高感受態(tài)大腸桿菌菌株的馴化篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高感受態(tài)大腸桿菌菌株的馴化篩選方法，包括：將攜帶有耐藥基因和負(fù)篩選基因的馴化質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中；利用耐藥基因分離出感受性相對(duì)較高的大腸桿菌，然后使個(gè)別的所述感受性相對(duì)較高的大腸桿菌將馴化質(zhì)粒丟失，再利用負(fù)篩選基因分離出將馴化質(zhì)粒丟失的大腸桿菌；使用所述馴化質(zhì)粒循環(huán)往復(fù)地對(duì)所述將馴化質(zhì)粒丟失的大腸桿菌進(jìn)行多輪篩選，從而制備得到高感受態(tài)的大腸桿菌菌株。本發(fā)明利用同時(shí)具有正、負(fù)篩選基因的馴化質(zhì)粒對(duì)細(xì)菌進(jìn)行多輪篩選，最終獲得可以用來(lái)制備高效感受態(tài)細(xì)菌的新菌株的方法。
【專利說(shuō)明】高感受態(tài)大腸桿菌菌株的馴化篩選方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)與微生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種高感受態(tài)大腸桿菌菌株 的馴化篩選方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌是基因克隆的必須步驟之一。質(zhì)粒是雙鏈環(huán)狀DNA，一般包含數(shù) 千到數(shù)萬(wàn)個(gè)堿基對(duì)，常天然存在與細(xì)菌體內(nèi)。質(zhì)?？稍诩?xì)菌體內(nèi)以數(shù)個(gè)至數(shù)百拷個(gè)貝數(shù)存 在，并作為編碼一定表現(xiàn)型的遺傳物質(zhì)隨細(xì)菌的分裂增殖穩(wěn)定遺傳給子代細(xì)菌，在細(xì)菌群 體中穩(wěn)定存在。以質(zhì)粒為載體的基因克隆是遺傳工程科研與生產(chǎn)的基本方法之一。其基本 原理是以人工改造過(guò)的質(zhì)粒為載體，在體外將目的基因 DNA片段連接、插入質(zhì)粒DNA之中獲 得重組質(zhì)粒后，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌之中。利用質(zhì)?？稍诖竽c桿菌體內(nèi)復(fù)制、增殖 的特點(diǎn)，并利用質(zhì)粒自身編碼的抗性基因表型在抗生素培養(yǎng)基中對(duì)細(xì)菌進(jìn)行篩選培養(yǎng)，最 終獲得純系的，攜帶有大量重組質(zhì)粒的大腸桿菌，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的克隆增殖。在此過(guò)程 中，將體外重組的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化入大腸桿菌是關(guān)鍵步驟之一。這一步驟的效率越高，基因克 隆的成功機(jī)會(huì)就越高。這一效率通常以在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中使用一微克質(zhì)粒DNA所能獲得的大腸 桿菌克隆數(shù)（CFU)來(lái)表示。一般地，從每微克質(zhì)粒DNA獲得10 6CFU是獲得成功轉(zhuǎn)化的最低 要求。當(dāng)轉(zhuǎn)化效率達(dá)到1〇8至l〇9CFU每微克質(zhì)粒DNA時(shí)，克隆工作即可獲得穩(wěn)定地成功保 障。在某些工作中，比如鳥槍法構(gòu)建基因庫(kù)，感受態(tài)細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率對(duì)最終基因庫(kù)的質(zhì)量有 著關(guān)鍵的影響。只有當(dāng)轉(zhuǎn)化效率達(dá)到1〇 8?l〇9CFU每微克質(zhì)粒DNA時(shí)，所構(gòu)建的基因庫(kù)才 能合格。
[0003] 大腸桿菌在自然狀態(tài)下無(wú)法接受外源質(zhì)粒DNA。因此，在質(zhì)粒轉(zhuǎn)化前必須先對(duì)大腸 桿菌進(jìn)行一定的處理，使其成為易于接受外源質(zhì)粒DNA的狀態(tài)，即感受態(tài)大腸桿菌。
[0004] 目前科研與生產(chǎn)中所使用的工具大腸桿菌有多種菌株，它們的遺傳背景各不相 同，生理特性也有差異，這些差異分別有利于各類科研與生產(chǎn)目的。這些菌株對(duì)感受態(tài)制備 方法的反應(yīng)各不相同。因此，不同的制備方法對(duì)同一菌株，同一方法對(duì)不同的菌株，感受態(tài) 細(xì)菌的制備效果均有顯著差異。即使對(duì)易于形成感受態(tài)的菌株，如，DH5alpha而言，只有制 備過(guò)程復(fù)雜，工藝要求教高（需要液氮）的方法才能獲得較好的感受態(tài)制備效果（達(dá)到或 高于10 8CFU每微克質(zhì)粒DNA)。而較簡(jiǎn)單的制備方法，如，氯化鈣法，通常只能達(dá)到106CFU每 微克質(zhì)粒DNA。對(duì)難于形成感受態(tài)的菌株，如，BL21，現(xiàn)有任何方法均不能獲得很滿意的感 受態(tài)制備效果。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提出一種高感受態(tài)大腸桿菌菌株的馴化篩選方法， 通過(guò)多輪選擇性篩選的方法，獲得易于制備高效感受態(tài)細(xì)菌的超級(jí)感受大腸桿菌菌株，以 提高基因克隆過(guò)程中質(zhì)粒DNA對(duì)大腸桿菌的轉(zhuǎn)化效率。
[0006] 基于上述目的，本發(fā)明提供的高感受態(tài)大腸桿菌菌株的馴化篩選方法包括：
[0007] 將攜帶有耐藥基因和負(fù)篩選基因的馴化質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中；
[0008] 利用耐藥基因分離出感受性相對(duì)較高的大腸桿菌，然后使個(gè)別的所述感受性相對(duì) 較高的大腸桿菌將馴化質(zhì)粒丟失，再利用負(fù)篩選基因分離出將馴化質(zhì)粒丟失的大腸桿菌；
[0009] 使用所述馴化質(zhì)粒循環(huán)往復(fù)地對(duì)所述將馴化質(zhì)粒丟失的大腸桿菌進(jìn)行多輪篩選， 從而制備得到高感受態(tài)的大腸桿菌菌株。
[0010] 可選地所述馴化篩選方法包括：
[0011] 1)將攜帶有耐藥基因和負(fù)篩選基因的馴化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中；
[0012] 2)將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含有與所述馴化質(zhì)粒所攜帶的耐藥基因相應(yīng)的抗生素 的LB固體培養(yǎng)基表面，然后置于溫箱中過(guò)夜培養(yǎng)，形成菌斑；
[0013] 3)收集步驟2)中獲得的菌斑，將其接種于LB液體培養(yǎng)基后過(guò)夜培養(yǎng)，使個(gè)別大腸 桿菌將馴化質(zhì)粒丟失；
[0014] 4)將步驟3)中獲得的菌液涂布于含有與所述負(fù)篩選基因相應(yīng)的殺菌物質(zhì)的LB固 體培養(yǎng)基表面，然后置于溫箱中過(guò)夜培養(yǎng)，形成菌斑；
[0015] 5)收集步驟4)中獲得的菌斑，制備感受態(tài)大腸桿菌；
[0016] 6)將所述攜帶有耐藥基因和負(fù)篩選基因的馴化質(zhì)粒再次轉(zhuǎn)入步驟5)的感受態(tài)大 腸桿菌細(xì)胞中，依次重復(fù)步驟2)?步驟4);
[0017] 7)將步驟5)和6)按順序循環(huán)，直至得到高感受態(tài)的大腸桿菌菌株。
[0018] 較佳地，所述步驟1)中馴化質(zhì)粒的用量為所述步驟6)中馴化質(zhì)粒的用量的 500 ?2000 倍。
[0019] 優(yōu)選地，所述步驟2)和步驟4)中的培養(yǎng)溫度為30?37°C。
[0020] 較佳地，所述步驟2)中的培養(yǎng)溫度為40?45 °C。
[0021] 優(yōu)選地，所述馴化過(guò)程的循環(huán)輪數(shù)為12?16輪。
[0022] 可選地，所述大腸桿菌菌株選自DH5alpha，T0P10和BL21中的一種。
[0023] 可選地，所述馴化質(zhì)粒的骨架選自pET28, pucl8和pucl9中的一種。
[0024] 可選地，所述耐藥基因選自卡那霉素基因，氨芐青霉素基因，氯霉素基因和紅霉素 基因中的一種。
[0025] 可選地，所述負(fù)篩選基因選自sacB基因 ，rpsL (strA)基因，tetA基因，pheS基因， thyA基因，lacy基因，gata-1基因和mazF基因中的一種。
[0026] 從上面所述可以看出，本發(fā)明提供的高感受態(tài)大腸桿菌菌株的馴化篩選方法使用 了一正一負(fù)兩個(gè)篩選基因，在利用正篩選基因分離出感受性相對(duì)較高的細(xì)菌后，利用負(fù)篩 選基因分離出將馴化質(zhì)粒丟失的細(xì)菌，進(jìn)而可以使用同一種馴化質(zhì)粒循環(huán)往復(fù)進(jìn)行多輪篩 選，使'有益'突變?cè)诖媪舻募?xì)菌中逐漸積累，最終獲得滿意的菌株。本發(fā)明利用同時(shí)具有 正、負(fù)篩選基因的馴化質(zhì)粒對(duì)細(xì)菌進(jìn)行多輪篩選，最終獲得可以用來(lái)制備高效感受態(tài)細(xì)菌 的新菌株的方法。

【具體實(shí)施方式】
[0027] 為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā) 明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0028] 作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，本發(fā)明提供的高感受態(tài)大腸桿菌菌株的馴化篩選方法 包括以下步驟：
[0029] 1、將sacB基因表達(dá)片段克隆入pET28質(zhì)粒中，獲得用于馴化大腸桿菌感受態(tài)性能 的馴化質(zhì)粒。其中，PET28質(zhì)粒本身攜帶有卡那霉素抗性基因，即該馴化質(zhì)粒攜帶有卡那霉 素抗性基因和來(lái)自于枯草芽孢桿菌的sacB基因。
[0030] 2、采用氯化鈣法制備DH5alpha大腸桿菌感受態(tài)細(xì)菌，形成濃度約為109CFU/mL的 感受態(tài)細(xì)菌懸濁液。
[0031] 具體地，所述感受態(tài)大腸桿菌的制備過(guò)程如下：
[0032] (1)從37°C培養(yǎng)16?20小時(shí)的大腸桿菌固體培養(yǎng)平皿中挑取一個(gè)單菌落（直徑 2?3mm)，接種于一個(gè)含有100ml LB培養(yǎng)基的1L三角燒瓶中。于37°C劇烈振搖培養(yǎng)，直至 600nm波長(zhǎng)下光密度值達(dá)0. 6 (通常需3小時(shí)左右）。
[0033] (2)在無(wú)菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到兩個(gè)無(wú)菌的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10分 鐘。
[0034] (3)于4°C用Sorvall GS3轉(zhuǎn)頭（或與其相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭）以4000轉(zhuǎn)/分離心10分 鐘，以回收細(xì)菌。
[0035] (4)傾棄上清培養(yǎng)液，將離心管倒置1分鐘以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。
[0036] (5)以10ml用冰預(yù)冷的0. 1M氯化鈣水溶液重懸每份沉淀，放置于冰浴上。
[0037] (6)于4°C以4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，以回收細(xì)菌。
[0038] (7)傾棄上清，將離心管倒置1分鐘以使最后殘留的痕量氯化鈣溶液流盡。
[0039] (8)每50ml初始培養(yǎng)物用2ml用冰預(yù)冷的0. 1M氯化鈣水溶液重懸細(xì)菌沉淀，即成 為感受態(tài)大腸桿囷。
[0040] 3、以42°C熱擊的方法將1微克馴化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入上述感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中。優(yōu)選 地，1微克馴化質(zhì)粒對(duì)應(yīng)200 μ L感受態(tài)大腸桿菌懸濁液。
[0041] 具體地，所述感受態(tài)大腸桿菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的過(guò)程如下：
[0042] (1)用無(wú)菌吸頭吸取200 μ L感受態(tài)大腸桿菌懸濁液，轉(zhuǎn)移到于冰上預(yù)冷的無(wú)菌的 1.5ml微量離心管中。
[0043] (2)加入2 μ L的DNA溶液（事先調(diào)整溶液濃度，使DNA總量為1微克），輕輕旋轉(zhuǎn) 以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30分鐘。
[0044] (3)將離心管放入42°C的循環(huán)水浴中，恰恰放置90秒，不要搖動(dòng)離心管。
[0045] (4)快速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻1?2分鐘。
[0046] (5)每個(gè)離心管中加入冰上預(yù)冷的800 μ L的LB培養(yǎng)基。
[0047] (6)將離心管轉(zhuǎn)移到37°C搖床上，溫育45分鐘。
[0048] (7)取100 μ L溫育后的菌液，加入900 μ L的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行（10倍）系列 稀釋，稀釋度從10至1〇3。
[0049] (8)取100 μ L稀釋度103感受態(tài)大腸桿菌懸液均勻涂布于含有100 μ g/ml卡那霉 素的LB固體培養(yǎng)基（平皿）表面。
[0050] (9)倒置平皿，于37°C培養(yǎng)16小時(shí)，平皿上出現(xiàn)的菌落即為獲得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸 桿菌。轉(zhuǎn)化效率（CFU/1 μ g質(zhì)粒）=(平皿表面菌落計(jì)數(shù)X 104) /加入DNA總量（μ g)
[0051] 需要說(shuō)明的是，在步驟（7)中稀釋的目的是為了在步驟（9)的平皿上獲得互不接 觸，且數(shù)目適中，便于計(jì)數(shù)的克隆菌斑。一般而言，在一個(gè)直徑9厘米的平皿上長(zhǎng)出50? 300個(gè)菌斑是最合適的。如果在步驟（6)后不經(jīng)稀釋，把菌液直接涂到平皿上，即使在低轉(zhuǎn) 化效率下（1〇6)，也會(huì)長(zhǎng)出大量菌斑，甚至菌斑之間互相接觸，成了菌膜。這樣，即無(wú)法達(dá)成 獲得純系克隆目的，也無(wú)法正確計(jì)數(shù)菌斑數(shù)目以推算轉(zhuǎn)化效率。在實(shí)際操作中，如果事先難 以估計(jì)轉(zhuǎn)化效率，也就難以確定合適的稀釋度，就將多個(gè)稀釋度的菌液分別涂到平皿上，哪 個(gè)平皿上長(zhǎng)出的菌斑數(shù)目合適就選用哪個(gè)。
[0052] 4、將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌菌液涂布于含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基表面，然后置 37°C溫箱中過(guò)夜培養(yǎng)。此時(shí)，因細(xì)菌的感受態(tài)性能較差，只有部分細(xì)菌在經(jīng)過(guò)制備后能夠成 為感受態(tài)細(xì)菌并在隨后的熱擊轉(zhuǎn)化中獲得馴化質(zhì)粒。而且，只有獲得了馴化質(zhì)粒的細(xì)菌才 能在含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基表面存活、生長(zhǎng)，經(jīng)37°C過(guò)夜培養(yǎng)后形成菌斑。未能成 為感受態(tài)細(xì)菌，無(wú)法獲得馴化質(zhì)粒的細(xì)菌則被培養(yǎng)基中的卡那霉素殺滅。
[0053] 5、用細(xì)菌接種環(huán)收集由步驟4中獲得的菌斑，將其接種于10mL的LB液體培養(yǎng)基 后于42°C振搖過(guò)夜培養(yǎng)。此時(shí)，接種于液體培養(yǎng)基中的全部細(xì)菌中都攜有馴化質(zhì)粒。馴化 質(zhì)粒在大腸桿菌的最適生長(zhǎng)溫度37°C下可以很穩(wěn)定地隨細(xì)菌一起分裂增殖。但在42°C下 其穩(wěn)定性會(huì)有所下降，導(dǎo)致個(gè)別細(xì)菌將馴化質(zhì)粒丟失。
[0054] 6、將100uL從步驟5中獲得的菌液涂布于含有5%蔗糖的LB固體培養(yǎng)基表面，然 后置37°C溫箱中過(guò)夜培養(yǎng)。此時(shí)，絕大部分細(xì)菌中仍攜帶有馴化質(zhì)粒，這些細(xì)菌對(duì)蔗糖敏 感，無(wú)法在含有蔗糖的固體培養(yǎng)基表面存活生長(zhǎng)，只有極少數(shù)將馴化質(zhì)粒丟失的細(xì)菌可以 生長(zhǎng)，并在過(guò)夜培養(yǎng)后形成菌斑。
[0055] 7、收集由步驟6中獲得的菌斑，采用氯化鈣法制備由步驟6得到的細(xì)菌的感受態(tài) 細(xì)菌，并形成濃度約為l〇 9CFU/毫升的感受態(tài)細(xì)菌懸濁液。具體操作過(guò)程可以與上述步驟2 相同。
[0056] 8、按步驟3的方法，將1納克馴化質(zhì)粒再次轉(zhuǎn)化入步驟7的大腸桿菌之中。大幅 減少轉(zhuǎn)化時(shí)馴化質(zhì)粒的用量，使得只有感受性相對(duì)較好的細(xì)菌才能夠獲得馴化質(zhì)粒。優(yōu)選 地，1納克馴化質(zhì)粒對(duì)應(yīng)200 μ L感受態(tài)大腸桿菌懸濁液。
[0057] 9、重復(fù)步驟4至步驟6。
[0058] 10、將步驟7、8、4、5、6按順序循環(huán)重復(fù)，直至獲得滿意的轉(zhuǎn)化效率的菌株。從第二 輪馴化起，均是1納克馴化質(zhì)粒對(duì)應(yīng)200 μ L感受態(tài)大腸桿菌懸濁液。在本實(shí)施例中，可以 經(jīng)15輪馴化，也可以經(jīng)13輪馴化。
[0059] 在沒有獲得該馴化質(zhì)粒時(shí)，大腸桿菌的相關(guān)表現(xiàn)型為卡那霉素敏感且蔗糖耐受。 一旦獲得該馴化質(zhì)粒，則大腸桿菌的相關(guān)表現(xiàn)型改變?yōu)榭敲顾啬褪芮艺崽敲舾?。?dāng)大腸 桿菌將該質(zhì)粒丟失后，則又恢復(fù)卡那霉素敏感且蔗糖耐受的表現(xiàn)型。本發(fā)明利用該馴化質(zhì) 粒作為工具，即可將"易于接受質(zhì)粒轉(zhuǎn)化"這一特性作為人工篩選條件，對(duì)大腸桿菌進(jìn)行多 輪選擇性篩選，最終獲得感受態(tài)性能非常優(yōu)良的變異型菌株。
[0060] 需要說(shuō)明的是，也可以將上述大腸桿菌DH5alpha菌株替換為大腸桿菌Τ0Ρ10菌株 或者大腸桿菌BL21菌株，其他步驟同上述實(shí)施例。
[0061] 作為本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，本發(fā)明提供的高感受態(tài)大腸桿菌菌株的馴化篩選方 法包括以下步驟：
[0062] 1、將sacB基因表達(dá)片段克隆入pucl8質(zhì)粒中，獲得用于馴化大腸桿菌感受態(tài)性能 的馴化質(zhì)粒。其中，pucl8質(zhì)粒本身攜帶有氨芐青霉素抗性基因，即該馴化質(zhì)粒攜帶有氨芐 青霉素抗性基因和來(lái)自于枯草芽孢桿菌的sacB基因。
[0063] 2、采用氯化鈣法制備DH5alpha大腸桿菌感受態(tài)細(xì)菌，形成濃度約為109CFU/mL的 感受態(tài)細(xì)菌懸濁液。
[0064] 3、以42°C熱擊的方法將1. 1微克馴化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入上述感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中。優(yōu) 選地，1. 1微克馴化質(zhì)粒對(duì)應(yīng)200 μ L感受態(tài)大腸桿菌懸濁液。
[0065] 4、將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌菌液涂布于含有氨節(jié)青霉素的LB固體培養(yǎng)基表面，然后 置35°C溫箱中過(guò)夜培養(yǎng)。此時(shí)，因細(xì)菌的感受態(tài)性能較差，只有部分細(xì)菌在經(jīng)過(guò)制備后能夠 成為感受態(tài)細(xì)菌并在隨后的熱擊轉(zhuǎn)化中獲得馴化質(zhì)粒。而且，只有獲得了馴化質(zhì)粒的細(xì)菌 才能在含有氨節(jié)青霉素的LB固體培養(yǎng)基表面存活、生長(zhǎng)，經(jīng)35°C過(guò)夜培養(yǎng)后形成菌斑。未 能成為感受態(tài)細(xì)菌，無(wú)法獲得馴化質(zhì)粒的細(xì)菌則被培養(yǎng)基中的氨芐青霉素殺滅。
[0066] 5、用細(xì)菌接種環(huán)收集由步驟4中獲得的菌斑，將其接種于10mL的LB液體培養(yǎng)基 后于44°C振搖過(guò)夜培養(yǎng)。此時(shí)，接種于液體培養(yǎng)基中的全部細(xì)菌中都攜有馴化質(zhì)粒。馴化 質(zhì)粒在大腸桿菌的最適生長(zhǎng)溫度37°C下可以很穩(wěn)定地隨細(xì)菌一起分裂增殖。但在44°C下 其穩(wěn)定性會(huì)有所下降，導(dǎo)致個(gè)別細(xì)菌將馴化質(zhì)粒丟失。
[0067] 6、將100uL從步驟5中獲得的菌液涂布于含有5%蔗糖的LB固體培養(yǎng)基表面，然 后置36°C溫箱中過(guò)夜培養(yǎng)。此時(shí)，絕大部分細(xì)菌中仍攜帶有馴化質(zhì)粒，這些細(xì)菌對(duì)蔗糖敏 感，無(wú)法在含有蔗糖的固體培養(yǎng)基表面存活生長(zhǎng)，只有極少數(shù)將馴化質(zhì)粒丟失的細(xì)菌可以 生長(zhǎng)，并在過(guò)夜培養(yǎng)后形成菌斑。
[0068] 7、收集由步驟6中獲得的菌斑，采用氯化鈣法制備由步驟6得到的細(xì)菌的感受態(tài) 細(xì)菌，并形成濃度約為l〇 9CFU/毫升的感受態(tài)細(xì)菌懸濁液。具體操作過(guò)程可以與上述步驟2 相同。
[0069] 8、按步驟3的方法，將0. 98納克馴化質(zhì)粒再次轉(zhuǎn)化入步驟7的大腸桿菌之中。大 幅減少轉(zhuǎn)化時(shí)馴化質(zhì)粒的用量，使得只有感受性相對(duì)較好的細(xì)菌才能夠獲得馴化質(zhì)粒。優(yōu) 選地，0. 98納克馴化質(zhì)粒對(duì)應(yīng)200 μ L感受態(tài)大腸桿菌懸濁液。
[0070] 9、重復(fù)步驟4至步驟6。
[0071] 10、將步驟7、8、4、5、6按順序循環(huán)重復(fù)，直至獲得滿意的轉(zhuǎn)化效率的菌株。從第二 輪馴化起，均是0. 98納克馴化質(zhì)粒對(duì)應(yīng)200 μ L感受態(tài)大腸桿菌懸濁液。在本實(shí)施例中，可 以經(jīng)12輪馴化，也可以經(jīng)16輪馴化。
[0072] 作為本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施例，本發(fā)明提供的高感受態(tài)大腸桿菌菌株的馴化篩選方 法包括以下步驟：
[0073] 1、將sacB基因表達(dá)片段克隆入pucl9質(zhì)粒中，獲得用于馴化大腸桿菌感受態(tài)性能 的馴化質(zhì)粒。其中，pucl9質(zhì)粒本身攜帶有氨芐青霉素抗性基因，即該馴化質(zhì)粒攜帶有氨芐 青霉素抗性基因和來(lái)自于枯草芽孢桿菌的sacB基因。
[0074] 2、采用氯化鈣法制備T0P10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)菌，形成濃度約為109CFU/mL的感 受態(tài)細(xì)菌懸濁液。
[0075] 3、以42°C熱擊的方法將0. 9微克馴化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入上述感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中。優(yōu) 選地，〇. 9微克馴化質(zhì)粒對(duì)應(yīng)200 μ L感受態(tài)大腸桿菌懸濁液。
[0076] 4、將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌菌液涂布于含有氨節(jié)青霉素的LB固體培養(yǎng)基表面，然后 置33°C溫箱中過(guò)夜培養(yǎng)。此時(shí)，因細(xì)菌的感受態(tài)性能較差，只有部分細(xì)菌在經(jīng)過(guò)制備后能夠 成為感受態(tài)細(xì)菌并在隨后的熱擊轉(zhuǎn)化中獲得馴化質(zhì)粒。而且，只有獲得了馴化質(zhì)粒的細(xì)菌 才能在含有氨節(jié)青霉素的LB固體培養(yǎng)基表面存活、生長(zhǎng)，經(jīng)33°C過(guò)夜培養(yǎng)后形成菌斑。未 能成為感受態(tài)細(xì)菌，無(wú)法獲得馴化質(zhì)粒的細(xì)菌則被培養(yǎng)基中的氨芐青霉素殺滅。
[0077] 5、用細(xì)菌接種環(huán)收集由步驟4中獲得的菌斑，將其接種于10mL的LB液體培養(yǎng)基 后于41°C振搖過(guò)夜培養(yǎng)。此時(shí)，接種于液體培養(yǎng)基中的全部細(xì)菌中都攜有馴化質(zhì)粒。馴化 質(zhì)粒在大腸桿菌的最適生長(zhǎng)溫度33°C下可以很穩(wěn)定地隨細(xì)菌一起分裂增殖。但在41°C下 其穩(wěn)定性會(huì)有所下降，導(dǎo)致個(gè)別細(xì)菌將馴化質(zhì)粒丟失。
[0078] 6、將100 μ L從步驟5中獲得的菌液涂布于含有5%蔗糖的LB固體培養(yǎng)基表面，然 后置37°C溫箱中過(guò)夜培養(yǎng)。此時(shí)，絕大部分細(xì)菌中仍攜帶有馴化質(zhì)粒，這些細(xì)菌對(duì)蔗糖敏 感，無(wú)法在含有蔗糖的固體培養(yǎng)基表面存活生長(zhǎng)，只有極少數(shù)將馴化質(zhì)粒丟失的細(xì)菌可以 生長(zhǎng)，并在過(guò)夜培養(yǎng)后形成菌斑。
[0079] 7、收集由步驟6中獲得的菌斑，采用氯化鈣法制備由步驟6得到的細(xì)菌的感受態(tài) 細(xì)菌，并形成濃度約為l〇9CFU/毫升的感受態(tài)細(xì)菌懸濁液。具體操作過(guò)程可以與上述步驟2 相同。
[0080] 8、按步驟3的方法，將1. 1納克馴化質(zhì)粒再次轉(zhuǎn)化入步驟7的大腸桿菌之中。大 幅減少轉(zhuǎn)化時(shí)馴化質(zhì)粒的用量，使得只有感受性相對(duì)較好的細(xì)菌才能夠獲得馴化質(zhì)粒。優(yōu) 選地，1. 1納克馴化質(zhì)粒對(duì)應(yīng)200 μ L感受態(tài)大腸桿菌懸濁液。
[0081] 9、重復(fù)步驟4至步驟6。
[0082] 10、將步驟7、8、4、5、6按順序循環(huán)重復(fù)，直至獲得滿意的轉(zhuǎn)化效率的菌株。從第二 輪馴化起，均是0. 98納克馴化質(zhì)粒對(duì)應(yīng)200 μ L感受態(tài)大腸桿菌懸濁液。在本實(shí)施例中，可 以經(jīng)14輪馴化，也可以經(jīng)15輪馴化。
[0083] 在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施例中，也可以將上述實(shí)施例中的sacB基因替換為其他負(fù) 篩選基因，例如替換外為rpsL(strA)基因，tetA基因，pheS基因，thyA基因，lacy基因和 gata-Ι基因中的一種。
[0084] tetA基因可使細(xì)菌獲得四環(huán)素抗性，同時(shí)對(duì)鎳離子、鉻離子和高滲透壓敏感。rpsL 基因會(huì)使細(xì)菌對(duì)鏈霉素敏感。pheS基因可導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)對(duì)氯苯丙氨酸敏感。thyA基因?qū)е录?xì) 菌對(duì)甲氧芐氨嘧啶敏感。lacY基因?qū)е录?xì)菌對(duì)t-o-硝基苯基-B-D-半乳糖苷敏感。但野 生型大腸桿菌和多數(shù)工具菌株（包括本發(fā)明中提到的3種菌株）已攜有rpsL，pheS，thyA， lacY基因（即已經(jīng)對(duì)相應(yīng)殺菌物質(zhì)敏感），所以它們只對(duì)將相應(yīng)基因敲除的特殊菌株（可 耐受相應(yīng)殺菌物質(zhì)）才可用作負(fù)篩選基因。
[0085] gata-Ι基因本身編碼一個(gè)細(xì)菌毒性蛋白，需要在其前面加一個(gè)平時(shí)關(guān)閉，而可被 某種特定物質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子（比如lac啟動(dòng)子）加以控制。此時(shí)，相應(yīng)的誘導(dǎo)劑（對(duì) lac啟動(dòng)子來(lái)說(shuō)是IPTG)就成為'殺菌物質(zhì)'。與此原理相同的還有mazF基因。本發(fā)明中 控制sacB基因表達(dá)的是其自身的啟動(dòng)子，無(wú)條件地持續(xù)表達(dá)。但在沒有蔗糖存在時(shí)不會(huì)對(duì) 細(xì)菌造成傷害。
[0086] 大腸桿菌感受態(tài)馴化效果對(duì)比實(shí)驗(yàn)
[0087] 實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
[0088] 1、經(jīng)不同輪次馴化菌株的與（未經(jīng)馴化的）初始菌株（parental strain)大腸桿 菌菌株分別制備各自的感受態(tài)大腸桿菌。
[0089] 2、42°C熱擊的方法將1納克質(zhì)粒DNA(卡那霉素抗性）分別轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿 菌細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)菌各涂布三個(gè)平皿。以三個(gè)平皿中菌落計(jì)數(shù)的平均值計(jì)算 轉(zhuǎn)化效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
[0090]

【權(quán)利要求】
1. 一種高感受態(tài)大腸桿菌菌株的馴化篩選方法，其特征在于，包括： 將攜帶有耐藥基因和負(fù)篩選基因的馴化質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中； 利用耐藥基因分離出感受性相對(duì)較高的大腸桿菌，然后使個(gè)別的所述感受性相對(duì)較高 的大腸桿菌將馴化質(zhì)粒丟失，再利用負(fù)篩選基因分離出將馴化質(zhì)粒丟失的大腸桿菌； 使用所述馴化質(zhì)粒循環(huán)往復(fù)地對(duì)所述將馴化質(zhì)粒丟失的大腸桿菌進(jìn)行多輪篩選，從而 制備得到高感受態(tài)的大腸桿菌菌株。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高感受態(tài)大腸桿菌菌株的馴化篩選方法，其特征在于，所述 馴化篩選方法包括： 1) 將攜帶有耐藥基因和負(fù)篩選基因的馴化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中； 2) 將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含有與所述馴化質(zhì)粒所攜帶的耐藥基因相應(yīng)的抗生素的LB 固體培養(yǎng)基表面，然后置于溫箱中過(guò)夜培養(yǎng)，形成菌斑； 3) 收集步驟2)中獲得的菌斑，將其接種于LB液體培養(yǎng)基后過(guò)夜培養(yǎng)，使個(gè)別大腸桿菌 將馴化質(zhì)粒丟失； 4) 將步驟3)中獲得的菌液涂布于含有與所述負(fù)篩選基因相應(yīng)的殺菌物質(zhì)的LB固體培 養(yǎng)基表面，然后置于溫箱中過(guò)夜培養(yǎng)，形成菌斑； 5) 收集步驟4)中獲得的菌斑，制備感受態(tài)大腸桿菌； 6) 將所述攜帶有耐藥基因和負(fù)篩選基因的馴化質(zhì)粒再次轉(zhuǎn)入步驟5)的感受態(tài)大腸桿 菌細(xì)胞中，依次重復(fù)步驟2)?步驟4); 7) 將步驟5)和6)按順序循環(huán)，直至得到高感受態(tài)的大腸桿菌菌株。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的高感受態(tài)大腸桿菌菌株的馴化篩選方法，其特征在于，所述 步驟1)中馴化質(zhì)粒的用量為所述步驟6)中馴化質(zhì)粒的用量的500?2000倍。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的高感受態(tài)大腸桿菌菌株的馴化篩選方法，其特征在于，所述 步驟2)和步驟4)中的培養(yǎng)溫度為30?37°C。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的高感受態(tài)大腸桿菌菌株的馴化篩選方法，其特征在于，所述 步驟2)中的培養(yǎng)溫度為40?45°C。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的高感受態(tài)大腸桿菌菌株的馴化篩選方法，其特征在于，所述 馴化過(guò)程的循環(huán)輪數(shù)為12?16輪。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高感受態(tài)大腸桿菌菌株的馴化篩選方法，其特征在于，所述 大腸桿菌菌株選自DH5alpha，T0P10和BL21中的一種。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高感受態(tài)大腸桿菌菌株的馴化篩選方法，其特征在于，所述 馴化質(zhì)粒的骨架選自pET28, pucl8和pucl9中的一種。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高感受態(tài)大腸桿菌菌株的馴化篩選方法，其特征在于，所述 耐藥基因選自卡那霉素基因，氨芐青霉素基因，氯霉素基因和紅霉素基因中的一種。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高感受態(tài)大腸桿菌菌株的馴化篩選方法，其特征在于，所述 負(fù)篩選基因選自sacB基因，rpsL(strA)基因，tetA基因，pheS基因，thyA基因，lacy基因， gata-Ι基因和mazF基因中的一種。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK104195159SQ201410380004
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年8月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月4日
【發(fā)明者】任軍, 高芳芳 申請(qǐng)人:北京康為世紀(jì)生物科技有限公司