肝硬化微生物標志物及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了肝硬化微生物標志物及應用。微生物標志物，選自肝硬化患者組中富集的一種微生物VeillonellaatypicaACS-134-V-Col7a或健康組富集的兩種微生物BacteroidesuniformisATCC8492、Clostridiales中的一種或多種。治療肝硬化的藥物，所述藥物促進或者增加所述的選自健康組富集兩種微生物BacteroidesuniformisATCC8492、Clostridiales中的一種或兩種，和/或抑制或清除所述的選自肝硬化患者組中富集的微生物VeillonellaatypicaACS-134-V-Col7a。針對腸道菌群中的微生物標志物的相對豐度進行檢測，通過所得到的相對豐度值與預定的cutoff值進行比較。有益微生物組合或者功能性食品，含有選自所述的健康組富集的兩種微生物BacteroidesuniformisATCC8492、Clostridiales中的一種或兩種。檢測肝硬化、監(jiān)測治療進程，或者生產(chǎn)、篩選藥物的試劑盒，用于檢測所述的微生物標志物。
【專利說明】肝硬化微生物標志物及應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程和生物醫(yī)藥領域，具體涉及肝硬化的微生物標志物及其應 用。

【背景技術】
[0002] 肝硬化（Liver cirrhosis)是臨床常見的慢性進行性肝病，由一種或多種病因長 期或反復作用形成的彌漫性肝損害。肝硬化是許多肝臟疾病的晚期病變，是由病毒性肝炎、 酒精中毒、營養(yǎng)障礙、膽汁淤積、血吸蟲病、循環(huán)障礙等各種原因所致，其特點是肝細胞變性 和壞死。早期肝硬化通過及時防治可以逆轉(zhuǎn)或不再進展，而晚期將不可逆轉(zhuǎn)，嚴重影響患者 的生活質(zhì)量，甚至危及生命。
[0003] 在中國最常見的病因是病毒性肝炎，主要是乙型病毒性肝炎，其次為丙型肝炎。而 自發(fā)性腹膜炎、肝腹水、肝腎綜合征、肝性腦病、食道靜脈曲張、出血、原發(fā)性肝癌等這些肝 硬化并發(fā)癥的危害也是有目共睹的。面對現(xiàn)代如此多的治療手段，卻有很大一部分肝硬化 患者依舊痛苦不堪，每日仍遭受著肉體上的折磨、心理上的恐懼以及精神上的摧殘。
[0004] 肝硬化患者由于門脈高壓，肝臟功能障礙致膽汁分泌異常，解毒能力下降，宿主 抵抗力降低等因素，導致腸道屏蔽功能破壞，微生物環(huán)境發(fā)生改變，腸道菌群失調(diào)。然而， 與肝硬化進程相關的腸道微生物的系統(tǒng)發(fā)育及功能成分的變化還不清楚。盡管有些研究 (Garcia et al2004，Wiest et al2012, Bass et al2010)表明腸道微生物的改變在末期肝 硬化并發(fā)癥中起重要作用（如自發(fā)細菌腹膜炎及肝性腦?。?，以及誘導早期肝臟疾病及促 進肝損傷作用（如酒精性肝病及非酒精性脂肪肝?。?，腸道菌群與人肝臟病理之間的明確 關聯(lián)仍未知。有研究（Yi JH et all999，Paik YH et al2003)表明可能是由于患者腸道細 菌過度繁殖并產(chǎn)生內(nèi)毒素，抑制腸上皮細胞蛋白質(zhì)合成，小腸微絨毛出現(xiàn)形態(tài)學的改變， 腸細胞質(zhì)膜異常，細胞支架組織結構發(fā)生改變，腸刷狀緣載體位置或細胞骨架上載體錨定 點改變，導致氨基酸和碳水化合物在通過空腸刷狀緣薄膜的運輸過程缺陷，然而其具體機 制有待于進一步的研究。
[0005] 肝硬化及酒精性肝病患者通過16S rRNA測序研究揭示了一個腸道微生物中的類 似實質(zhì)性的改變（Chen Y et al2011，Yan A W. et al2011)。腸道微生物中系統(tǒng)發(fā)育機制怎 樣發(fā)生改變尚不清晰。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明旨在提供更多肝硬化患者腸道菌群修飾的知識，提供有針對性的微生物標 志物，為早期發(fā)現(xiàn)疾病提供一種非侵入性方法。合理有效地應用微生物標志物，扶持腸道 有益菌（如雙歧桿菌）的生長，抑制腸道潛在致病菌（如腸桿菌科細菌）等，可以阻止腸 道屏障的缺損，改善并恢復腸道微生態(tài)結構，對于降低血內(nèi)毒素水平，減輕肝硬化的臨床 癥狀具有重要意義。
[0007] 本發(fā)明的目的是提供肝硬化微生物標志物及應用。
[0008] -種微生物標志物，選自肝硬化患者組中富集的微生物Veillonella atypica ACS-134-V_Col7a 或健康組富集的兩種微生物 Bacteroides uniformis ATCC8492、 Clostridiales中的一種或多種。富集是指通過失蹤基因找到顯著差異基因，并且同源性大 于95%的基因進行的聚類。
[0009] 所述的微生物標志物，同時具有選自肝硬化患者組中富集的微生物，以及選自健 康組富集的兩種微生物中的一種或兩種。
[0010] 治療肝硬化的藥物，所述藥物促進或者增加所述的選自健康組富集兩種微生物 Bacteroides uniformis ATCC8492、Clostridiales 中的一種或兩種，和 / 或抑制或清除所 述的選自肝硬化患者組中富集的微生物Veillonella atypica ACS-134-V_Col7a。
[0011] 生產(chǎn)或篩選藥物的方法，所述藥物促進或者增加所述的選自健康組富集兩種微生 物 Bacteroides uniformis ATCC8492、Clostridiales 中的一種或兩種，和 / 或抑制或清除 所述的選自肝硬化患者組中富集的微生物Veillonella atypica ACS-134-V-Col7a。
[0012] 所述的藥物治療或干預前，檢測對象腸道菌群中是否富集有所述的微生物標志 物。
[0013] 所述的檢測步驟包括：
[0014] a、從對象糞便中提取DNA樣本；
[0015] b、針對DNA樣本構建測序文庫；
[0016] c、對測序文庫進行高通量測序，獲得測序結果；
[0017] d、根據(jù)測序結果，確定所述對象的腸道菌群中是否存在所述的微生物標志物。
[0018] 所述的步驟d中進一步包括：針對腸道菌群中的微生物標志物的相對豐度進行檢 測，通過所得到的相對豐度值與預定的cutoff值進行比較。
[0019] 步驟c中，根據(jù)測序結果得到基因聚類方法，提出一種宏基因物種（MGS)的方法。
[0020] 有益微生物組合或者功能性食品，含有選自所述的健康組富集的兩種微生物 Bacteroides uniformis ATCC8492、Clostridiales 中的一種或兩種。
[0021] 檢測肝硬化、監(jiān)測治療進程，或者生產(chǎn)、篩選藥物的試劑盒，用于檢測所述的微生 物標志物。
[0022] 本發(fā)明的有益效果：提供了診斷或治療肝硬化患者，或者易感肝硬化人群的微生 物標志物，可以有效監(jiān)測肝硬化的易感人群（包括家族遺傳和外來因素引起）或者發(fā)現(xiàn)早 期患者，以及監(jiān)控肝硬化的治療效果；將該微生物標志物用于治療肝硬化的藥物，或者生產(chǎn) 或篩選治療肝硬化的藥物方法；提供了利用微生物標志物的有益微生物組合或者功能性食 品；提供了利用微生物標志物的試劑盒等。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1為實驗分析流程示意圖；
[0024] 圖2a、圖2b為宏基因組物種分類學示意圖；
[0025] 2a中中國肝硬化患者及健康人群富集的MGS。一個MGS中的基因，如果通過b 1 astN 與已知的基因組數(shù)據(jù)庫對比后，若對比上兩條序列的覆蓋度>90%，覆蓋部分的相似度 >95%，那么就把這個就把這個MGS分類給所比對上的基因組。未達到閥值的MGS，歸類到最 低分類水平，即至少80%的基因與最佳BlastP分類一致；本標準適用于所有更高水平的分 類。
[0026] 2b中58個樣本的分類歸類與丹麥人腸道基因富集相關聯(lián)。

【具體實施方式】
[0027] 下面將結合附圖和實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人 員將理解，下列附圖和實施例僅用于說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的范圍的限定。根據(jù)附圖 和優(yōu)選實施方案的下列詳細描述，本發(fā)明的各種目的和有利方面對于本領域技術人員來說 將變得顯然。在本發(fā)明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學和技術名詞具有本領域技 術人員所通常理解的含義。并且，本文中所使用的各種實驗室操作步驟均為相應領域內(nèi)廣 泛使用的常規(guī)步驟。
[0028] 實施例中，我們從98個肝硬化患者、83個健康對照的糞便樣品開展整個腸道菌群 微生物的關聯(lián)分析研究描述糞便微生物群落及功能成分特征。總的來說，我們獲得約860Gb 高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)，構建了肝硬化參照基因集。這個基因集包含269萬個基因，36. 1%是之 前未公布的。定量宏基因組分析顯示在大量的病人及健康對照組中，75, 245個基因呈現(xiàn)顯 著差異（fdr〈0. 0001)。一大部分的基因可以歸類為66個代表細菌物種的基因簇，其中肝硬 化患者組中主要富集的是1個MGS(metagenomic species,表3)，健康組中主要富集的是2 個MGS (表2)。實施例的第一階段為發(fā)現(xiàn)階段：98個肝硬化患者及83個健康對照組的腸道 微生物成分及功能改變階段；第二階段為驗證階段：25個肝硬化患者及31個健康對照組驗 證第一階段結果的準確性。
[0029] 實施例1 :樣本收集和DNA提取
[0030] 肝硬化患者來自杭州浙江大學第一附屬醫(yī)院，匹配健康對照組是志愿者，實驗共 采集了 181例糞便樣品，98個中國肝硬化患者的糞便樣品及83個健康中國人的糞便樣品， 其中每個個體的新鮮糞便樣品分成200mg/份，共5份，立即-80°C冰箱冷凍保存。
[0031] 98個中國肝硬化患者的糞便樣品及83個健康中國人的糞便樣品中提取總DNA。苯 酚三氯甲烷處理提取DNA方法提取DNA。
[0032] 實施例2 :構建文庫及測序
[0033] DNA建庫按儀器制造商（Illumina)的操作指南進行。對文庫進行PE2*100bp測 序。Illumina HiSeq2000(Illumina，San Diego，CA)平臺對 181 個樣品的文庫進行測序。 每個樣本平均產(chǎn)生4. 74Gb (sd. ±2. 04Gb)高質(zhì)量測序結果，總計858Gb測序數(shù)據(jù)量。
[0034] 參照圖1的實驗流程，鑒定肝硬化的相關微生物標志物，其中省略的步驟或者細 節(jié)為本領域技術人員所熟知，幾個重要步驟介紹如下面幾個實施例所述。
[0035] 實施例3 :生物標志物的鑒定
[0036] 3. 1測序數(shù)據(jù)的基本處理
[0037] 獲得第一期的181個樣品的測序數(shù)據(jù)以后，對其進行過濾，質(zhì)控按以下標準進行： a)移除大于3個N堿基的reads ;b)去除低質(zhì)量（Q20)的N50reads ;c)移除超過10個低 質(zhì)量（Q2)的堿基或指定尾部N堿基數(shù)。丟失成對reads的序列被認為是單條reads用于 組裝。
[0038] 3. 2獲得一套肝硬化微生物組基因集
[0039] 宏基因組生物標志物主體是基因和相對應的功能，因此需要對測序序列進行組裝 和基因預測，去冗余，構建非冗余參考基因集。用SOAPdenovo軟件將所有樣品reads組裝成 contigs (組裝片段）。將樣本的未組裝reads合并進行從新（de novo)組裝。終由總reads 數(shù)的61. 68%產(chǎn)生440萬contigs (最小片段長度為500bp)。這些contigs總長11. 1Gb, N50長度范圍為1，673?48, 822bp，平均長度為8, 644bp。
[0040] 為了預測181個樣本的每個樣本微生物基因，我們采用MetaHIT人類腸道基因 組研究中的方法。MetaGene程序從預測到13, 371，697個長度大于100bp的開放閱讀框 (ORFs)。預測的 ORFs 總長為 9, 495, 923, 532bp，占 contigs 總長度的 90. 28%。在 ORFs 中， 1,047,855(54.6% )是完整的基因，869, 808 (45.4% )是不完整的。通過去除多余ORFs來 建立非冗余"LC基因集"，定義為配對后超過95 %與90 %配對的短ORFs -致。最終的非冗 余肝硬化腸道基因集包含2, 668, 468個ORFs，平均長度750bp，42 %的reads可比對到基因 庫。
[0041] 將我們的LC基因集與3個其他腸道微生物基因集對比，MetaHIT，HMP和T2D。比 對時所有基因預測使用相同的標準。MetaHIT庫包含3, 452, 726個基因，HMP含4, 768, 112 個基因，了20含2，148,029個基因。四個基因集的有674，131共有基因。^：、]^七3!111\腿?、 T2D 基因集分別包含 794, 647、1，429, 517、2, 620, 096、623, 570 個 unique 基因。
[0042] 來自LC、T2D、MetaHIT基因庫的基因與非冗余基因集合并，隨后進行分析。不包 含HMP腸道基因集，因為它包含sanger、454或Illuminal6S序列，除了整個宏基因組數(shù)據(jù)， 它由對照組健康人群產(chǎn)生，而非患者。庫含5, 382, 817個基因，其中797, 690個為其他三個 基因庫共有。LC基因集中的基因有63. 9%存在于其他一個或兩個基因集中，37. 1%是獨特 (unique)基因。中國人基因在LC基因集和T2D基因集中存在極大的差異。
[0043] 3. 3生物豐度分析
[0044] S0APalign2. 21 用于匹配針對冗余基因組的 paired-end clean reads，參 數(shù)為-r2-m200 -xl000。Reads與冗余基因組比對，可能被分為兩部分：a)Unique reads (U) :reads只與一個基因組比對；這些基因被定義為unique reads。b)Multiple reads (Μ):如果這些基因組來著同一物種，reads與一個以上的基因組比對；我們將這些 reads定義為unique reads。如果來著不同物種，我們定義為multiple reads。
[0045] 對于物種S，如果豐度為Ab (S)，可能與U特有reads和Μ共享reads相關，評估方 式如下：
[0046] Ab ⑶=Ab ⑶ +Ab (M)
[0047] Ab (U) = U/1
[0048]

【權利要求】
1. 一種微生物標志物，其特征在于，選自微生物Veillonella atypica ACS-134-V_Col7a、Bacteroides uniformis ATCC 8492、Clostridiales 中的一種或多種。
2. 根據(jù)權利要求1所述的微生物標志物，其特征在于，同時具有Veillonella atypica ACS-134-V_Col7a 和選自微生物 Bacteroides uniformis ATCC 8492、Clostridiales 的一 種或兩種。
3. -種治療肝硬化的藥物，其特征在于，所述藥物促進或者增加 Bacteroides uniformis ATCC 8492、Clostridiales中的一種或兩種，和/或抑制或清除微生物 Veillonella atypica ACS-134_V-Col7a〇
4. 一種生產(chǎn)或篩選藥物的方法，其特征在于，所述藥物促進或者增加 Bacteroides uniformis ATCC 8492、Clostridiales中的一種或兩種，和/或抑制或清除微生物 Veillonella atypica ACS-134_V-Col7a〇
5. 根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的藥物治療或干預前，檢測對象腸道 菌群中是否富集有如權利要求1或2中所述的微生物標志物。
6. 根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的檢測步驟包括： a、 從對象糞便中提取DNA樣本； b、 針對DNA樣本構建測序文庫； c、 對測序文庫進行高通量測序，獲得測序結果； d、 根據(jù)測序結果，確定所述對象的腸道菌群中是否存在所述的微生物標志物。
7. 根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于，所述的步驟d中進一步包括：針對腸道 菌群中的微生物標志物的相對豐度進行檢測，通過所得到的相對豐度值與預定的cutoff 值進行比較。
8. 根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于，所述的步驟c中，根據(jù)測序結果得到基因 聚類方法，提出一種宏基因物種（MGS)的方法。
9. 一種有益微生物組合或者功能性食品，其特征在于，含有選自微生物Bacteroides uniformis ATCC 8492、Clostridiales 中的一種或兩種。
10. -種檢測肝硬化、監(jiān)測治療進程，或者生產(chǎn)、篩選藥物的試劑盒，其特征在于，用于 檢測如權利要求1中所述的微生物標志物。
【文檔編號】C12Q1/68GK104195146SQ201410334287
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年7月15日 優(yōu)先權日:2014年7月15日
【發(fā)明者】李蘭娟, 秦楠 申請人:浙江大學