抗菌肽共表達(dá)載體及其構(gòu)建和表達(dá)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了抗菌肽共表達(dá)載體及其構(gòu)建和表達(dá)方法，所述抗菌肽為四種，四種抗菌肽的編碼基因分別兩兩連接到在同一宿主菌中同時(shí)表達(dá)的雙表達(dá)載體pETDuet-1、pRSFDuet-1。本發(fā)明的抗菌肽共表達(dá)載體可以同時(shí)高效穩(wěn)定的表達(dá)四種抗菌肽，從而具有高效廣譜抗菌和抗病毒活性，表達(dá)的抗菌肽蛋白結(jié)構(gòu)和天然抗菌肽保持一致，解決了融合表達(dá)時(shí)改變蛋白結(jié)構(gòu)而影響抗菌肽活性及產(chǎn)量的問(wèn)題。
【專(zhuān)利說(shuō)明】抗菌肽共表達(dá)載體及其構(gòu)建和表達(dá)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及能夠同時(shí)表達(dá)多種抗菌肽的共表達(dá)載體，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]由于抗生素與化學(xué)合成藥物在畜牧生產(chǎn)中多年濫用，很多病原菌都出現(xiàn)了耐藥性，藥物殘留等問(wèn)題，因此研究人員開(kāi)始利用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)研發(fā)綠色、高效、有利于生物體健康、有利于環(huán)境保護(hù)以及提高養(yǎng)殖效益的、能夠代替抗生素的新型生物治療制劑。
[0003]在目前已有的生物制劑中，抗菌肽是一種廣泛存在于自然界生物有機(jī)體內(nèi)的小分子活性物質(zhì)，通常由15-45個(gè)氨基酸殘基組成，可經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生，作用于微生物細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜穿孔，破壞細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)外溢而達(dá)到殺菌的目的，具有高效、廣譜及不產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢(shì)。迄今為止，人們已經(jīng)從細(xì)菌、真菌、植物、動(dòng)物中分離出了多種抗菌肽，由于不易產(chǎn)生耐藥性，抗菌肽具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0004]LEAP-2(II型肝表達(dá)抗菌肽)是近年來(lái)在脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的一種新型抗菌肽，具有較強(qiáng)的抗微生物活性。LEAP-2基因包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，只有I個(gè)拷貝。通過(guò)放射性雜交圖發(fā)現(xiàn)LEAP-2基因位于5號(hào)染色體的長(zhǎng)臂3區(qū)I帶，編碼由77個(gè)氨基酸殘基組成的前體蛋白質(zhì)，多分布于肝臟。LEAP-2對(duì)多種細(xì)菌尤其是革蘭氏陽(yáng)性菌有很好的抑制和殺滅效果，具有很好的開(kāi)發(fā)前景。
[0005]TAP (牛氣管抗菌肽)是從牛的氣管黏膜上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，也是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的動(dòng)物β -防御素，由38個(gè)氨基酸殘基組成，含3對(duì)分子內(nèi)二硫鍵，相對(duì)分子質(zhì)量為4.3KD。牛β -防御素TAP對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、克雷伯肺炎桿菌、綠膿桿菌和念珠菌屬等乳房炎病原菌有較強(qiáng)的抗菌活性。大量研究還表明，動(dòng)物防御素在免疫調(diào)節(jié)、激素調(diào)節(jié)及刺激傷口愈合等方面也有重要作用。
[0006]綿羊體內(nèi)有兩種動(dòng)物β -防御素，SBD-1和SBD-2。SBD-1存在于氣管和整個(gè)消化道(從舌到結(jié)腸)中，含有6個(gè)保守的半胱氨酸殘基，這6個(gè)半胱氨酸殘基形成二硫鍵，有利于防御素保持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，而且還是其抗微生物活性及細(xì)胞毒效應(yīng)的主要結(jié)構(gòu)。
[0007]溶菌酶(Lysozyme)又稱(chēng)胞壁質(zhì)酶(Muramidase),是水解酶的一種,是一種無(wú)毒、無(wú)害的高鹽基水解酶，廣泛分布于動(dòng)物、植物以及微生物中。溶菌酶通過(guò)裂解革蘭氏陽(yáng)性菌與革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的多糖成分而將其破壞，從而具有殺滅多種病菌的作用。此外，溶菌酶的抗菌活性還表現(xiàn)在其他方面，例如，溶菌酶可以直接結(jié)合帶有負(fù)電荷的病毒蛋白，與脫輔基蛋白、DNA以及RNA等形成復(fù)鹽，從而使病毒失去活性。因此，溶菌酶以其獨(dú)特的作用機(jī)理，為其在各個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮其抗菌、抗病毒等活性奠定了基礎(chǔ)。
[0008]傳統(tǒng)的制備抗菌肽的方法是組織器官提取法，如有機(jī)溶劑提取法、水浸提法和有機(jī)酸提取法等。這類(lèi)方法存在著許多問(wèn)題，如含量低導(dǎo)致提取效率低，雜質(zhì)種類(lèi)復(fù)雜導(dǎo)致純度不理想，易失活導(dǎo)致提取后的活性不理想，嚴(yán)重制約了抗菌肽的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。，
[0009]針對(duì)上述問(wèn)題，近年來(lái)本領(lǐng)域嘗試?yán)没蚬こ躺a(chǎn)抗菌肽，迄今為止，抗菌肽已在原核表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)得到了表達(dá)。但是在表達(dá)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，表達(dá)的抗菌肽對(duì)宿主細(xì)胞有毒性，而且對(duì)宿主本身的蛋白酶非常敏感導(dǎo)致降解，降低了抗菌肽的表達(dá)量。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明公開(kāi)了一種共表達(dá)載體，能夠在同一宿主菌中同時(shí)穩(wěn)定、高效表達(dá)多達(dá)四種抗菌肽，共表達(dá)多肽具有高效廣譜抗菌和抗病毒活性，蛋白結(jié)構(gòu)和天然抗菌肽保持一致，解決了融合表達(dá)時(shí)改變蛋白結(jié)構(gòu)而影響抗菌肽活性及產(chǎn)量的問(wèn)題。
[0011]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0012]抗菌肽共表達(dá)載體，所述抗菌肽為四種，四種抗菌肽的編碼基因分別兩兩連接到在同一宿主菌中同時(shí)表達(dá)的雙表達(dá)載體pETDuet-1、pRSFDuet-1。
[0013]本發(fā)明并不限定具體的抗菌肽類(lèi)型，基于本發(fā)明所公開(kāi)的構(gòu)建方法，目前已有的具有良好生物活性的抗菌肽均可通過(guò)選擇設(shè)計(jì)具有針對(duì)性的特異性引物將其連接到上述雙表達(dá)載體中。
[0014]優(yōu)選的，所述抗菌肽為L(zhǎng)EAP-2、TAP、SBD-1、Lysozyme，所述抗菌肽的編碼基因與雙表達(dá)載體的連接關(guān)系為pETDuet-1-L2-T和pRSFDuet-1-Sl-Ly。
[0015]本發(fā)明所用的載體pETDuet-1、pRSFDuet-1是雙表達(dá)載體，每一個(gè)載體上有兩個(gè)啟動(dòng)子，屬于單一載體雙啟動(dòng)子系統(tǒng)，每個(gè)編碼基因都有獨(dú)立的一個(gè)啟動(dòng)子，每個(gè)啟動(dòng)子獨(dú)立驅(qū)動(dòng)各個(gè)蛋白的表達(dá)。
[0016]與傳統(tǒng)的構(gòu)建融合基因相比，本發(fā)明的雙表達(dá)載體避免了基因之間的相互影響，保證了抗菌肽的穩(wěn)定表達(dá)，克服了串聯(lián)表達(dá)表達(dá)量不足的缺點(diǎn)，并且通過(guò)在同一宿主菌中表達(dá)的雙質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)，pETDuet-Ι和pRSFDuet-Ι作為復(fù)制子相同不相容的兩個(gè)質(zhì)粒，在Amp和Kana兩種抗生素存在的壓力下子代菌能夠有效存活，不會(huì)被抗生素殺死，從而可以同時(shí)轉(zhuǎn)化進(jìn)入同一宿主菌后有效的表達(dá)外源抗菌肽蛋白。
[0017]為了便于規(guī)?；a(chǎn)，降低培養(yǎng)難度，本發(fā)明所用的宿主菌為大腸桿菌，其培養(yǎng)簡(jiǎn)單，遺傳背景清楚，可以采用發(fā)酵罐實(shí)現(xiàn)大規(guī)模、高密度發(fā)酵生產(chǎn)。
[0018]常規(guī)的生物工程中所用的大腸桿菌均可用于本發(fā)明，包括但不限于大腸桿菌BL21，BL21 (DE3)，和 BL21 (DE3) PLySs 等。
[0019]相應(yīng)的，本發(fā)明公開(kāi)了上述抗菌肽共表達(dá)載體的構(gòu)建方法，針對(duì)具體的抗菌肽，利用引物擴(kuò)增抗菌肽的編碼基因，通過(guò)酶切、連接、轉(zhuǎn)化將四種抗菌肽的編碼基因分別兩兩插入雙表達(dá)載體 pETDuet-1、pRSFDuet-1。
[0020]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該了解，針對(duì)不同的抗菌肽編碼基因，根據(jù)抗菌肽編碼基因以及共表達(dá)pETDuet-Ι和pRSFDuet-Ι的多克隆位點(diǎn)，即可利用引物合成軟件Primer設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出各個(gè)抗菌肽基因，因此本發(fā)明的構(gòu)建方法可以普遍適用于多種抗菌肽共表達(dá)載體的構(gòu)建。
[0021]具體的，針對(duì)本發(fā)明所公開(kāi)的四種優(yōu)選抗菌肽，構(gòu)建方法包括下述步驟:
[0022]I)以抗菌肽LEAP-2、TAP、SBD-U Lysozyme編碼基因作為PCR模版擴(kuò)增出抗菌肽基因;
[0023]2)使用 EcoR1、NotI 分別雙酶切載體 pETDuet-1、pRSFDuet-1 ；
[0024] 3)利用EcoR1、NotI分別雙酶切LEAP_2、SBD_1抗菌肽的編碼基因，將其與雙酶切后的pETDuet-1、pRSFDuet-1載體連接得到表達(dá)載體；
[0025]4)利用BglI1、XhoI雙酶切步驟3)得到的表達(dá)載體，使用BglI1、XhoI雙酶切TAP、Lysozyme抗菌肽的編碼基因，分別與雙酶切后的表達(dá)載體連接得到共表達(dá)載體。
[0026]通過(guò)上述構(gòu)建方法，實(shí)現(xiàn)了將攜帶四個(gè)抗菌肽基因的兩個(gè)共表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入同一個(gè)宿主菌，能夠穩(wěn)定、高效表達(dá)LEAP-2、TAP、SBD-ULysozyme四種抗菌肽蛋白。
[0027]其中，步驟I)的編碼基因即可從相關(guān)的生物制品公司和實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買(mǎi)成品或者合成，針對(duì)上述四種具體的抗菌肽，采用PCR擴(kuò)增所用對(duì)應(yīng)的引物序列如下:
[0028]LEAP-2-F:CCGGAATTCATGACTCCATTTTGGAG (含 EcoRI 酶切位點(diǎn))
[0029]LEAP-2-R:ATAGCGGCCGCTCATTCCTGGGCCACACT (含 NotI 酶切位點(diǎn))
[0030]TAP-F:CGCAGATCTAATCCTGTAAGCTGTGTTA(含 BglII 酶切位點(diǎn))
[0031 ] TAP-R:CCGCTCGAGACTTCTTTCTACAGCATAAAT (含 XhoI 酶切位點(diǎn))
[0032]SBD-1-F: CCGGAATTCCAAGGAGTAAGAAATCGTCTAAG (含 EcoRI 酶切位點(diǎn))
[0033]SBD-1-R:ATAGCGGCCGCCTTCTTTCTGCAGCATTTTACT (含 NotI 酶切位點(diǎn))
[0034]Lysozyme-F:CGCAGATCTAGGTCTTTGCTAATCTTGGTG(含 BglII 酶切位點(diǎn))
[0035]Lysozyme-R:CCGC TCGAGCAGCCGGCAGCCTCTGATCCA (含 XhoI 酶切位點(diǎn))。
[0036]PCR的條件和參數(shù)采用本領(lǐng)域常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件即可。
[0037]相應(yīng)的，本發(fā)明還公開(kāi)了上述共表達(dá)抗菌肽的表達(dá)方法，通過(guò)將共表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到同一宿主菌進(jìn)行涂板，過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌落接種于LB培養(yǎng)基中，搖菌過(guò)夜，轉(zhuǎn)接至新LB培養(yǎng)基中，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)生四種抗菌肽。
[0038]其中，培養(yǎng)最終達(dá)到OD值0.6-0.8，所用IPTG濃度為ImM/L。
[0039]其中，所用的菌株采用適合于外源蛋白表達(dá)的菌株，優(yōu)選的是BL21(DE3)、BL21(DE3) PLySs 等。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0040]圖1為四種抗菌肽的編碼基因擴(kuò)增電泳圖，其中M為1K Maker，A為T(mén)AP抗菌肽的441bp編碼基因、B為L(zhǎng)ysozyme抗菌肽編碼基因441bp、C為SBD-1抗菌肽編碼基因174bp、D為L(zhǎng)EAP-2抗菌肽編碼基因168bp ；
[0041]圖2是四種共表達(dá)的抗菌肽的SDS-PAGE圖，M為Maker，I是同時(shí)轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒pETDuet-Ι 和 pRSFDuet-Ι 的 BL21 (DE3)全細(xì)胞裂解物；2 是同時(shí)轉(zhuǎn)入 pETDuet-1-L2_T 和pRSFDuet-1-Sl-Ly共表達(dá)載體未加IPTG誘導(dǎo)的BL21 (DE3)全細(xì)胞裂解物；3是同時(shí)轉(zhuǎn)入pETDuet-1-L2-T 和 pRSFDuet-1-Sl-Ly 共表達(dá)載體加入 BL21 (DE3)中經(jīng) ImM IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)四個(gè)毒素蛋白4小時(shí)后的SDS-PAGE圖。

【具體實(shí)施方式】
[0042]在下述實(shí)施例中， 申請(qǐng)人:提供了一種具體的共表達(dá)載體構(gòu)建和表達(dá)過(guò)程，并且詳細(xì)描述了所用原料的來(lái)源，僅為示意，并非構(gòu)成特別限定。本領(lǐng)域技術(shù)人員采用符合公知定義的相關(guān)原料和實(shí)驗(yàn)條件也可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的。
[0043]在下述實(shí)施中，所用原料來(lái)源如下:
[0044]LEAP-2、TAP、SBD-1> Lysozyme四種抗菌肽的編碼基因來(lái)自于GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，LEAP-2 編號(hào)為 Q95JB4、TAP 編號(hào)為 AF014106.1、SBD-1 編號(hào)為 U75250.1、Lysozyme 編號(hào)為V00428.1。
[0045]pETDuet-1 和 pRSFDuet-1 雙表達(dá)載體購(gòu)自 Novagen 公司。
[0046]表達(dá)菌:BL21(DE3)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。
[0047]所用引物由上海生工生物工程有限公司合成。
[0048]限制性?xún)?nèi)切酶Bglll、EcoR1、Notl、Xhol，T4 DNA 連接酶和 2XPower Taq PCRMasterMix均購(gòu)自大連寶生物有限公司；IPT6、SDS (十二烷基磺酸鈉)、核酸Marker、Agarose DNA extract1n kit、DNA快速純化回收試劑盒、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖芯?gòu)自大連寶生物工程公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司合成；瓊脂糖購(gòu)自Invitrogen公司；預(yù)染蛋白Marker購(gòu)自Fermentas公司。
[0049]實(shí)施例1:抗菌肽共表達(dá)載體的構(gòu)建
[0050]1.LEAP-2、TAP、SBD-ULysozyme 編碼基因的擴(kuò)增
[0051]利用引物，擴(kuò)增抗菌肽LEAP-2、TAP、SBD-U Lysozyme編碼基因，得到各個(gè)抗菌肽基因。
[0052]PCR反應(yīng)體系:50 μ L MasterMix,上下游引物各2 μ L,模版16 μ L,去離子水30 μ L ；DNA膠回收試劑盒回收四個(gè)抗菌肽編碼基因；
[0053]2.pETDuet-1-L2 和 pRSFDuet-1-Sl 載體的構(gòu)建
[0054]將pETDuet-1、pRSFDuet-1 兩個(gè)載體進(jìn)行 EcoR1、NotI 雙酶切。
[0055]40 μ L酶切體系:10XH緩沖液4 μ L，EcoR1、NotI各I μ L，載體24 μ L，去離子水10 μ L0
[0056]酶切產(chǎn)物I %瓊脂糖電泳后膠回收試劑盒回收；
[0057]然后用EcoR1、NotI 雙酶切的 LEAP-2、SBD-1 基因。
[0058]40 μ L酶切體系:10XH緩沖液4 μ L，EcoR1、NotI各I μ L，目的基因24 μ L，去離子水10 μ L0
[0059]酶切產(chǎn)物I %瓊脂糖電泳后膠回收試劑盒回收，然后分別與雙酶切的pETDuet-1、pRSFDuet-1的載體連接,構(gòu)建兩個(gè)連接體系:
[0060]10XT4DNA Ligase Buffer 2.5 μ L, LEAP-2 編碼基因膠回收產(chǎn)物 14 μ L，pETDuet-1 2 μ L, T4DNA Ligasel μ L,去離子水 5.5 μ L ;
[0061]10XT4DNA Ligase Buffer 2.5 μ L, SBD-1 編碼基因膠回收產(chǎn)物 14yL，pRSFDuet-1 2 μ L, T4DNA Ligasel μ L,去離子水 5.5 μ L。
[0062]16°C連接過(guò)夜，分別轉(zhuǎn)化Transl09態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落分別進(jìn)行菌液PCR鑒定、酶切鑒定、菌液測(cè)序確定LEAP-2、SBD-1分別連接到pETDuet-l_L2和pRSFDuet-1-Sl載體上；
[0063]3.pETDuet-1-L2-T 和 pRSFDuet-1-Sl-Ly 載體的構(gòu)建
[0064]pETDuet-1-L2 和 pRSFDuet-1-Sl 進(jìn)行 Bglll、XhoI 雙酶切。
[0065]40yL酶切體系:10XH緩沖液4yL，Bglll、XhoI各I μ L，載體24 μ L，去離子水10 μ L，酶切產(chǎn)物I %瓊脂糖電泳后膠回收試劑盒回收。
[0066]BglII> XhoI 雙酶切的 TAP、Lysozyme 編碼基因。
[0067]40 μ L酶切體系:10XH緩沖液4 μ L，EcoR1、PstI各I μ L，目的基因24 μ L，去離子水10 μ L，酶切產(chǎn)物I %瓊脂糖電泳后膠回收試劑盒回收，然后構(gòu)建兩個(gè)鏈接體系:
[0068]10XT4DNA Ligase Buffer 2.5 μ L，TAP 編碼基因膠回收產(chǎn)物 14 μ L，pETDuet_l_L2 2 μ L, T4DNA Ligasel μ L,去離子水 5.5 μ L ;
[0069]10 X T4DNA Ligase Buffer 2.5 μ L, Lysozyme 編碼基因膠回收產(chǎn)物 14 μ L，pRSFDuet-1-Sl 2 μ L, T4DNA Ligasel μ L,去離子水 5.5 μ L。
[0070]16°C連接過(guò)夜，分別轉(zhuǎn)化Transl09態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落分別進(jìn)行菌液PCR鑒定、酶切鑒定、菌液測(cè)序確定TAP、LyS0Zyme分別連接到pETDuet-1-L2和pRSFDuet-1-Sl載體上。
[0071]實(shí)施例2:LEAP_2、TAP、SBD-ULysozyme四種抗菌肽共表達(dá)載體的共表達(dá)
[0072]pETDuet-1-L2-T 和 pRSFDuet-1-Sl-Ly 各 0.5 μ L 質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)化 BL21 (DE3)宿主菌，挑取單克隆菌落接種于新鮮1ml LB培養(yǎng)基中，搖菌過(guò)夜，按1: 100比例轉(zhuǎn)接新鮮1ml LB培養(yǎng)基中，OD值達(dá)0.6-0.8時(shí)取Iml菌液作為未誘導(dǎo)樣品，然后加入終濃度1.0mM的10 μ L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)四小時(shí)收取Iml菌液樣品；
[0073]在上述共表達(dá)完成后，對(duì)所表達(dá)獲得的LEAP-2、TAP、SBD-ULysozyme四種抗菌肽進(jìn)行了 SDS-PAGE檢測(cè)。
[0074]其中，所配制的SDS-PAGE溶液組成如下:
[0075]Tris-甘氨酸緩沖液:25mmol/L Tris、250mmol/L 甘氨酸(pH 8.0)、0.I % SDS。
[0076]2X SDS 上樣buffer:1 OOmmoI/L Tris.Cl (ρΗ8.0)、200m mol/L巰基乙醇、4% SDS、
0.2%溴酚藍(lán)、20%甘油。
[0077]考馬斯亮藍(lán)染色液:45ml甲醇、45ml水、1ml冰醋酸中溶解0.25g考馬斯亮藍(lán)R250。
[0078]脫色液:30%甲醇、10%冰乙酸，蒸餾水補(bǔ)體積至100ml。
[0079]SDS-PAGE檢測(cè)過(guò)程為:
[0080](I)洗凈玻璃板，固定在電泳槽上，用2.0%瓊脂糖封邊。按分子克隆的配方配制15%的分尚膠5ml,迅速注入兩玻璃板之間,膠頂覆蓋Iml雙蒸水。待分尚膠凝固后傾出覆蓋層液體，用去離子水沖洗凝膠頂部數(shù)次，倒置空干液體，加入2ml 5%的濃縮膠溶液，插上梳子，垂直放置電泳槽使其凝固。
[0081](2)小心移去梳子，在電泳裝置上、下槽間加入Tris-甘氨酸緩沖液，用注射器沖洗加樣孔數(shù)次，將電源負(fù)極與上槽相連。
[0082](3)收集的菌液12000rpm離心2min,用50 μ I ρΗ7.4的PBS懸浮,加入等體積的2X SDS上樣buffer，混勻，水浴煮沸l(wèi)Omin，用微量進(jìn)樣器上樣10 μ 1，打開(kāi)電源，用80V電壓電泳至溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠，把電壓提高到120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部。
[0083](4)染色:取下凝膠用蒸餾水沖洗，用5倍凝膠體積的考馬斯亮藍(lán)染色液浸泡凝膠，放在脫色搖床上室溫染色3h。
[0084](5)脫色:用30%甲醇、10%冰乙酸的混合液，在脫色搖床上脫色過(guò)夜，其間更換染色液3~4次。待藍(lán)色背景完全脫凈后，將凝膠浸入蒸餾水中終止脫色。
[0085]參考附圖2所示，顯示本發(fā)明的共表達(dá)載體成功實(shí)現(xiàn)了四種抗菌肽的共表達(dá)，其中 TAP 5.3kDa、LEAP-2 6.1kDa、SE?-1 6.4kDa> Lysozyme 16kDa。
【權(quán)利要求】
1.抗菌肽共表達(dá)載體，其特征在于所述抗菌肽為四種，四種抗菌肽的編碼基因分別兩兩連接到在同一宿主菌中同時(shí)表達(dá)的雙表達(dá)載體pETDuet-1、pRSFDuet-1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的共表達(dá)載體，其特征在于所述抗菌肽為L(zhǎng)EAP-2、TAP、SBD-ULysozyme0
3.根據(jù)權(quán)利要求2的共表達(dá)載體，其特征在于所述抗菌肽的編碼基因與雙表達(dá)載體的連接關(guān)系為 pETDuet-1-L2-T 和 pRSFDuet-1-Sl-Ly。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的共表達(dá)載體,其特征在于宿主菌為大腸桿菌。
5.權(quán)利要求1的抗菌肽共表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于利用引物擴(kuò)增抗菌肽的編碼基因，通過(guò)酶切、連接、轉(zhuǎn)化將四種抗菌肽的編碼基因分別兩兩插入雙表達(dá)載體pETDuet-1、pRSFDuet-1。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的構(gòu)建方法，其特征在于所述抗菌肽為L(zhǎng)EAP-2、TAP、SBD-1、Lysozyme,與雙表達(dá)載體的連接關(guān)系為 pETDuet_l-L2_T 和 pRSFDuet-1-Sl-Ly。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的構(gòu)建方法，其特征在于包括下述步驟:1)以抗菌肽LEAP-2、TAP、SBD-ULysozyme編碼基因作為PCR模版擴(kuò)增出抗菌肽基因；2)使用EcoR1、NotI分別雙酶切載體pETDuet-1、pRSFDuet-l ；3)利用EcoR1、NotI分別雙酶切LEAP_2、SBD_1抗菌肽的編碼基因，將其與雙酶切后的pETDuet-1、pRSFDuet-l載體連接得到表達(dá)載體；4)利用BglI1、XhoI雙酶切步驟3)得到的表達(dá)載體，使用Bglll、XhoI雙酶切TAP、Lysozyme抗菌肽的編碼基因，分別與雙酶切后的表達(dá)載體連接得到共表達(dá)載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的構(gòu)建方法，其特征在于步驟I)各抗菌肽的特異性引物分別為 LEAP-2-F: CCGGAATTCATGACTCCATTTTGGAG ；
LEAP-2-R:ATAGCGGCCGCTCATTCCTGGGCCACACT ；
TAP-F:CGCAGATCTAATCCTGTAAGCTGTGTTA ；
TAP-R:CCGCTCGAGACTTCTTTCTACAGCATAAAT ；
SBD-1-F:CCGGAATTCCAAGGAGTAAGAAATCGTCTAAG ；
SBD-1-R:ATAGCGGCCGCCTTCTTTCTGCAGCATTTTACT ；
Lysozyme-F:CGCAGATCTAGGTCTTTGCTAATCTTGGTG ；
Lysozyme-R:CCGCTCGAGCAGCCGGCAGCCTCTGATCCA。
9.權(quán)利要求1的共表達(dá)載體的表達(dá)方法，其特征在于將共表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到同一宿主菌進(jìn)行涂板，過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌落接種于LB培養(yǎng)基中，搖菌過(guò)夜，轉(zhuǎn)接至新LB培養(yǎng)基中，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的表達(dá)方法，其特征在于培養(yǎng)最終達(dá)到OD值0.6-0.8，所用IPTG濃度為ImM/L。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK104131021SQ201410375519
【公開(kāi)日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年8月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月1日
【發(fā)明者】周繼章, 陳啟偉, 李兆才, 曹小安, 宮曉煒 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所