一種PGC1-α基因DNA甲基化檢測(cè)試劑及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種PGC1-α基因DNA甲基化檢測(cè)試劑及其應(yīng)用。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，PGC1-α基因中位點(diǎn)(+171)的甲基化是DR代謝記憶的早期診斷標(biāo)志。本發(fā)明在上述研究基礎(chǔ)上，制備了用于檢測(cè)PGC1-α基因位點(diǎn)+171甲基化的檢測(cè)試劑，并提供了相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明提供的甲基化檢測(cè)試劑，可以定性或定量的檢測(cè)被測(cè)試對(duì)象PGC1-α基因位點(diǎn)+171是否發(fā)生了甲基化及甲基化程度，從而預(yù)測(cè)被測(cè)試對(duì)象是否有DR代謝記憶及患病風(fēng)險(xiǎn)，給臨床實(shí)踐以指導(dǎo)作用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種PGC1-a基因DNA甲基化檢測(cè)試劑及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種PGCl-α基因DNA甲基化檢測(cè)試劑及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體Y輔助激活因子I a (peroxisomeproliferator-activated receptor y coactivatorl α , PGCl-α ),由 PPARGC1A 基因編碼，是轉(zhuǎn)錄輔助激活因子PGCl家族中最出名的成員，也是近年來(lái)細(xì)胞及線(xiàn)粒體代謝研究的熱點(diǎn)之一。PGCl-α —方面能增強(qiáng)線(xiàn)粒體的合成功能；另一方面能夠減少線(xiàn)粒體代謝副產(chǎn)物的堆積，它可通過(guò)調(diào)控許多ROS清除酶的活性而減少ROS的毒性作用。因而，PGCl- α對(duì)整個(gè)線(xiàn)粒體代謝發(fā)揮了積極的調(diào)節(jié)作用。不僅如此，PGCl-α還具有能夠促進(jìn)脂肪代謝、減輕體重，能調(diào)控骨骼肌細(xì)胞中肌纖維類(lèi)型的轉(zhuǎn)換，能促進(jìn)糖異生等代謝過(guò)程的重要作用。正因如此，PGCl-α已成為治療糖尿病(Diabetes mellitus, DM)等代謝疾病的新靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，PGCl-α在DM患者的肌肉中表達(dá)是降低的，這可能與DM和胰島素抵抗引起的代謝紊亂有關(guān)。胰島中編碼PGCl-α的基因PPARGC1A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的增加可導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能下降引起胰島功能紊亂。但是，目前PGCl-a在糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabeticretinopathy, DR)及其代謝記憶中發(fā)揮的作用尚不明確,有待進(jìn)一步研究。
[0003]DR是糖尿病最常見(jiàn)和最嚴(yán)重的眼部并發(fā)癥，是工作年齡段人群最主要的致盲原因。目前全球DM患者人數(shù)高達(dá)3.47億，近30%的DM患者有不同程度的DR，3730萬(wàn)DR患者的視力受到威脅?？刂蒲鞘侵委烡M及其并發(fā)癥的關(guān)鍵。然而多個(gè)大型的臨床研究發(fā)現(xiàn)，若早期血糖控制不佳，即使后續(xù)血糖控制達(dá)標(biāo)，仍較早期血糖控制良好的患者更易發(fā)生DR等并發(fā)癥，這種現(xiàn)象稱(chēng)之為“代謝記憶”(Metabolic memory, MM)。
[0004] 隨著后基因組時(shí)代的到來(lái)，表觀(guān)遺傳學(xué)(Epigenetics)已成為生命學(xué)科的研究前沿。表觀(guān)遺傳學(xué)是針對(duì)遺傳學(xué)而言的，是指研究DNA序列不發(fā)生改變的可遺傳的基因表達(dá)變化的科學(xué)，它可以解釋一些經(jīng)典遺傳學(xué)所不能解釋的問(wèn)題。目前表觀(guān)遺傳學(xué)研究主要集中DNA甲基化及組蛋白乙酰化上。DNA甲基化修飾是基因組表觀(guān)遺傳調(diào)控中主要的方式，人類(lèi)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與DNA甲基化的異常有關(guān)，基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島高甲基化可導(dǎo)致抑癌基因表達(dá)沉默進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。DNA甲基化是指在甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到CG 二核苷酸胞嘧啶的5號(hào)碳原子上，形成5甲基胞嘧啶。DNA甲基化異常是細(xì)胞癌變過(guò)程中早期、頻發(fā)事件，因此特異基因的甲基化可作為癌癥早期診斷的分子標(biāo)志物、治療靶點(diǎn)和判斷預(yù)后手段。
[0005]本發(fā)明研究了 PGCl-α及其表觀(guān)遺傳修飾在DR代謝記憶中的作用。研究在體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞中PGCl-a和S0D2mRNA及蛋白的表達(dá)水平，分析高糖對(duì)PGCl-a和S0D2mRNA及蛋白表達(dá)的影響以及是否具有代謝記憶現(xiàn)象。同時(shí)檢測(cè)編碼PGCl- α的PPARGC1A基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化狀態(tài)，找到了一個(gè)與代謝記憶效應(yīng)相關(guān)的甲基化位點(diǎn)。進(jìn)一步的，本發(fā)明還根據(jù)該甲基化位點(diǎn)設(shè)計(jì)并合成了其甲基化檢測(cè)引物并制備了適用于該甲基化位點(diǎn)的檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒可用于DR代謝記憶早期診斷，具有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于證實(shí)PGCl- α基因及其表觀(guān)遺傳修飾在DR代謝記憶中的作用。所述的對(duì)PGCl- α基因及其表觀(guān)遺傳修飾的檢測(cè)可用于DR代謝記憶早期診斷。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于制備出PGCl-α基因甲基化檢測(cè)試劑，所述檢測(cè)試劑可用于DR代謝記憶的早期診斷、篩查和患病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)。
[0008]發(fā)明人發(fā)現(xiàn)并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，PGCl-a基因的一個(gè)位點(diǎn)(+171位點(diǎn)，具體見(jiàn)序列表中SEQ ID N01，所述+171位點(diǎn)位于SEQ ID NOl第459個(gè)堿基處)在高糖引起的糖代謝記憶細(xì)胞中高度甲基化，而在正常對(duì)照中均處于非甲基化狀態(tài)，提示PGCl-a基因中位點(diǎn)(+171)的甲基化是糖尿病代謝記憶的早期診斷標(biāo)志。
[0009]本發(fā)明在上述研究基礎(chǔ)上，提供一種檢測(cè)試劑，采用所述的檢測(cè)試劑組分中的一種或幾種可以檢測(cè)PGCl-a基因位點(diǎn)+171的甲基化程度。
[0010]進(jìn)一步，所述的檢測(cè)試劑包括DNA亞硫酸氫鹽修飾試劑盒和PGCl-α基因位點(diǎn)+171甲基化檢測(cè)試劑盒。
[0011]所述的PGCl-a基因位點(diǎn)+171甲基化檢測(cè)可以是現(xiàn)有甲基化檢測(cè)技術(shù)中任意一種能檢測(cè)PGCl-α基因位點(diǎn)+171是否甲基化的檢測(cè)方法。已知現(xiàn)有常用的CpG島甲基化檢測(cè)方法有甲基化敏感的限制性?xún)?nèi)切酶方法、NaHSO3法(Sodium bisulfite法)、芯片技術(shù)方法。NaHSO3法包括BSP測(cè)序法(BSP sequencing)、聯(lián)合NaHSO3限制性分析法(COBRA)、甲基化特異性PCR (Methylat1n Specific PCR，MSP)、熒光定量法(Methylight)。芯片技術(shù)方法包括甲基化高密度芯片(CpG Islands microarray)、差異甲基化雜交(DifferentialMethylat1n Hybridizat1n, DMH)、甲基化特異性寡核苷酸芯片(methylat1n specificoligonucleotide microarray, MSO microarray)。
[0012]進(jìn)一步，所述的PGCl-α基因位點(diǎn)+171甲基化檢測(cè)試劑盒采用BSP測(cè)序法對(duì)PGCl-α基因位點(diǎn)+171甲基化進(jìn)行檢測(cè)。所述的試劑盒包括一對(duì)BSP檢測(cè)引物。進(jìn)一步，所述BSP檢測(cè)引物采用序列表SEQ ID N02和SEQ ID N03。
[0013]所述BSP測(cè)序法基本原理是根據(jù)重亞硫酸鹽使DNA中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶(C)脫氨基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶保持不變?；蚪MDNA經(jīng)亞硫酸鹽處理后，設(shè)計(jì)BSP引物并擴(kuò)增目的的片段，此時(shí)尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶，最后對(duì)PCR物進(jìn)行測(cè)序就可判斷CpG位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化。
[0014]進(jìn)一步，所述的PGCl-α基因位點(diǎn)+171甲基化檢測(cè)試劑盒采用MSP測(cè)序法對(duì)PGCl-a基因位點(diǎn)+171甲基化進(jìn)行檢測(cè)。所述的試劑盒包括一對(duì)甲基化檢測(cè)引物和一對(duì)非甲基化檢測(cè)引物。進(jìn)一步，所述甲基化檢測(cè)引物采用序列表SEQ ID N04和SEQ ID N05 ;所述的非甲基化檢測(cè)引物采用序列表SEQ ID N06和SEQ ID N07。所述的甲基化檢測(cè)試劑盒還包括全甲基化基因組DNA陽(yáng)性對(duì)照、非甲基化基因組DNA陰性對(duì)照以及PCR擴(kuò)增體系所需的其他常用試劑，如dNTP、DNA聚合酶、緩沖液等。
[0015]所述甲基化特異PCR基本原理是指亞硫酸氫鹽可以氧化去除基因組DNA中胞嘧啶的氨基，在此反應(yīng)中除m5C外其余胞嘧啶均可被轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?。然后將這些靶序列用特異引物進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)擴(kuò)增的DNA，所有尿嘧啶均轉(zhuǎn)化為可檢測(cè)的胸腺嘧啶，只有m5C以胞嘧啶形式被擴(kuò)增。這種方法是目前所使用的在給定基因組靶序列中分析m5C最常用的方法。可以檢測(cè)到每個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化情況?；诖嗽?，發(fā)展出亞硫酸氫鹽去氨基反應(yīng)后，結(jié)合PCR擴(kuò)增的快速方法來(lái)檢測(cè)m5C，稱(chēng)為甲基化特異PCR，MSP)，這種MSP方法運(yùn)用，特別設(shè)計(jì)的針對(duì)甲基化的和非甲基化序列的引物，從而得到特異擴(kuò)增的甲基化或非甲基化靶序列。目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到CpG島甲基化檢測(cè)。
[0016]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供PGCl- α基因位點(diǎn)+171在制備一種DR代謝記憶診斷試劑中的應(yīng)用。
[0017]進(jìn)一步，所述的診斷試劑通過(guò)檢測(cè)PGCl-α基因位點(diǎn)+171是否發(fā)生甲基化來(lái)確定被檢測(cè)對(duì)象是否有DR代謝記憶。
[0018]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):
[0019]本發(fā)明制備的PGCl-a基因位點(diǎn)+171甲基化檢測(cè)試劑，可以定性或定量的檢測(cè)被測(cè)試對(duì)象PGCl-α基因位點(diǎn)+171是否發(fā)生了甲基化及甲基化程度，從而預(yù)測(cè)被測(cè)試對(duì)象是否有DR代謝記憶及患病風(fēng)險(xiǎn)，能夠做出早期、快速的診斷，給臨床實(shí)踐以指導(dǎo)作用。利用本發(fā)明引物、反應(yīng)體系及其條件檢測(cè)PGCl-a基因DNA甲基化其檢測(cè)靈敏度高，可達(dá)5% ;操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好。本發(fā)明為DR記憶代謝的早期診斷及防治提供了有力的技術(shù)支持，具有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020]圖1.各組HRMECs細(xì)胞活力；
[0021]圖2.高糖對(duì)HRMEC中S0D2轉(zhuǎn)錄水平的影響；
[0022]圖3.高糖對(duì)HRMEC中PGCl-a轉(zhuǎn)錄水平的影響；
[0023]圖4.第I天時(shí)各組細(xì)胞S0D2和PGCl-a蛋白表達(dá)量灰度圖；
[0024]圖5.第7天時(shí)各組細(xì)胞S0D2和PGCl-a蛋白表達(dá)量灰度圖；
[0025]圖6.BSP-PCR產(chǎn)物鑒定圖。
圖7.PPARGC1A基因啟動(dòng)子區(qū)待測(cè)CpG位點(diǎn)示意圖及編號(hào)

【具體實(shí)施方式】
[0026]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解:在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照廠(chǎng)商所建議的條件實(shí)施檢測(cè)。
[0027]實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)分組
[0028]實(shí)驗(yàn)材料與試劑:
[0029]正常人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Humanretinal microvascular endothelialcells, HRMECs, cAP-001OTM)，美國(guó) Ang1-Proteomie 公司；內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(ENDO-Basal medium), ScienCell ;胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS) ,ScienCell ;內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Endothelial cell growth supplement, ECGS), ScienCell ;青霉素-鏈霉素雙抗(Penicillin-Streptomycin), ScienCell ;牛血衆(zhòng)纖維粘連蛋白(Fibronectin, FN),ScienCell ;0.25%膜蛋白酶(Trypsin),Poputech ;D_ 葡萄糖(D-Glucose), Sigma ;D_ 甘露醇(D-Mannitol), Sigma。
[0030]將HRMECs根據(jù)干預(yù)處理因素分為5組，具體分組及處理方法見(jiàn)表1。
[0031]表1.實(shí)驗(yàn)分組及處理
[0032]

【權(quán)利要求】
1.一種PGCl-α基因DNA甲基化檢測(cè)試劑，其特征在于，所述的甲基化檢測(cè)試劑是針對(duì)PGCl-α基因位點(diǎn)+171的甲基化檢測(cè)試劑，所述PGCl-α基因位點(diǎn)+171位于SEQ ID NOl第459個(gè)堿基處。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基化檢測(cè)試劑，其特征在于，所述甲基化檢測(cè)試劑包括DNA亞硫酸氫鹽修飾試劑盒和PGCl- α基因甲基化檢測(cè)試劑盒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基化檢測(cè)試劑，其特征在于，所述甲基化檢測(cè)試劑包括采用下列方法中任意一種或幾種的組合對(duì)PGCl-α基因位點(diǎn)+171的甲基化情況進(jìn)行檢測(cè)所需的試劑:甲基化敏感的限制性?xún)?nèi)切酶方法、NaHSO3法、芯片技術(shù)方法；所述NaHSO3法包括BSP測(cè)序法、聯(lián)合NaHSO3限制性分析法、甲基化特異性PCR、熒光定量法；所述芯片技術(shù)方法包括甲基化高密度芯片、差異甲基化雜交、甲基化特異性寡核苷酸芯片。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的甲基化檢測(cè)試劑，其特征在于，所述甲基化檢測(cè)試劑盒采用BSP測(cè)序法對(duì)PGCl-α基因位點(diǎn)+171甲基化進(jìn)行檢測(cè)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或4任意一項(xiàng)所述的甲基化檢測(cè)試劑，其特征在于，所述的甲基化檢測(cè)試劑盒包括一對(duì)BSP檢測(cè)引物，所述檢測(cè)引物序列為SEQ ID Ν02和SEQ ID Ν03所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的甲基化檢測(cè)試劑，其特征在于，所述甲基化檢測(cè)試劑盒采用MSP測(cè)序法對(duì)PGCl-α基因位點(diǎn)+171甲基化進(jìn)行檢測(cè)。
7.根據(jù)權(quán)利要求2或6任意一項(xiàng)所述的甲基化檢測(cè)試劑，其特征在于，所述的甲基化檢測(cè)試劑盒包括一對(duì)甲基化檢測(cè)引物和一對(duì)非甲基化檢測(cè)引物，所述甲基化檢測(cè)引物序列為SEQ ID Ν04和SEQ ID Ν 05所示，所述非甲基化檢測(cè)引物序列為SEQ ID Ν06和SEQ ID Ν07所示。
8.PGCl-α基因位點(diǎn)+171在制備一種診斷試劑中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的診斷試劑通過(guò)檢測(cè)PGCl-α基因位點(diǎn)+171發(fā)生甲基化程度來(lái)確定被檢測(cè)對(duì)象是否有DR代謝記憶。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9任意一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，采用權(quán)利要求1-7任意一項(xiàng)所述的檢測(cè)試劑檢測(cè)PGCl-α基因位點(diǎn)+171甲基化程度。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104178565SQ201410334876
【公開(kāi)日】2014年12月3日 申請(qǐng)日期:2014年7月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月15日
【發(fā)明者】張古沐陽(yáng), 陳有信, 馬楠, 田蓉, 張辰茜, 張夢(mèng)雨 申請(qǐng)人:陳有信