一個與大豆抗銹病基因位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一個與大豆抗銹病基因位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記及應(yīng)用。本發(fā)明提供的鑒定或輔助鑒定大豆抗銹病的方法，包括如下步驟：分別以待鑒定大豆和SX6907的基因組DNA為模板，用由序列表中序列1和序列表中序列2所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，按照標(biāo)準(zhǔn)確定所述待鑒定大豆的抗病性，本發(fā)明利用高抗銹病大豆SX6907材料與2個非抗銹病大豆材料雜交，構(gòu)建遺傳群體，定位抗銹病基因，開發(fā)緊密連鎖的分子標(biāo)記，并進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，可提高選擇效率，加快育種進(jìn)程。
【專利說明】一個與大豆抗銹病基因位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于大豆分子生物學(xué)及遺傳育種【技術(shù)領(lǐng)域】。更具體涉及一個與大豆抗銹病基因位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記及應(yīng)用，同時還涉及該分子標(biāo)記在大豆抗銹病育種中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]大豆起源于中國，在美國、巴西、阿根廷、中國和印度等國家廣為種植。大豆種子中約含40%的蛋白質(zhì)和20%的油分，是具有重要經(jīng)濟(jì)價值的油料作物，也是植物蛋白質(zhì)的主要來源。近年來我國大豆種植面積和產(chǎn)量有所下降，其中大豆銹病是影響大豆產(chǎn)量的因素之一，主要影響我國中部和南方產(chǎn)區(qū)，造成的產(chǎn)量損失可達(dá)10%-90%不等。世界大豆平均單產(chǎn)沒有提高，主要是南美大豆單產(chǎn)提高速度由快速而停滯，其原因也主要是大豆生產(chǎn)受到大豆銹病的影響，每年對巴西、阿根廷大豆生產(chǎn)造成了至少300萬噸以上的損失。目前，這種病害還有向北美蔓延的趨勢，己引起各大豆主產(chǎn)區(qū)的重視。
[0003]大豆銹病是一種氣傳病害、一種多循環(huán)病害,是大豆上最具破壞性的病害之一。大豆銹病是由豆薯層銹菌引起的真菌性病害，具有破壞性強(qiáng)、循環(huán)式侵染、專性寄生等特點(diǎn)。它的寄主主要是豆類作物，還有野葛、栽培葛等，在南方主要的越冬寄主是野葛，野葛冬天不落葉，一年四季都能被銹菌侵染，冬季最嚴(yán)重，銹菌可寄生在上面成為第2年的初侵染來源。高溫高濕氣候條件將加快致病真菌的繁殖速度，導(dǎo)致銹病蔓延，如不進(jìn)行有效控制，可造成大豆40%的減產(chǎn)損失。盡管銹病可以采取措施控制，但成本很高。根據(jù)巴西農(nóng)牧研究院大豆研究所的數(shù)據(jù)，除了減產(chǎn)損失外，在2009/2010年期間，每個生產(chǎn)季節(jié)用于銹病防治的成本高達(dá)20億美元。
[0004]中國農(nóng)業(yè)科學(xué)油料作物研究所大豆研究室采用離體葉片接種方法對1000余份大豆種質(zhì)資源進(jìn)行抗性篩選，獲得1份高抗銹病材料SX6907 (單志慧等，一個大豆銹病新抗源的篩選與鑒定，中國油料作物學(xué)報，2012，34:188-192)，該材料在接種銹菌后20天不產(chǎn)生侵染病斑，在接種高濃度銹菌時，產(chǎn)生少數(shù)紅褐色病斑，但無孢子堆破裂現(xiàn)象，無孢子產(chǎn)生。組織學(xué)觀察表明，SX6907在接種部位造成細(xì)胞壞死，侵染點(diǎn)無孢子形成，其抗性表現(xiàn)為抗銹菌擴(kuò)展。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明一個目的是提供鑒定或輔助鑒定大豆抗銹病的方法及其在育種中的運(yùn)用。
[0006]本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定大豆抗銹病的方法，包括如下步驟:分別以待鑒定大?和SX6907的基因組DNA為I旲板，用由序列表中序列I和序列表中序列2所不的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，按照如下方法確定所述待鑒定大豆的抗病性:
[0007]如果待鑒定大豆的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶有與SX6907帶型相同的條帶，則待鑒定大豆為抗銹病大豆或候選為抗銹病大豆，如果待鑒定大豆的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶沒有與SX6907帶型相同的條帶，則待鑒定大豆為非抗銹病大豆為或?yàn)楹蜻x非抗銹病大豆；所述待鑒定大豆為天隆一號和SX6907的雜交后代，上述方法中，所述待鑒定大豆具體選自天隆一號XSX6907的雜種后代中的&單株。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，所述待鑒定大豆具體選自天隆一號XSX6907的F2單株。
[0008]上述方法中，所述電泳為聚丙烯酰胺凝膠電泳，在所述聚丙烯酰胺凝膠電泳中，所述聚丙烯酰胺凝膠的濃度6%。
[0009]上述方法中，所述PCR擴(kuò)增中先進(jìn)行10個第一個循環(huán)后再進(jìn)行25個第二個循環(huán)，所述第一個循環(huán)的引物退火條件為55°C 30s，所述第二個循環(huán)的引物退火條件為53°C 30s。
[0010]其中，所述第一個循環(huán)的溫度程序是:先94°C 30s，然后55°C 30s，最后72°C Imin ；所述第二個循環(huán)的溫度程序是:先94°C 30s，然后53°C 30s，最后72°C lmin。
[0011]上述方法中，所述抗銹病(R)大豆是指接種后2周僅在接種部位有少量紅褐色病斑，病斑周圍組織不發(fā)生黃化，無黃褐色病斑；若無孢子堆形成為高抗，若有孢子堆形成，并有少量孢子釋放為中抗銹病(M);非抗銹病(S)大豆是指接種后3-5天出現(xiàn)侵染病斑，為典型黃褐色病斑，5-7天后侵染點(diǎn)周圍變黃，侵染點(diǎn)逐步變大，葉片上相鄰的黃色部分連成片，10天后，侵染點(diǎn)病斑破裂，有大量孢子釋放。
[0012]上述方法可用于大豆育種、大豆抗銹病的早期預(yù)測或篩選抗銹病大豆。
[0013]在大豆育種中，可利用上述方法鑒定出抗銹病大豆進(jìn)行育種。
[0014]本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供鑒定或輔助鑒定大豆抗銹病的引物對。
[0015]本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定大豆抗銹病的引物對，名稱為GmSSR18_22，由序列表中序列I和序列表中序列2所示的兩條單鏈DNA組成。
[0016]其中，序列表中序列I由20個脫氧核苷酸組成，序列表中序列2由20個脫氧核苷酸組成。
[0017]含有上述引物對GmSSR18_22的鑒定或輔助鑒定大豆抗銹病的試劑或試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0018]上述引物對GmSSR18-22、含有上述引物對GmSSR18-22的試劑或試劑盒的下述a)、
b)或c)用途也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍:
[0019]a)在大豆育種中的應(yīng)用；
[0020]b)在大豆抗銹病的早期預(yù)測中的應(yīng)用；
[0021]c)在篩選抗銹病大豆中的應(yīng)用。
[0022]本發(fā)明中所定位的大豆抗銹病基因位點(diǎn)是rpp.18-1，該基因位點(diǎn)對大豆抗銹病起著關(guān)鍵作用，可用作圖位克隆和分子標(biāo)記輔助選擇。
[0023]本發(fā)明的引物對GmSSR18_22，是與基因位點(diǎn)rpp.18-1緊密連鎖的標(biāo)記，是基于PCR技術(shù)的共顯性SSR標(biāo)記，因而可靠且使用方便。
[0024]實(shí)驗(yàn)證明，利用引物對GmSSR18-22對大豆育種材料輔助鑒定的結(jié)果與抗病鑒定結(jié)果完全一致，這表明引物對GmSSR18-22用于大豆抗銹病育種的分子標(biāo)記輔助選擇是切實(shí)有效的。
[0025]本發(fā)明通過對大豆抗銹病基因的定位，并開發(fā)與其緊密連鎖的分子標(biāo)記GmSSR18-22，該抗銹病基因位點(diǎn)rpp.18_1可用于圖位克隆和分子標(biāo)記輔助選擇。在常規(guī)育種方法中，大豆的對銹病的抗性鑒定比較繁瑣，對鑒定技術(shù)要求比較高，選擇效率低下。通過檢測抗銹病基因位點(diǎn)來預(yù)測大豆對銹病的抗性，可以在苗期進(jìn)行淘汰，不僅節(jié)約生產(chǎn)成本而且大大提高選擇效率，從而加快育種進(jìn)程。本發(fā)明中抗銹病基因位點(diǎn)位置明確，基因位點(diǎn)的檢測方法方便快速，不受環(huán)境影響。通過檢測與抗銹病基因位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記，即可確定大豆對銹病的抗性，進(jìn)而準(zhǔn)確快速篩選高抗銹病的材料。
[0026]本發(fā)明利用高抗銹病大豆SX6907材料與2個非抗銹病大豆材料雜交，構(gòu)建遺傳群體，定位抗銹病基因，開發(fā)緊密連鎖的分子標(biāo)記，并進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，可提高選擇效率，加快育種進(jìn)程。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為利用GmSSR18-22對1_30的F2代單株、母本和父本的基因組DNA進(jìn)行PCR得到的PCR產(chǎn)物的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖
[0028]其中 ，1-30為材料編號，Pl和P2分別代表母本天隆一號和父本SX6907
[0029]圖2為大豆抗銹病LOD值分布曲線
[0030]其中，橫坐標(biāo)代表連鎖群，縱坐標(biāo)代表LOD值

【具體實(shí)施方式】
[0031 ] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0032]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0033]大豆天隆一號(陳李淼等，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化大豆子葉節(jié)的影響因素研究，大豆科學(xué)，2012，I:17-23)和SX6907 (單志慧等，一個大豆銹病新抗源的篩選與鑒定，中國油料作物學(xué)報，2012，34 =188-192)公眾可從商業(yè)途徑獲得，也可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所獲得，以重復(fù)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)。
[0034]在以下的實(shí)施方案中，除非特別說明，否則所有操作均按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)(黃培堂等譯，北京:科學(xué)出版社，2002)所提供的方法進(jìn)行。
[0035]實(shí)施例1、利用引物對GmSSR18-22鑒定天隆一號XSX6907的F2單株對銹病的抗性
[0036]一、鑒定或輔助鑒定大豆抗銹病的PCR試劑
[0037]本實(shí)施例的鑒定或輔助鑒定大豆抗銹病的PCR試劑由PCR引物對GmSSR18_22、1XTaq緩沖液，dNTP混合物，MgCl2溶液、Taq DNA聚合酶和ddH20組成。
[0038]其中，PCR引物對GmSSR18_22由正向引物和反向引物這兩條單鏈DNA組成，其序列如下:
[0039]正向引物:5’-ACCAAACCCGATGATGATGT-3’ (序列表中序列 I)，
[0040]反向引物:5’-CCAGATTCCAAACCCCTTCT-3’ (序列表中序列 2)。
[0041]二、待鑒定大豆
[0042]天隆一號XSX6907的F2分離群體是按照如下方法獲得:天隆一號和SX6907雜交，雜交后代自交，即為F2分離群體。
[0043]三、田間實(shí)驗(yàn)和利用引物對GmSSR18_22鑒定待鑒定大豆對銹病的抗性
[0044]天隆一號XSX6907的雜種后代中的F2單株種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所試驗(yàn)農(nóng)場。
[0045]在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，待鑒定大豆具體選自天隆一號XSX6907的F2單株。
[0046]上述方法中，抗銹病(R)大豆是指接種后2周僅在接種部位有少量紅褐色病斑，病斑周圍組織不發(fā)生黃化，無黃褐色病斑；若無孢子堆形成為高抗，若有孢子堆形成，并有少量孢子釋放為中抗銹病(M);非抗銹病(S)大豆是指接種后3-5天出現(xiàn)侵染病斑，為典型黃褐色病斑，5-7天后侵染點(diǎn)周圍變黃，侵染點(diǎn)逐步變大，葉片上相鄰的黃色部分連成片，10天后，侵染點(diǎn)病斑破裂，有大量孢子釋放。
[0047]( 二)利用引物對GmSSR18_22鑒定大豆的對銹病的抗性
[0048]在步驟(一)編號為1-30的家系的F2單株、母本天隆一號(Pl)和父本SX6907(P2)的3葉期分別采集大豆葉片提取其基因組DNA，利用引物對GmSSR18-22進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行60g/L變性聚丙烯酰胺凝膠(交聯(lián)度為5%)電泳，檢測電泳條帶大小。
[0049]具體的實(shí)驗(yàn)方法如下:
[0050]1、用 CTAB 法(Keim P.A rapid protocol for isolating soybean DNA.Soybeangenet newslett, 1988, 15:147-148)提取葉片基因組 DNA
[0051](I)取0.5g新鮮葉片放入1.5ml離心管中，用玻璃棒磨為勻漿，加入700 μ I經(jīng)65°C預(yù)熱30min的CTAB溶液和20 μ I β -巰基乙醇搖勻，放入65°C的水浴鍋中水浴30min。
[0052](2)取出離心管，加入700 μ I氯仿-異戊醇(24:1/ν:ν)輕搖幾次，靜置30min后12000rpm,離心 lOmin。
[0053](3)吸取上清液，加入2倍體積的冰凍無水乙醇，置于_20°C冰箱30min。12000rpm離心10分鐘讓DNA沉淀，倒掉離心管中乙醇溶液。
[0054](4)用75% (V/V)乙醇清洗2_3次，倒乙醇溶液，打開離心管蓋置于通風(fēng)櫥內(nèi)吹干。
[0055](5)加入200 μ I雙蒸水溶解DNA，用紫外分光光度計(jì)測定DNA的濃度，并稀釋成25ng/l.! 1，于-20°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> [0056]2、分別以步驟I提取的天隆一號和SX6907的F2單株1_30及親本的基因組DNA為模板，利用引物對GmSSR18-22進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如表1:
[0057]表1.
[0058]

【權(quán)利要求】
1.鑒定或輔助鑒定大豆銹病抗性的方法，包括如下步驟:分別以待鑒定大豆、SX6907的基因組DNA為|旲板，用由序列表中序列I和序列表中序列2所不的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，按照如下方法確定所述待鑒定大豆對銹病的抗性: 如果待鑒定大豆的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶有與SX6907帶型相同的條帶，則待鑒定大豆為抗銹病大豆或候選為抗銹病大豆，如果待鑒定大豆的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶沒有與SX6907帶型相同的條帶，則待鑒定大豆為非抗銹病大豆或候選為非抗銹病大豆；所述待鑒定大豆為天隆一號和SX6907的雜交后代。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述電泳為聚丙烯酰胺凝膠電泳。
3.權(quán)利要求1或2所述方法的用途，所述用途為I)、2)或3): 1)權(quán)利要求1或2所述方法在大豆育種中的應(yīng)用； 2)權(quán)利要求1或2所述方法在大豆抗銹病早期預(yù)測中的應(yīng)用； 3)權(quán)利要求1或2所述方法在篩選抗銹病大豆中的應(yīng)用。
4.鑒定或輔助鑒定大豆抗銹病的引物對，由序列表中序列I和序列表中序列2所示的兩條單鏈DNA組成。
5.含有權(quán)利要求4所述的引物對的鑒定或輔助鑒定大豆抗銹病的試劑或試劑盒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑，其特征在于:所述引物對中的各條引物在所述試劑中的終濃度為2.5ng/l.! I。
7.權(quán)利要求4所述的引物對、權(quán)利要求5所述的試劑或試劑盒的用途，所述用途為a)、b)或 c): a)權(quán)利要求4所述的引物對、權(quán)利要求5所述的試劑或試劑盒在大豆育種中的應(yīng)用； b)權(quán)利要求4所述的引物對、權(quán)利要求5所述的試劑或試劑盒在大豆抗銹病早期預(yù)測中的應(yīng)用； c)權(quán)利要求4所述的引物對、權(quán)利要求5所述的試劑或試劑盒在篩選抗銹病大豆中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104164502SQ201410379762
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年8月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月4日
【發(fā)明者】單志慧, 陳海峰, 楊中路, 沙愛華, 邱德珍, 張嬋娟, 陳李淼, 袁松麗, 張曉娟, 趙勝, 陳水蓮, 萬喬, 周新安 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所