amoA基因的mRNA響應(yīng)表達(dá)量，在其高表達(dá)時(shí)間段提高系統(tǒng)流速，以 供應(yīng)更多基質(zhì)用于其mRNA轉(zhuǎn)錄，在低表達(dá)時(shí)間段，降低流速實(shí)現(xiàn)節(jié)能。由于amoA基因的 mRNA編碼產(chǎn)物為氨單加氧酶（功能蛋白質(zhì)），其作用為硝化過程催化總氨氮氧化為羥胺的 限速步奏關(guān)鍵酶，且蛋白質(zhì)的半衰期長于mRNA半衰期，故通過提升mRNA高表達(dá)段的流速， 可促使功能微生物A0B實(shí)現(xiàn)氨單加氧酶的有效積累，從而可為降低流速時(shí)間段生物濾器仍 具有較高處理性能奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。本發(fā)明依據(jù)上述原理，進(jìn)行生物濾器精準(zhǔn)調(diào)控與變速流 運(yùn)行，通過提升其單次處理效能，實(shí)現(xiàn)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)總流量削減與節(jié)能。
[0011] 一種基于mRNA響應(yīng)的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)變速流控制方法，協(xié)同調(diào)控循環(huán)水養(yǎng)殖系 統(tǒng)的生物濾器與微生物響應(yīng)，獲取功能微生物Α0Β的mRNA實(shí)時(shí)表達(dá)量，在Α0Β的mRNA響應(yīng) 高表達(dá)時(shí)間段，提高系統(tǒng)流速,在響應(yīng)低表達(dá)時(shí)間段，降低系統(tǒng)流速。
[0012] 其實(shí)施的基本流程為：
[0013] 1)、對投喂周期內(nèi)的系統(tǒng)水質(zhì)進(jìn)行監(jiān)測；
[0014] 2)、對投喂周期內(nèi)生物濾器的濾料表面功能微生物Α0Β的mRNA響應(yīng)表達(dá)水平進(jìn)行 監(jiān)測；
[0015] 3)、分析得到投喂周期內(nèi)功能微生物Α0Β的mRNA高表達(dá)與低表達(dá)時(shí)間段；
[0016] 4)、綜合水質(zhì)數(shù)據(jù)，對功能微生物Α0Β的mRNA高表達(dá)峰值前后lh時(shí)間段提高系統(tǒng) 流速10-30%，對mRNA低表達(dá)時(shí)間段降低流速20-50%。
[0017] 所述的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)，主要采用固液分離-生物凈化兩級處理手段去除系統(tǒng)污 染物，且運(yùn)行穩(wěn)定。
[0018] 所述的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)，其單投喂周期內(nèi)餌料投加量A(kg)與生物濾器有效容積 B(m3)間的比值，A/B彡6.67。
[0019] 所述的Α0Β的mRNA響應(yīng)高表達(dá)與低表達(dá)判斷依據(jù)，高表達(dá)值C與低表達(dá)值D間的 比值C/D彡5,或具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P〈0. 1)，所述的表達(dá)值單位為堿基拷貝數(shù)/yg RNA。
[0020] 所述的系統(tǒng)內(nèi)水體總氨氮TAN(Total Ammonia Nitrogen)濃度彡3. Omg/L時(shí)，無 論生物濾器功能微生物Α0Β的mRNA響應(yīng)表達(dá)情況，系統(tǒng)運(yùn)行均不減速。
[0021] 一種采用所述方法的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)，采用變速流控制的裝置。
[0022] 本發(fā)明的有益效果是，通過改變傳統(tǒng)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)生物濾器的恒定流速策略， 基于單喂食周期內(nèi)功能微生物Α0Β的mRNA表達(dá)響應(yīng)水平為參考，以分別提升mRNA高表達(dá) 段流速及降低mRNA低表達(dá)段流速為控制措施，實(shí)現(xiàn)生物濾器單次循環(huán)處理效率提升。本發(fā) 明克服了傳統(tǒng)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)運(yùn)行過程生物濾器運(yùn)行策略粗放、整體能耗偏高等弊端，具 有節(jié)能增效、可實(shí)現(xiàn)工程化運(yùn)用等諸多優(yōu)點(diǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1是基于mRNA響應(yīng)的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)變速流控制方法實(shí)施流程圖。

【具體實(shí)施方式】
[0024] 如附圖1所示，本發(fā)明可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：
[0025] 1、本發(fā)明的實(shí)施對象為循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)，其主要為系統(tǒng)污染物去除依靠固液分 離-生物凈化兩級處理手段，且運(yùn)行穩(wěn)定。系統(tǒng)內(nèi)養(yǎng)殖生物量波動小，投喂周期與節(jié)律固 定。
[0026] 2、循環(huán)水系統(tǒng)單投喂周期水質(zhì)狀況監(jiān)測，方法為至投喂時(shí)間點(diǎn)伊始，每間隔lh測 定水質(zhì)中TAN含量，取樣點(diǎn)一般建議需至少包括3處（養(yǎng)殖池2處、生物濾器1處），測定持 續(xù)時(shí)間24h，測定方法可采用萘氏試劑法等國標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)方法，要求測定精度為0. lmg/L。
[0027] 3、生物濾器內(nèi)功能微生物Α0Β的mRNA響應(yīng)表達(dá)監(jiān)測，其實(shí)施方法為：
[0028] 一、樣品前處理
[0029] (1)至投喂時(shí)間點(diǎn)伊始，每間隔lh取生物濾器內(nèi)環(huán)裝濾料3個或微珠濾料30ml， 并立即加入商用RNA保護(hù)液5ml。（2)將樣品放直在磁力振湯器上震湯lOmin后，在尚心機(jī) 上高速離心5min后（運(yùn)行條件4°C，12000轉(zhuǎn)），棄去上清液后，將生物膜泥樣重懸浮至2ml 商用RNA保護(hù)液，并存儲在-80°C待用。
[0030] 二、樣品RNA提取與反轉(zhuǎn)錄cDNA
[0031] (1)采用商用RNA試劑盒進(jìn)行樣品RNA提取，流程依照試劑盒說明書操作。（2)將 提取的總RNA采用商用試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件為42°C，lh ;70°C，15min ;8°C，+ ->。
[0032] 三、功能微生物氨氧化細(xì)菌AOB的mRNA的絕對定量（Rt-qPCR)
[0033] (1)以功能微生物氨氧化細(xì)菌Α0Β的氨單加氧酶編碼段amoA基因?yàn)槟繕?biāo)區(qū)，選 用引物為 amoA-lF/amoA-2R(GGGGITTCTACTGGTGGT/CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC)進(jìn)行擴(kuò)增， PCR 反應(yīng)條件為：（i)95°C，5min ;(ii)95°C，20s ;(iii)55°C，30s ;(iv)72°C，30s ;(v)重 復(fù)（ii)?（iv)步奏40個循環(huán)；(vi)72°C，7min ; (vii)8°C，+ 00 . (2)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法 為；（i)在10μ1 DNA溶液中加入ΙΟΟμΙ感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置30min。然后42°C加熱 45s后，再在冰中放置lmin ; (ii)加入890 μ 1 S0C培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)60min ; (iii)取 100 μ 1細(xì)菌培養(yǎng)液均勻涂布在含有氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基平板上，37°C倒置過夜培 養(yǎng)；（iv)挑選白色菌落，使用PCR法確認(rèn)載體中插入片段的長度大小。（v)采用商用質(zhì)粒提 取試劑盒提取克隆質(zhì)粒，并用微量紫外外分光光度計(jì)測定質(zhì)粒濃度，以梯度稀釋的克隆質(zhì) 粒制備標(biāo)注曲線。（3)以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品氨氧化功能菌Α0Β的mRNA絕對豐度，單位為 (堿基拷貝數(shù)/ μ g RNA)。
[0034] 4、單喂食周期內(nèi)樣品功能菌Α0Β的mRNA表達(dá)程度鑒定
[0035] (1)將各時(shí)間節(jié)點(diǎn)監(jiān)測的功能菌Α0Β的mRNA絕對表達(dá)量以時(shí)間序列繪制曲線圖， 尋找曲線上的"高表達(dá)值"與"低表達(dá)值"。（2)將高表達(dá)值C(堿基拷貝數(shù)/μ g RNA)與低表 達(dá)值D (堿基拷貝數(shù)/ μ g RNA)間的比值進(jìn)行計(jì)算，若C/D彡5，或具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P〈0. 1)， 則認(rèn)為該時(shí)間點(diǎn)即為高表達(dá)值與低表達(dá)值。連續(xù)2個以上高表達(dá)值或低表達(dá)值即可認(rèn)為是 高表達(dá)時(shí)間段或低表達(dá)時(shí)間段。
[0036] 5、基于mRNA響應(yīng)的生物濾器流速調(diào)節(jié)
[0037] (1)綜合水質(zhì)數(shù)據(jù)，對功能微生物Α0Β的mRNA高表達(dá)峰值前后lh時(shí)間段提高系統(tǒng) 流速約10-30%，對mRNA低表達(dá)時(shí)間段降低流速約20-50%。⑵當(dāng)系統(tǒng)內(nèi)水體總氨氮TAN 濃度彡3. 0mg/L時(shí)，無論生物濾器功能微生物mRNA響應(yīng)表達(dá)情況，系統(tǒng)運(yùn)行均不減速。
[0038] 實(shí)施例
[0039] 依據(jù)本發(fā)明方法，對養(yǎng)殖對象為尼羅羅非魚（Oreochromis Niloticus)的循環(huán)水 養(yǎng)殖系統(tǒng)進(jìn)行了效果檢驗(yàn)。其中恒速運(yùn)行時(shí)間33天，變速運(yùn)行時(shí)間36天，變速控制以某變 頻器（VFD-015M)實(shí)現(xiàn)，效果如表1所示。
[0040] 表1實(shí)際循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)變速流實(shí)施效果
[0041]

【權(quán)利要求】
1. 一種基于mRNA響應(yīng)的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)變速流控制方法，其特征在于，協(xié)同調(diào)控循環(huán) 水養(yǎng)殖系統(tǒng)的生物濾器與微生物響應(yīng)，獲取功能微生物AOB的mRNA實(shí)時(shí)表達(dá)量，在AOB的 mRNA響應(yīng)高表達(dá)時(shí)間段，提高系統(tǒng)流速，在響應(yīng)低表達(dá)時(shí)間段，降低系統(tǒng)流速。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，實(shí)施的基本流程為： 1) 、對投喂周期內(nèi)的系統(tǒng)水質(zhì)進(jìn)行監(jiān)測； 2) 、對投喂周期內(nèi)生物濾器內(nèi)濾料表面功能微生物AOB的mRNA響應(yīng)表達(dá)水平進(jìn)行監(jiān) 測； 3) 、分析得到投喂周期內(nèi)功能微生物AOB的mRNA高表達(dá)與低表達(dá)時(shí)間段； 4) 、綜合水質(zhì)數(shù)據(jù)，對功能微生物AOB的mRNA高表達(dá)峰值前后lh時(shí)間段提高系統(tǒng)流速 10-30%，對mRNA低表達(dá)時(shí)間段降低流速20-50%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)，主要采用固液分 離-生物凈化兩級處理手段去除系統(tǒng)污染物，且運(yùn)行穩(wěn)定。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)，其單投喂周期內(nèi) 餌料投加量A (kg)與生物濾器有效容積B (m3)間的比值，A/B < 6.67。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的AOB的mRNA響應(yīng)高表達(dá)與低表達(dá) 判斷依據(jù)，高表達(dá)值C與低表達(dá)值D間的比值C/D > 5,或具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P〈 0.1)，所 述的表達(dá)值單位為堿基拷貝數(shù)/ μ g RNA。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的系統(tǒng)內(nèi)水體總氨氮TAN(Total Ammonia Nitrogen)濃度彡3. Omg/L時(shí)，無論生物濾器功能微生物AOB的mRNA響應(yīng)表達(dá)情 況，系統(tǒng)運(yùn)行均不減速。
7. -種采用如權(quán)利要求1所述方法的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)，其特征在于，采用變速流控制 的裝置。
【文檔編號】C12Q1/68GK104145874SQ201410389617
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月8日
【發(fā)明者】阮贇杰, 朱松明 申請人:浙江大學(xué)