以抑制Smurf1泛素化降解RhoB為靶點的抗腫瘤藥物篩選方法
【專利摘要】以抑制Smurf1泛素化降解RhoB為靶點的抗腫瘤藥物篩選方法，涉及抗癌癥藥物篩選。將候選化合物與物質(zhì)實體接觸；觀察候選化合物對所述一種抑制E3泛素連接酶Smurf1泛素化降解其底物RhoB的檢測結(jié)果的影響，所述候選化合物若能夠使細胞內(nèi)的檢測結(jié)果發(fā)生負向改變，即表征Smurf1泛素化降解RhoB的能力減弱，則表明該候選化合物是抗腫瘤的潛在藥物。所述表明該候選化合物是抗腫瘤的潛在藥物后，可進一步選擇能提高癌細胞中RhoB蛋白含量的化合物，其具體方法：將候選化合物與不同類型的腫瘤細胞接觸；觀察候選化合物對不同類型的腫瘤細胞中RhoB蛋白含量的影響。實驗周期短、檢測過程快、靈敏度高、應用范圍廣。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及抗癌癥藥物篩選，尤其是涉及以抑制Smurf 1泛素化降解RhoB為靶點 的抗腫瘤藥物篩選方法。 以抑制Smurf 1泛素化降解RhoB為靶點的抗腫瘤藥物篩選 方法

【背景技術(shù)】
[0002] 2010年，癌癥已超過心腦血管疾病成為第一大危害人類健康的疾病。2013年世界 衛(wèi)生組織公布，全世界每年患癌癥人數(shù)大幅度增長，至今每年檢驗出的新增癌癥患者數(shù)已 經(jīng)超過1400萬名。這與2008年的統(tǒng)計結(jié)果1270萬人相比，人數(shù)明顯增加。同期，癌癥患 者的死亡人數(shù)也有所增加，從過去的760萬人增加到820萬人。癌細胞區(qū)別正常細胞的一 個重要標志就是逃逸細胞程序性死亡，即細胞凋亡（apoptosis)。細胞凋亡是由于內(nèi)外環(huán)境 變化或死亡信號觸發(fā)，在相關(guān)基因調(diào)控下引起的細胞主動死亡過程，在生理狀態(tài)下能消除 機體內(nèi)老化細胞及潛在性異常生長細胞，對于保持機體穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用。凋亡調(diào)控失調(diào) 可引起人體多種疾病，也是腫瘤發(fā)生的重要原因之一。近年研究也發(fā)現(xiàn)，放化療等多種抗腫 瘤治療的部分機制與誘導凋亡有關(guān)。因此，探明凋亡的相關(guān)機制以及利用凋亡機制對腫瘤 進行治療具有重要意義。腫瘤細胞通常具有一定的凋亡抵抗機制，利用細胞凋亡機制針對 腫瘤的治療也就是在凋亡調(diào)節(jié)的各個水平上使促凋亡和抗凋亡的平衡發(fā)生改變，誘導腫 瘤細胞凋亡。
[0003] 隨著對腫瘤細胞凋亡機制的深入研究，藥物誘導腫瘤細胞凋亡已成為目前腫瘤治 療的重要途徑之一。在目前的抗癌藥物中，無論是細胞周期特異性藥物，還是細胞周期非特 異性藥物，對癌細胞的殺傷作用都服從一級動力學原理，即只能按比例而不能全部殺傷腫 瘤細胞。目前，臨床上用于治療腫瘤的藥物大都無法避免對機體產(chǎn)生副作用，因此尋求高效 誘導細胞凋亡的藥物，在殺傷殘存的癌細胞的同時，又能避免對正常細胞的殺傷，具有非常 重要的意義。
[0004] Smurf 1 (SMAD Ubiquitination Regulatory Factorl)是一種 E3 泛素連接酶，在 1999年由Zhu等人以Smadl為誘餌利用酵母雙雜交技術(shù)，在非洲爪蟾中發(fā)現(xiàn)并鑒定出來。 它能選擇性地結(jié)合受體調(diào)節(jié)蛋白Smad家族的成員，并使其泛素化降解，進而調(diào)節(jié)TGFi3信 號通路。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，Smurfl在腸癌、胰腺癌和前列腺癌中高表達，提示其可能作為 一個原癌基因促進腫瘤的發(fā)生。有文獻報道，Smurfl可以泛素化降解RhoA促進腫瘤細胞 的上皮 _基質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT)過程，還可以通過單泛素 化TRAF4分子促進乳腺癌細胞的遷移。而且，Smurfl還可以通過穩(wěn)定細胞內(nèi)MDM2的蛋白 水平抑制P53蛋白的穩(wěn)定性，從而抑制細胞凋亡。
[0005] RhoB和其同家族的RhoA和RhoC在氨基酸序列有86 %的同源性，生 物學功能也有重合：以前的觀點認為，RhoA，RhoB，RhoC協(xié)同調(diào)控細胞骨架運動 (Etienne-Manneville, S.，and Hall, A. 2002. Nature420, 629-635)。但更多的證據(jù)顯不， RhoB具有許多獨特于RhoA和RhoC的性質(zhì)。最有意思的是，與RhoA和RhoC促進細胞增長 的作用不同，RhoB作為一個抑癌基因，抑制細胞增長。雖然RhoB敲除的小鼠沒有明顯的 生理缺陷，但是RhoB-/-的小鼠胚胎成纖維細胞（MEF)在纖維蛋白原（fibronectin)上的 運動能力明顯減弱。過表達RhoB基因的細胞生長緩慢，并易于發(fā)生凋亡。小鼠腹腔注射 RhoB-/-細胞的成瘤效率明顯高于Rh〇B+/+細胞。而且，用DMBA，一種導致皮膚癌變的化學 誘變劑處理野生型和RhoB敲除型小鼠的皮膚，敲除小鼠的皮膚瘤發(fā)生率顯著增高（Liu，A. X.，2001. Mol Cell Biol21，6906-6912)。臨床樣本也顯示，隨著肺癌、頭頸癌和腦癌腫瘤 惡性程度的增加，RhoB蛋白水平呈逐漸下降的趨勢，提示其可能作為一個抑癌基因發(fā)揮抗 腫瘤的功能（Adnane, J.，2002. Clin Cancer Res8, 2225-2232 ;Karlsson, R.，2009. Biochim Biophys Actal796, 91-98 ；Mazieres, J. , 2004. Clin Cancer ReslO, 2742-2750)〇
[0006] RhoB這種抑制細胞增殖的功能可能和其在外界環(huán)境壓力下協(xié)助細胞走向凋亡途 徑相關(guān)。經(jīng)E1A和突變的H-Ras轉(zhuǎn)化過的Rh 〇B-/-MEF細胞在γ射線，拓撲異構(gòu)酶抑制 劑阿霉素（Doxorubcin，D0X)等DNA損傷試劑處理后，其凋亡程度明顯低于野生型對照組 (Liu, A.X，2001. Proc Natl Acad Sci U S A98, 6192-6197)。而呼吸鏈阻斷劑疊氮化納 (NaN3)引起的細胞凋亡似乎和RhoB無關(guān)，說明RhoB獨特應答由DNA損傷（DNA damage)引 起的凋亡信號。同樣，干涉內(nèi)源的RhoB后，人胃癌細胞NUGC-3對抗癌藥物表現(xiàn)出不敏感性， 凋亡比例明顯下降（Kim, Β· K.，2011. Carcinogenesis32, 254-261)。因此，RhoB 被認為是一 個良好的藥物靶點。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的第一目的在于提供一種抑制E3泛素連接酶Smurfl泛素化降解其底物 RhoB的檢測方法。
[0008] 本發(fā)明的第二目的在于提供一種抑制E3泛素連接酶Smurfl泛素化降解其底物 RhoB的用途。
[0009] 本發(fā)明的第三目的在于提供一種以抑制Smurf 1泛素化降解RhoB為靶點的抗腫瘤 藥物篩選的方法。
[0010] 所述一種抑制E3泛素連接酶Smurf 1泛素化降解其底物RhoB的檢測方法，選自但 不限于細胞分子生物學檢測方法或化學生物學檢測方法，所述細胞分子生物學檢測方法包 括但不限于免疫共沉淀方法、免疫印跡、體內(nèi)和體外泛素化及流式細胞技術(shù)檢測細胞凋亡 等；所述化學生物學檢測方法包括但不限于熒光滴定法、BIAcore方法等。
[0011] 所述一種抑制E3泛素連接酶Smurfl泛素化降解其底物RhoB可用于抑制Smurfl 泛素化降解RhoB為靶點的抗腫瘤藥物的篩選。
[0012] 所述一種以抑制Smurfl泛素化降解RhoB為靶點的抗腫瘤藥物篩選的方法，包括 以下步驟：
[0013] (a)將候選化合物與物質(zhì)實體接觸；
[0014] 在步驟（a)中，所述物質(zhì)實體可選自細胞或體外表達純化的蛋白質(zhì)等。
[0015] (b)觀察候選化合物對所述一種抑制E3泛素連接酶Smurfl泛素化降解其底物 RhoB的檢測結(jié)果的影響，所述候選化合物若能夠使細胞內(nèi)的檢測結(jié)果發(fā)生負向改變，即表 征Smurfl泛素化降解RhoB的能力減弱，則表明該候選化合物是抗腫瘤的潛在藥物。
[0016] 在步驟（b)中，所述表明該候選化合物是抗腫瘤的潛在藥物后，可進一步選擇能 提高癌細胞中RhoB蛋白含量的化合物；所述進一步選擇能提高癌細胞中RhoB蛋白含量的 化合物的具體方法可為：
[0017] (1)將候選化合物與不同類型的腫瘤細胞接觸；
[0018] (2)觀察候選化合物對不同類型的腫瘤細胞中RhoB蛋白含量的影響。
[0019] 在步驟（2)中，所述觀察候選化合物對不同類型的腫瘤細胞中RhoB蛋白含量的影 響后，可對篩選出的且能夠提高不同腫瘤細胞中RhoB含量的潛在化合物進行進一步的細 胞凋亡實驗和裸鼠成瘤模型實驗，以選出有效抗腫瘤的藥物（化合物）。
[0020] 本發(fā)明的主要優(yōu)點在于：
[0021] 1、首次提供了一種以抑制Smurfl泛素化降解RhoB的抗腫瘤藥物靶點，提供了一 種以抑制Smurf 1泛素化降解RhoB為靶點的抗腫瘤藥物篩選方法，所述方法包含蛋白-蛋 白相互作用的檢測，RhoB泛素化化水平的檢測，細胞凋亡檢測以及裸鼠成瘤實驗模型。
[0022] 2、本發(fā)明的方法包含了三個層層遞進的篩選方法，靶點功能明確，作用效果直觀， 系統(tǒng)穩(wěn)定，結(jié)果可靠，具有實驗周期短、檢測過程快、靈敏度高、應用范圍廣等特點，為高通 量的抗腫瘤藥物的篩選提供了新的方法，可應用于藥物開發(fā)前沿，及建立化合物規(guī)模篩選 的技術(shù)平臺。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1為過表達E3泛素連接酶Smurfl影響HeLa細胞內(nèi)源RhoB蛋白水平。實驗結(jié) 果表明，Smurfl野生型（Smurf 1WT)可以有效降低RhoB的蛋白水平，而其E3連接酶失活體 (SmurflCA)卻對RhoB的蛋白穩(wěn)定性無影響。Flag-SmurflWT和Flag-SmurflCA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HeLa細胞，24h后常規(guī)收集細胞，然后進行免疫印跡實驗（Western blotting)檢測細胞裂 解液中RhoB的蛋白水平。
[0024] 圖2為干涉細胞內(nèi)源E3泛素連接酶Smurfl后對RhoB蛋白水平的影響。實驗結(jié) 果表明，用兩種特異干涉細胞內(nèi)Smurfl的干涉RNA(sh-Smurfl_l，sh-Smurfl-2)可以提高 RhoB蛋白的穩(wěn)定性。分別用Smurfl的干涉RNA(sh-Smurfl_l，sh-Smurfl-2)轉(zhuǎn)染HeLa細 胞，48h后用免疫印跡實驗（Western blotting)檢測RhoB的蛋白水平。
[0025] 圖3為Smurf 1和RhoB的體外GST-Pulldown實驗。實驗結(jié)果表明，大腸桿菌表達 的GST-Smurfl和RhoB可以直接結(jié)合。利用大腸桿菌BL21表達的GST-Smurfl和RhoB蛋 白可以相互結(jié)合。
[0026] 圖4為細胞內(nèi)Smurfl對RhoB泛素化水平的影響。實驗結(jié)果表明，Smurfl可以增 強 RhoB 的泛素化水平。Myc-SmurflWT，Myc-SmurflCA，F(xiàn)lag-RhoB 及 HA_Ub 按圖所不共同 轉(zhuǎn)染293T細胞20h后用蛋白酶體抑制劑MG-132處理細胞（5yM，18h)。然后常規(guī)收集細 胞，并用Flag抗體進行免疫沉淀實驗（Co-immunoprecipitation assay),然后用免疫印跡 實驗（Western blotting)檢測免疫沉淀復合物中Flag-RhoB泛素化水平。
[0027] 圖5為細胞內(nèi)Smurfl的蛋白水平對RhoB泛素化水平的影響。實驗結(jié)果表明，抑制 細胞內(nèi)Smurf 1的蛋白表達可以降低RhoB的泛素化水平。Smurfl的干涉RNA(sh-Smurfl_l， sh-Smurfl-2)，F(xiàn)lag-RhoB及HA-Ub按圖所示共同轉(zhuǎn)染293T細胞48h后用蛋白酶體抑制 劑MG-132處理細胞（5 μ M，18h)。然后常規(guī)收集細胞，并用Flag抗體進行免疫沉淀實驗 (Co-immunoprecipitation assay),然后用免疫印跡實驗（Western blotting)檢測免疫沉 淀復合物中Flag-RhoB泛素化水平。
[0028] 圖6為Smurfl和RhoB的體外泛素化實驗。實驗結(jié)果表明，大腸桿菌表達的 GST-Smurfl可以泛素化RhoB。利用大腸桿菌BL21表達的GST-Smurfl可以利用泛素（Ub) 對RhoB蛋白進行泛素化。
[0029] 圖7為化合物XM01對HeLa細胞中RhoB蛋白穩(wěn)定性的影響。實驗結(jié)果表明，XM01 可以有效提高HeLa細胞內(nèi)RhoB蛋白的穩(wěn)定性。XM01按不同濃度處理細胞24h后，用免疫 印跡實驗（Western blotting)檢測細胞裂解液中RhoB的蛋白含量。
[0030] 圖8為免疫印跡方法檢測化合物XM01對Smurf 1泛素化降解RhoB能力的影響。實 驗結(jié)果表明，XM01可以有效抑制Smurfl泛素化降解RhoB。Flag-SmurflWT、Flag_SmurflCA 和Flag-RhoB質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，24h后用不同濃度的化合物XM01處理細胞，然后常規(guī) 收集細胞進行免疫印跡實驗（Western blotting)檢測細胞裂解液中RhoB的蛋白水平。
[0031] 圖9為體外泛素化方法檢測化合物XM01對Smurfl泛素化降解RhoB能力的影響。 實驗結(jié)果表明，XM01可以在體外系統(tǒng)中有效抑制Smurfl泛素化降解RhoB。
[0032] 圖10為流式細胞技術(shù)檢測細胞凋亡。實驗結(jié)果表明，隨著化合物XM01濃度的升 高，HeLa細胞的凋亡程度也隨之升高，說明XM01可以通過引起細胞凋亡抑制腫瘤生長。
[0033] 圖11為裸鼠成瘤能力的檢測。將HeLa細胞以5X106的密度接種于裸鼠后腿腿 根的側(cè)皮下，四周后用化合物XM01處理右側(cè)皮下腫瘤，對照溶劑DMS0處理左側(cè)皮下腫瘤， 一周后再觀察腫瘤大小。實驗結(jié)果表明，化合物XM01顯著抑制了腫瘤細胞在裸鼠體內(nèi)的生 長。

【具體實施方式】
[0034] 本發(fā)明的結(jié)果表明，E3泛素連接酶Smurf 1通過泛素化降解RhoB，從而調(diào)控細胞在 DNA損傷條件下發(fā)生的凋亡。在正常條件下，Smurfl泛素化降解RhoB將其蛋白保持在較低 的水平。而在DNA損傷的條件下，Smurfl自身泛素化降解增強，從而導致RhoB的蛋白穩(wěn)定 性增強，促進細胞發(fā)生凋亡。
[0035] 基于以上結(jié)果，建立了抑制Smurf 1泛素化降解RhoB的檢測系統(tǒng)，并能夠從候選化 合物中篩選出能夠抑制Smurfl泛素化降解RhoB的化合物，從而為抗腫瘤新藥開發(fā)提供一 個有利的技術(shù)平臺。重要的是，針對這一靶點的藥物，將可能解決現(xiàn)有的抗腫瘤藥物靶點特 異性不強、副作用強及藥物毒性等問題，從而為治療癌癥提供更好的治療手段。
[0036] 抑制E3泛素連接酶活性的靶點
[0037] 本發(fā)明提供了一種E3泛素連接酶降解其底物的靶點，S卩Smurfl降解RhoB靶點。 實驗表明，通過常規(guī)手段（但不限于）可檢測該底物的泛素化強度，并可觀察候選化合物對 該泛素化強度的影響，用于篩選抗腫瘤的化合物。
[0038] 所述的檢測Smurfl降解RhoB的手段包括但不限于：免疫共沉淀、免疫印跡、體內(nèi) 及體外泛素化實驗。只要適用于檢測泛素化強度的其它方法也被包含在本發(fā)明中。作為本 發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的檢測方法是體內(nèi)-體外泛素化及流式細胞技術(shù)。該方法的優(yōu)點是 快速準確，結(jié)果更可靠。
[0039] 篩選方法
[0040] 所述的篩選方法是抑制Smurf 1泛素化降解RhoB的檢測方法，可以是細胞水平上 的檢測方法，也可以是對體外表達純化的蛋白質(zhì)進行檢測的方法。通過在細胞培養(yǎng)物中加 入候選化合物，或者使體外純化表達的蛋白質(zhì)與候選化合物接觸產(chǎn)生作用，觀察候選化合 物對所述Smurfl泛素化降解RhoB的影響，從而篩選潛在的抗腫瘤化合物。
[0041] 因此，本發(fā)明還提供一種以抑制Smurfl泛素化降解RhoB為靶點的篩選抗腫瘤的 潛在藥物（化和物）的方法，所述方法包括步驟：
[0042] (a)將候選化合物與所述的相互作用檢測方法中的物質(zhì)實體（如細胞，體外表達 純化的蛋白質(zhì)）接觸；和
[0043] (b)觀察候選化合物對所述的相互作用檢測方法中的檢測結(jié)果的影響；
[0044] 其中，如果候選化合物能夠使細胞內(nèi)的檢測結(jié)果發(fā)生負向改變，即表征Smurf 1泛 素化降解RhoB能力減弱，則表明該化合物是抗腫瘤的潛在藥物（化合物）。
[0045] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，將分別攜帶所述的兩種蛋白的編碼序列的重組載體瞬時 共同轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞，通過免疫印跡方法檢測所述兩種蛋白間的相互作用，篩選潛在的 抗腫瘤藥物。為了實現(xiàn)上述目的，采用以下技術(shù)：Smurfl表達載體及RhoB表達載體的構(gòu)建； Smurfl表達載體、RhoB表達載體瞬時共同轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的構(gòu)建；免疫印跡方法檢測Smurfl對 RhoB泛素化能力。
[0046] 通過上述方法初步篩選出的化合物可構(gòu)成一個篩選庫，以便于最終可以從中選擇 到對腫瘤生長有抑制作用的藥物。
[0047] 在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括選擇能提高腫瘤細胞內(nèi)RhoB蛋白水平的化 合物。所述方法包括步驟：
[0048] (a)將候選化合物與腫瘤細胞接觸；和
[0049] (b)觀察候選化合物對腫瘤細胞內(nèi)RhoB蛋白水平水平的影響。
[0050] 通過上述方法，可以對初步篩選到的化合物進行進一步的篩選或驗證。
[0051] 在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括步驟：對如上獲得的潛在化合物進行進一步 的流式細胞凋亡檢測及裸鼠成瘤實驗，以選出有效抗腫瘤的藥物（化合物）。
[0052] 通過上述方法，可從上兩次篩選出的潛在化合物中選擇到抗腫瘤藥物（化合物）。
[0053] 以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本 發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應用于 本發(fā)明中。所述的優(yōu)選實施方法與材料僅做示范之用。
[0054] 實施例1
[0055] 采用免疫印跡分析（Western blotting)方法檢測Smurfl對RhoB蛋白穩(wěn)定性的 影響。
[0056] 試驗方法如下：
[0057] 1)細胞轉(zhuǎn)染：
[0058] 將細胞接種于直徑12孔培養(yǎng)板，24h后轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前細胞換新鮮的培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染步 驟為：取1. 5mL離心管，依次加入水180 μ L，相應質(zhì)粒，2· 5M CaCl220 μ L，HBS200 μ L，輕柔 混勻后，于室溫靜置15?30min，隨后緩慢滴加到培養(yǎng)液中，輕輕晃動培養(yǎng)盤，使分布均勻。
[0059] 轉(zhuǎn)染12h后，將細胞培養(yǎng)液換為新鮮的DMEM(Dulbecco' s Modified Eagle' s Medium)，繼續(xù)培養(yǎng)12h后，常規(guī)收集細胞以用于后續(xù)實驗。
[0060] 溶液配方：
[0061] HBS ：280mM NaCl, lOmM KC1, 1. 5mM Na2HP04, 12mM Glucose, 50mM HEPES, pH7. 05〇
[0062] 2) Western-blot 檢測：
[0063] a.蛋白電泳：
[0064] 取20?40μ g蛋白樣品，加等體積4XSDS樣品緩沖液，95°C煮沸5min，于不連續(xù) SDS-PAGE膠中電泳，電壓100V，待樣品進入分離膠后將電壓調(diào)為150V。
[0065] b.電轉(zhuǎn)移：
[0066] 電轉(zhuǎn)液于4°C預冷，切好膠后將同樣大小的甲醇預處理的PVDF膜以及濾紙浸于 電轉(zhuǎn)液中；PVDF膜貼于膠后，兩面覆蓋濾紙，趕盡氣泡，按膜朝正極的順序裝于電轉(zhuǎn)槽中， 于一 20°C 電轉(zhuǎn)（100V，60min)。
[0067] c.抗原抗體反應：
[0068] ①封閉：封閉液室溫封閉lh ;
[0069] ②一抗反應：封閉后膜與相應一抗于室溫孵育1?3h ;
[0070] ③二抗反應：TBST洗3次，每次5min，之后加入相應的二抗，于室溫孵育1?3h。
[0071] d.ECL 檢測：
[0072] TBST洗3次，每次lOmin。ECL的A液和B液以1 : 1 (V/V)混和，滴加于膜表面， 孵育lmin后曝光。
[0073] 試驗結(jié)果如下：
[0074] 如圖1及圖2所示，；Smurfl野生型（SmurflWT)可以有效降低RhoB的蛋白水平， 而其E3連接酶失活體（Smurf 1CA)卻對RhoB的蛋白穩(wěn)定性無影響。同樣，用兩種特異干涉 細胞內(nèi)Smurfl的干涉RNA(sh-Smurfl_l，sh-Smurfl-2)可以提高RhoB蛋白的穩(wěn)定性。
[0075] 試驗結(jié)果表明，Smurf 1可以調(diào)經(jīng)細胞內(nèi)RhoB蛋白的穩(wěn)定性。
[0076] 實施例2
[0077] 用GST融合蛋白沉降技術(shù)（GST-Pulldown)檢測Smurfl和RhoB的結(jié)合。
[0078] 試驗方法如下：
[0079] 1)蛋白的體外表達及純化
[0080] 首先將目的DNA片段克隆到合適的細菌表達載體中，正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 E. coliBL-21或DH-5 α細胞，在LB/氨芐青霉素平板上選擇轉(zhuǎn)化子，接種到適量的LB/amp 培養(yǎng)基中，37°C搖動培養(yǎng)過夜。第二天以此為種子，以1 : 100的比例接種到大體積的LB/ amp培養(yǎng)基中，37°C搖動培養(yǎng)到0D_大約為0. 6,加入IPTG到終濃度為lmmol/L以誘導融 合蛋白的表達，20°C低溫誘導以減少包涵體的形成，繼續(xù)培養(yǎng)6h以上。對于不同的載體或 不同的蛋白，最佳的的誘導前細菌濃度，誘導所需的IPTG濃度和誘導的溫度、誘導的時間 均不同。
[0081] 蛋白表達完成后，離心收集菌體，用適量預冷的裂解緩沖液（lysis buffer)重懸 菌體，用超聲破碎儀破碎菌體，超聲前加入蛋白酶抑制劑PMSF到終濃度為lmmol/L。超聲破 碎的功率及時間根據(jù)不同的細菌濃度和不同大小的蛋白而不同。破碎后的菌體以12000r/ min的轉(zhuǎn)速，4°C離心10min，上清轉(zhuǎn)移到新的管子中。加入預先洗好的GST beads,在4°C的 旋轉(zhuǎn)混合儀上混合3h以上。親和有蛋白的GST beads用預冷的裂解緩沖液洗幾次后，得到 相對較純的融合蛋白。
[0082] 2)蛋白質(zhì)體外GST pull down實驗
[0083] 利用谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST)基因融合載體體外表達純化出GST、GST-RhoB和 GST-Smurf 1CA融合蛋白，其中，GST-RhoB蛋白用TEV酶將GST標簽去除，得到RhoB蛋白。 按圖2所示加入相應量的純化蛋白。旋轉(zhuǎn)搖床4?孵育lh，加入20 μ L4X loading buffer 終止反應，加熱至95°C，5min。樣品進行SDS-PAGE和Western blot分析。
[0084] 試驗結(jié)果如下：
[0085] 如圖3所示，GST-Smurfl蛋白可以在體外直接和RhoB蛋白相互結(jié)合。
[0086] 實施例3
[0087] 通過細胞內(nèi)泛素化實驗檢測Smurfl是否影響RhoB的泛素化水平。
[0088] 試驗方法如下：
[0089] 以1.5?2X105個/mL的密度接種細胞于10cm細胞培養(yǎng)盤中，待細胞密度達到 40%至50%時，用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染相應組合的質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染24h后換液同時加藥，10 μ M MG-132 處理細胞，加藥的目的是抑制已經(jīng)被不同程度泛素化的底物蛋白通過溶酶體途徑降解，轉(zhuǎn) 染后36h收集細胞，用含有PMSF和ΝΕΜ的ΤΝΤΕ (0. 5 % ) buffer進行裂解。從得到的lmL細 胞裂解液中，取45 μ L作為 total lysate加入 15 μ L4X loading buffer用于Western blot 分析，剩余955 μ L用于第一次IP。第一次IP時細胞裂解液中加入lyL Flag-抗，旋轉(zhuǎn)搖 床4°C孵育2h，加入30 μ L預先封閉好的proteinA/G，旋轉(zhuǎn)搖床4°C孵育2h。用TNTE (0· 1 % ) buffer洗滌3次，加入60 μ L的1 % SDS，加熱至95°C，5min，使被IP下來的各種處于結(jié)合 狀態(tài)的蛋白質(zhì)相互分離。取上清，用TNTE(0. 1% )buffer稀釋至500μ L的體積，進行第二 次ΙΡ，步驟同上。制備好的樣品用于Western blot分析，其中用ΗΑ抗體檢測檢測底物蛋白 的泛素化情況。
[0090] 試驗結(jié)果如下：
[0091] 如圖4及圖5所示，Smurfl野生型（Smurf 1WT)可以有效提高RhoB泛素化水平， 而其E3連接酶失活體（SmurflCA)卻對RhoB的泛素化水平無影響。而干涉細胞內(nèi)Smurf! 后RhoB的泛素化水平明顯降低。
[0092] 實施例4
[0093] 采用體外泛素化實驗檢測Smurfl是否影響RhoB的泛素化水平。
[0094] 試驗方法如下：
[0095] 體外表達純化出泛素活化酶E1，泛素結(jié)合酶E2,泛素連接酶E3, RhoB蛋白，泛素 Ubiquitin。根據(jù)圖6加入相應量的純化蛋白。室溫孵育15min，使底物蛋白RhoB和E3泛 素連接酶充分結(jié)合，然后加入E1啟動泛素化反應，室溫孵育45min，等體積的2% SDS加熱 至95°C，5min。取上清用ΤΝΤΕ0. 5擴大體積，加 Flag抗體和protein A/G4°C孵育過夜，樣 品進行 SDS-PAGE 和 Western blot 分析。
[0096] 試驗結(jié)果表明，如圖6所示，Smurfl野生型（SmurflWT)而非其E3連接酶失活體 (SmurflCA)可以有效的提高RhoB泛素化水平。
[0097] 實施例5
[0098] 化合物XM01對HeLa細胞中RhoB蛋白穩(wěn)定性的影響。
[0099] 實驗方法如下：
[0100] 利用實施例1采用的細胞培養(yǎng)及免疫印跡方法用不同濃度的化合物XM01處理 HeLa細胞24h，按常規(guī)收集細胞，然后進行免疫印跡實驗（Western blotting)檢測細胞裂 解液中RhoB的蛋白水平。
[0101] 實驗結(jié)果表明，如圖7所示，隨著化合物XM01濃度的升高，HeLa細胞中RhoB蛋白 的穩(wěn)定也逐步提高，表明XM01是潛在的抑制Smurfl泛素化降解RhoB的化合物。
[0102] 實施例6
[0103] 免疫印跡方法檢測化合物XM01對Smurfl泛素化降解RhoB能力的影響。
[0104] 利用實施例1采用的細胞培養(yǎng)、細胞轉(zhuǎn)染及免疫印跡方法，用不同濃度的化合物 XM01處理轉(zhuǎn)染后的293T細胞，24h后按常規(guī)收集細胞，然后進行免疫印跡實驗（Western blotting)檢測細胞裂解液中RhoB的蛋白水平。
[0105] 實驗結(jié)果表明，如圖8所示，隨著化合物XM01濃度的升高，293T細胞中Flag-RhoB 蛋白的穩(wěn)定也逐步提高，表明XM01是潛在的抑制Smurfl泛素化降解RhoB的化合物。
[0106] 實施例7
[0107] 體外泛素化方法檢測化合物XM01對Smurfl泛素化降解RhoB能力的影響。利用 實施例4采用的體外泛素化方法檢測用不同濃度的化合物XM01在體外系統(tǒng)中對Smurf 1對 RhoB泛素化能力的影響。根據(jù)圖9加入相應量的純化蛋白及不同濃度的XM01，反應后進行 SDS-PAGE 和 Western blot 分析。
[0108] 實驗結(jié)果表明，如圖9所示，隨著化合物XM01濃度的升高，Smurfl在體外系統(tǒng)中 對RhoB泛素化能力逐漸減弱，表明XM01抑制Smurfl泛素化降解RhoB。
[0109] 實施例8
[0110] 流式實驗及裸鼠成瘤實驗檢測化合物XM01對腫瘤生長的抑制效果。
[0111] 利用實施例1采用的細胞培養(yǎng)方法檢測用不同濃度的化合物XM01對HeLa細胞凋 亡程度的影響。根據(jù)圖10加入不同濃度（對照，10 μ M，20 μ M)的化合物XM01，24h后收集 細胞進行流式細胞儀檢測。
[0112] 實驗結(jié)果表明，如圖10所示，隨著化合物XM01濃度的升高，HeLa細胞的凋亡程度 也隨之升高，表明XM01可以通過引起細胞凋亡抑制腫瘤生長。在圖10中，圖（a)為對照組， 凋亡比率為2.7%，圖（b)為ΧΜΟΙΙΟμΜ，凋亡比率為37.6%，圖（c)為ΧΜ0120μΜ，凋亡比 率為64. 7%。
[0113] 利用實施例1采用的細胞培養(yǎng)方法檢測化合物ΧΜ01對裸鼠成瘤能力的影響。將 HeLa細胞以5Χ 106的密度接種于裸鼠后腿腿根的側(cè)皮下，四周后用化合物ΧΜ01處理右側(cè) 皮下腫瘤，對照溶劑DMS0處理左側(cè)皮下腫瘤，一周后再觀察腫瘤大小。
[0114] 實驗結(jié)果表明，如圖11所示的兩只裸鼠，化合物XM01顯著抑制了腫瘤細胞在裸鼠 體內(nèi)的生長。
【權(quán)利要求】
1. 一種抑制E3泛素連接酶Smurf 1泛素化降解其底物RhoB的檢測方法，其特征在于選 自但不限于細胞分子生物學檢測方法或化學生物學檢測方法，所述細胞分子生物學檢測方 法包括但不限于免疫共沉淀方法、免疫印跡、體內(nèi)和體外泛素化及流式細胞技術(shù)檢測細胞 凋亡；所述化學生物學檢測方法包括但不限于熒光滴定法、BIAcore方法。
2. -種抑制E3泛素連接酶Smurfl泛素化降解其底物RhoB在用于抑制Smurfl泛素化 降解RhoB為靶點的抗腫瘤藥物的篩選中應用。
3. -種以抑制Smurfl泛素化降解RhoB為靶點的抗腫瘤藥物篩選的方法，其特征在于 包括以下步驟： (a) 將候選化合物與物質(zhì)實體接觸； (b) 觀察候選化合物對所述一種抑制E3泛素連接酶Smurf 1泛素化降解其底物RhoB 的檢測結(jié)果的影響，所述候選化合物若能夠使細胞內(nèi)的檢測結(jié)果發(fā)生負向改變，即表征 Smurfl泛素化降解RhoB的能力減弱，則表明該候選化合物是抗腫瘤的潛在藥物。
4. 如權(quán)利要求3所述一種以抑制Smurf 1泛素化降解RhoB為靶點的抗腫瘤藥物篩選的 方法，其特征在于在步驟（a)中，所述物質(zhì)實體選自細胞或體外表達純化的蛋白質(zhì)。
5. 如權(quán)利要求3所述一種以抑制Smurfl泛素化降解RhoB為靶點的抗腫瘤藥物篩選的 方法，其特征在于在步驟（b)中，所述表明該候選化合物是抗腫瘤的潛在藥物后，進一步選 擇能提高癌細胞中RhoB蛋白含量的化合物。
6. 如權(quán)利要求5所述一種以抑制Smurf 1泛素化降解RhoB為靶點的抗腫瘤藥物篩選的 方法，其特征在于所述進一步選擇能提高癌細胞中RhoB蛋白含量的化合物的具體方法為： (1) 將候選化合物與不同類型的腫瘤細胞接觸； (2) 觀察候選化合物對不同類型的腫瘤細胞中RhoB蛋白含量的影響。
7. 如權(quán)利要求6所述一種以抑制Smurfl泛素化降解RhoB為靶點的抗腫瘤藥物篩選的 方法，其特征在于在步驟（2)中，所述觀察候選化合物對不同類型的腫瘤細胞中RhoB蛋白 含量的影響后，對篩選出的且能夠提高不同腫瘤細胞中RhoB含量的潛在化合物進行進一 步的細胞凋亡實驗和裸鼠成瘤模型實驗，以選出有效抗腫瘤的藥物。
【文檔編號】C12Q1/02GK104101714SQ201410335052
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月15日
【發(fā)明者】王洪睿, 郭磊, 王梅林, 曾濤玲, 林琦 申請人:廈門大學