一種基因重組玫煙色棒孢霉菌If01 GM及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基因重組的玫煙色棒孢霉菌If01?GM（Isaria?fumosorosea?If01?GM）。所述菌株以B型煙粉虱TOLL樣受體基因7（TLR7）為目的基因，利用pSilent-1質(zhì)粒構(gòu)建含TLR7基因片斷的正反向載體，通過聚乙二醇（PEG4000）介導(dǎo)轉(zhuǎn)化玫煙色棒孢霉野生菌株原生質(zhì)體，最后通過陽性篩選而獲得所述重組菌株。所述基因重組菌株能夠沉默B型煙粉虱有TLR7基因的轉(zhuǎn)錄，對2齡煙粉虱若蟲的致病力比原始菌株提高50%左右，殺蟲速度快1~2天。所述重組菌株已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2014年5月13日，保藏號CCTCC?NO：M?2014199。
【專利說明】-種基因重組玫煙色棒孢霉菌|f〇1 GM及其應(yīng)用 【技術(shù)領(lǐng)域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明屬于生物農(nóng)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。更具體地，涉及一種基因重組玫煙色棒孢霉菌 IfOl GM及其應(yīng)用。 【背景技術(shù)】
[0002] 煙粉風(fēng)iaAaci Gennadius)是一種世界性的重要農(nóng)林業(yè)害蟲，寄主范圍 廣泛，估計其寄主植物達(dá)200種以上，如葫蘆科、茄科、十字花科蔬菜及棉花、煙草等重要經(jīng) 濟(jì)作物，都是煙粉虱的主要為害對象。另外，煙粉虱能夠傳播100種以上的病毒，如番茄黃 化曲葉病毒等雙生病毒科的病毒，該類病毒對作物生產(chǎn)造成毀滅性影響。目前，煙粉虱對常 用的大部分農(nóng)藥已經(jīng)產(chǎn)生了高水平的抗性，且農(nóng)藥污染嚴(yán)重問題已廣受詬病。生物防治成 為防治、控制該害蟲危害的一種重要手段。
[0003] 玫煙色棒抱霉（/ saria/amsiomsea )原稱玫煙色擬青霉 )，是一種常見的蟲生真菌，利用該菌防治煙粉風(fēng)的技術(shù)已有多項國家發(fā)明 專利申請和研究報告，比如：申請?zhí)枮?00710031511. X的專利公開了一種玫煙色擬青霉 菌菌株（CCTCC Μ2007088)，該菌株對粉虱、蚜蟲等害蟲具有很強(qiáng)的侵染殺蟲效果。申請?zhí)?為201210449949. 0的專利公開了一種玫煙色棒束孢霉菌株（CCTCC Μ 2014199)用于防治 煙粉虱。申請?zhí)枮?01210102631. 5的專利公開了一種利用植物源提取物提高玫煙色擬青 霉對煙粉虱侵染力的方法。申請?zhí)枮?01110131193.0的專利公開了一種玫煙色棒束孢 油懸浮劑及其制備方法和應(yīng)用，申請?zhí)枮?00810220004. 5的專利公開了綠僵菌素與玫煙 色擬青霉真菌混配的殺蟲劑及其制備方法，200810029253. 6公開了玫煙色擬青霉與阿維 菌素的復(fù)配殺蟲劑，200810029252. 1公開了玫煙色擬青霉與高效氯氰菊酯的復(fù)配殺蟲劑， 200810027586. 5公開了玫煙色擬青霉與印楝素的復(fù)配殺蟲劑，200810027585. 0公開了玫 煙色擬青霉與啶蟲脒的復(fù)配殺蟲劑，200710031515. 8公開了玫煙色擬青霉與抗蚜威的復(fù)配 殺蟲劑，200710031513. 9公開了玫煙色擬青霉與吡蟲啉的復(fù)配殺蟲劑，201310635250. 8公 開了玫煙色擬青霉與噻嗪酮的復(fù)配殺蟲劑。但是，目前對玫煙棒束孢霉的研究主要集中在 菌株的分離鑒定、分生孢子劑型加工技術(shù)及其在煙粉虱等害蟲防治應(yīng)用方面。并且，由于玫 煙色棒束孢作為生物農(nóng)藥的有效成分是菌絲和孢子，而多種生態(tài)因子都會對真菌的萌發(fā)、 營養(yǎng)生長、產(chǎn)孢量及毒力產(chǎn)生不同程度的影響，因此常規(guī)的玫煙色棒束孢防治害蟲的效果 易受環(huán)境的影響。
[0004] 基于RNA干擾（RNAi)的基因沉默技術(shù)是當(dāng)前世界科技前沿，RNAi是指外源或內(nèi) 源的雙鏈RNA (dsRNA)特異性地引起基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象，以RNAi特異性剔除或關(guān)閉昆 蟲特定基因是害蟲防治的新策略，為新一代生物農(nóng)藥的創(chuàng)制帶來了契機(jī)。RNAi技術(shù)可通過 以下幾種方式調(diào)控害蟲：（1)通過轉(zhuǎn)基因植物，（2)將作用于昆蟲靶基因的dsRNA或siRNA 直接給藥，（3)通過構(gòu)建工程菌株實現(xiàn)。相關(guān)技術(shù)已有多項國家發(fā)明專利申請和研究報告， 例如：申請?zhí)枮?01310702146. 6的專利公開了一種甜菜夜蛾microRNASex-miR4924基因 及其在害蟲生物防治中的應(yīng)用技術(shù)，201310134472. 1公開了一種表達(dá)小菜蛾精氨酸激酶基 因 dsRNA的質(zhì)粒及應(yīng)用的技術(shù)，201210356675. 0公開了昆蟲β-Ν-乙酰氨基葡萄糖苷酶 基因及其RNAi應(yīng)用技術(shù)，201210167972. 0公開了一種基于RNAi技術(shù)防治害蟲的新方法， 200780002294. X公開了一種作為昆蟲防治劑的dsRNA，200710029102. 6公開了一種飼喂 dsRNA抑制昆蟲基因表達(dá)的方法，200510062131. 3公開了一種鱗翅目害蟲的高毒力核型多 角體病毒構(gòu)建技術(shù)。但是，目前利用RNAi技術(shù)調(diào)控害蟲主要集中在轉(zhuǎn)基因植物和dsRNA制 劑技術(shù)等方面，尚未見有利用RNAi基因沉默技術(shù)的基因改良蟲生真菌菌株研究的報道。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有局限玫煙色棒孢霉在防治煙粉虱等害蟲 中的缺陷和不足，提供一種基因重組改良的、防治效果更好、速度更快的玫煙色棒孢霉菌 株。
[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種基因重組玫煙色棒孢霉菌If〇l GM。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供上述基因重組玫煙色棒孢霉菌IfOl GM的構(gòu)建方法。
[0008] 本發(fā)明再一目的是提供上述基因重組玫煙色棒孢霉菌IfOl GM防治在煙粉虱等害 蟲中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)： 本發(fā)明公開了一種基因重組玫煙色棒抱霉菌IfOl GM (/ saria/'ttmsiamsealfOlGM)， 該菌株于2014年5月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :M 2014199,保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)。
[0010] 所述玫煙色棒孢霉菌IfOl GM攜帶有B型煙粉虱TOLL受體基因 TLR7的正反向核 苷酸片段；該菌株能夠沉默煙粉虱免疫相關(guān)基因，即TOLL受體蛋白基因 TLR7。所述TLR7的 正反向核苷酸片段序列如SEQ ID N0 :1所示。
[〇〇11] 該菌株的形態(tài)學(xué)特征為： 在察氏培養(yǎng)基上：起初菌落規(guī)則圓形，隆起，菌絲白色，背面淡黃色或黃褐色；延長培 養(yǎng)，菌落呈不規(guī)則圓形，形成肉紅色孢子層； 顯微鏡下觀察：菌絲體細(xì)長，無色透明，寬度2. 7(Γ3. 8 μ m，產(chǎn)大量分生孢子，孢子無色 透明，柱狀至橢圓形，長4. 9?6.4 μ m，寬1. 9?2.4 μ m。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種上述基因重組玫煙色棒孢霉菌IfOl GM的構(gòu)建方法，步驟如 下： 51. 構(gòu)建重組質(zhì)粒 511. 提取B型煙粉虱的總RNA，合成第一鏈CDNA ; 512. 以S11的cDNA為模板，利用引物TLR7F和TLR7R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得目的片段； 513. 以S12目的片段為模板，分別利用引物TLR7F-1和TLR7R-1，引物TLR7F-2和 TLR7R-2，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到正向片段和反向片段； 514. 將正向片段XhoI、HindII雙酶切，經(jīng)回收、純化后，連接到XhoI、HindII雙酶切過 的pSilent-Ι質(zhì)粒，得P-Z質(zhì)粒； 515. 將反向片段Kpnl、SphI雙酶切，經(jīng)回收、純化后，連接到Kpnl、SphI雙酶切過的 P_Z質(zhì)粒，得重組P_Z_F質(zhì)粒(正反向沉默載體）； 52. 構(gòu)建重組菌株 521. 獲得玫煙色棒孢霉IfBOl菌株的原生質(zhì)體； 522. 重組P-Z-F質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體，得轉(zhuǎn)化子；優(yōu)選地，轉(zhuǎn)化所用的方法為聚乙二醇 (PEG4000)介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法； 523. 轉(zhuǎn)化子經(jīng)過多次陽性篩選和毒力測試，得到一株能夠穩(wěn)定遺傳且對能夠高效殺滅 煙粉虱的基因重組玫煙色棒孢霉菌If〇l GM; 其中，S12所述目的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示； S12所述引物TLR7F的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，TLR7R的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示； S13所述引物TLR7F-1的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示，TLR7R-1的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 5 所示； S13所述引物TLR7F-2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示，TLR7R-2的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 7 所示。
[0013] 優(yōu)選地，S12或S13所述PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增程序為：94 °C預(yù)變性4 min ; 94 °C變性 1 min，56 °C退火 30 s，72 °C延伸 45 s，30 個循環(huán)；72 °C補(bǔ)平 10 min。
[0014] 本發(fā)明還提供上述基因重組玫煙色棒孢霉菌IfOl GM在防治煙粉虱害蟲中的應(yīng) 用。
[0015] 上述基因重組玫煙色棒孢霉菌IfOl GM在制備防治煙粉虱害蟲的藥劑中的應(yīng)用， 也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0016] 優(yōu)選地，上述煙粉虱為B型煙粉虱。
[〇〇17] 本發(fā)明所述的玫煙色棒孢霉是一種蟲生真菌，能夠從體壁侵入昆蟲血腔，與昆蟲 的免疫系統(tǒng)直接發(fā)生作用。因此，利用蟲生真菌介導(dǎo)RNAi沉默昆蟲免疫相關(guān)基因，將可提 高蟲生真菌對害蟲的防治效果。
[0018] 基于上述思考，本專利發(fā)明人利用pSilent-Ι質(zhì)粒，構(gòu)建B型煙粉虱免疫相關(guān)基 因-TOLL受體蛋白基因 TLR7的RNAi載體，通過聚乙二醇（PEG4000)介導(dǎo)轉(zhuǎn)化玫煙色棒孢霉 IfBOl菌株(該菌株已在申請?zhí)枮?01210449949. 0的專利中公開，并于2012年10月12日 保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC Μ 2012400)，獲得了本發(fā)明的基因改 良的重組玫煙色棒孢霉菌IfOl GM，于2014年5月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心， 保藏編號為CCTCC NO :M 2014199,保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)。所述重組菌株生物學(xué)性 狀穩(wěn)定，對2齡煙粉虱若蟲的致病力比原始菌株的毒力增加50%以上。
[0019] 該重組菌株的形態(tài)學(xué)特征如附圖1所示，具體描述為： 在察氏培養(yǎng)基上：起初菌落規(guī)則圓形，隆起，菌絲白色，背面淡黃色或黃褐色；延長培 養(yǎng)，菌落呈不規(guī)則圓形，形成肉紅色孢子層； 顯微鏡下觀察：菌絲體細(xì)長，無色透明，寬度2. 7(Γ3. 8 μ m，產(chǎn)大量分生孢子，孢子無色 透明，柱狀至橢圓形，長4. 9?6.4 μ m，寬1. 9?2.4 μ m。
[0020] 本發(fā)明具有以下有益效果： 本發(fā)明公開了一種基因重組玫煙色棒孢霉菌IfOl GM，并于2014年5月13日保藏于中 國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :M 2014199,保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)。 該菌株是以B型煙粉虱TOLL受體基因 TLR7為目的基因，利用pSilent-Ι質(zhì)粒構(gòu)建含目的 基因正反向片斷的載體，通過聚乙二醇（PEG4000)介導(dǎo)轉(zhuǎn)化玫煙色棒孢霉野生菌株原生質(zhì) 體，最后通過篩選而獲得。該菌株能夠沉默B型煙粉虱免疫相關(guān)基因，即TOLL受體蛋白基 因 TLR7,從而引起煙粉虱的死亡。且煙粉虱很難對這種方式產(chǎn)生任何的抗性作用。
[0021] 本發(fā)明的重組玫煙色棒孢霉菌If〇l GM具有更高、更快的殺蟲效果，實驗結(jié)果顯 示，當(dāng)重組菌株孢子濃度為5. OX 106個/mL時，第12天對2齡煙粉虱若蟲的累計校正死 亡率為80. 00±5. 29%，野生菌株IfBOl第12天對2齡煙粉虱若蟲的累計校正死亡率為 54. 67± 1. 53%，重組菌株的殺蟲效率比野生菌株高50%左右。并且重組菌株的殺蟲效果更 快，其半致死時間LT5(I比野生菌株少3天以上。
[0022] 本發(fā)明為煙粉虱生物防治提供了新材料，對發(fā)展綠色生態(tài)控制技術(shù)，為農(nóng)林業(yè)的 可持續(xù)發(fā)展有促進(jìn)作用，具有非常好的推廣應(yīng)用價值。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1為重組玫煙色棒孢霉菌IfOl GM的形態(tài)；幼嫩菌落平板的正面（A)、反面（B)， 產(chǎn)孢后平板的正面（C)、反面（D)及菌絲體（E)和分生孢子（F)。
[0024] 圖2為P-Z-F質(zhì)粒的雙酶切驗證電泳圖；Μ泳道為Wide Range DNA Marker ;第1 泳道為P-Z-F質(zhì)粒經(jīng)XhoI、HindIII雙酶切；第2泳道為P-Z-F質(zhì)粒經(jīng)SphI、KpnI雙酶切。 【具體實施方式】
[0025] 以下結(jié)合說明書附圖和具體實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明 做任何形式的限定。本發(fā)明構(gòu)建重組菌株If〇l GM時，用到了分子生物學(xué)和遺傳工程學(xué)等 領(lǐng)域使用的常規(guī)技術(shù)和方法，例如：目的基因片段克隆、原生質(zhì)體制備和轉(zhuǎn)化等，但是本發(fā) 明并不限定于一般性參考文獻(xiàn)中的任何具體方法、實驗方案和試劑，只要能夠達(dá)到本發(fā)明 所記載的效果，任何不違背本發(fā)明的中心思想的改變、組合、替換，均應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范 圍之內(nèi)。
[0026] 除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本【技術(shù)領(lǐng)域】常規(guī)試劑、方法和設(shè) 備，所用試劑和材料均為市購。除非在本文中另作限定，本文所用的全部技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù) 語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域所通常理解的含義相同。
[0027] 實施例1重組質(zhì)粒的構(gòu)建 本發(fā)明所用的目的基因-煙粉虱的TLR7基因從B型煙粉虱轉(zhuǎn)錄組的序列獲得 (Unigene 數(shù)據(jù)庫：Unigene20701_B4592195)，其核苷酸序列如 SEQ ID N0 :10 所示。
[0028] 本發(fā)明將煙粉虱的TLR7基因的部分片段(其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示）轉(zhuǎn) 化到玫煙色棒孢霉菌株中，獲得基因重組玫煙色棒孢霉菌株。具體操作步驟如下： 1、獲得目的片段 (1)本發(fā)明設(shè)計所用目的基因即煙粉虱的TLR7基因的引物TLR7F和TLR7R。
[0029] 所述引物TLR7F的核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示，TLR7R的核苷酸序列如SEQ ID N0. 3 所示。
[0030] (2)用Trizol法提取B型煙粉虱的總RNA，合成第一鏈cDNA ;以cDNA為模板，利 用引物TLR7F和TLR7R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得目的片段；擴(kuò)增程序為：94 °C預(yù)變性4 min ; 94 °C變性 1 min，56 °C退火 30 s，72 °C延伸 45 s，30 個循環(huán)；72 °C補(bǔ)平 10 min。
[0031] 所得到的目的片段的大小為549 bp，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0032] 2、構(gòu)建重組質(zhì)粒 (1)分析目的片段和pSilent-1載體上酶切位點(diǎn)，選擇XhoI、HindIII、KpnI、SphI四種 內(nèi)切酶，在TLR7F/TLR7R上分別加上4種內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，得到引物TLR7F-1 和 TLR7R-1，引物 TLR7F-2 和 TLR7R-2。
[0033] 所述引物TLR7F-1的核苷酸序列如SEQ ID N0. 4所示，TLR7R-1的核苷酸序列如 SEQ ID N0. 5 所示； 所述引物TLR7F-2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示，TLR7R-2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7 所示。
[0034] (2)以SEQ ID N0.1所示目的片段為模板，分別利用引物TLR7F-1和TLR7R-1，引 物TLR7F-2和TLR7R-2,進(jìn)行PCR擴(kuò)增(擴(kuò)增條件同上)，得到正向片段和反向片段。
[0035] (3)將正向片段Xhol、Hindll雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化回 收后，用T4連接酶4°C條件下連接過夜，連接到Xh 〇I、HindII雙酶切過的pSilent-Ι質(zhì)粒。
[0036] 然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH-5a大腸桿菌中，挑斑，搖菌，提取P-Z質(zhì)粒，基因測序， PCR驗證連接是否正確。驗證正確的菌進(jìn)行搖菌提質(zhì)粒，得到P-Z質(zhì)粒。
[0037] (4)將反向片段Kpnl、SphI雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化回收 后，用T4連接酶4°C條件下連接過夜，連接到KpnI、SphI雙酶切過的P-Z質(zhì)粒。
[0038] 然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH-5 a大腸桿菌中，挑斑，搖菌，提取P-Z-F質(zhì)粒，基因測序， PCR驗證連接是否正確。驗證正確的菌進(jìn)行搖菌提質(zhì)粒，得到重組P-Z-F質(zhì)粒（即正反向沉 默載體)。
[0039] 另外，再用XhoI、HindII和KpnI、SphI分別雙酶切P-Z-F質(zhì)粒，凝膠電泳驗證重組 質(zhì)粒是否構(gòu)建成功，電泳結(jié)果如附圖2所示。
[0040] 實施例2重組菌株的構(gòu)建和篩選 1、獲得玫煙色棒孢霉IfBOl菌株的原生質(zhì)體 所用玫煙色棒孢霉IfBOl菌株已在申請?zhí)枮?01210449949. 0的專利中公開。
[0041] 獲取原生質(zhì)體的步驟如下： (1)將玫煙色棒孢霉IfBOl菌株的分生孢子用0. 05%(v/v)吐溫-80溶液配制成濃度為 108個/mL左右的孢子懸浮液。
[0042] (2)取1 mL懸浮液接種于100 mL馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PD)中，于25 °C，150 rpm振蕩培養(yǎng)30 h。
[0043] (3)取菌液于離心管中，5, 000 rpm離心10 min,棄上清，用0· 7 mol/L的NaCl溶 液清洗兩遍，再離心得到菌絲體。
[0044] (4)加入1% (w/v)蝸牛酶和2% (w/v)纖維素酶的混合酶解液，酶解菌絲體，再用 4層滅菌的擦鏡紙過濾酶解液，將濾液4000 rpm離心5 min，棄上清，0.7 mol/L的NaCl溶 液沖洗2次，離心得到IfBOl菌株的原生質(zhì)體。
[0045] (5)再用 10 mL STC 溶液（1. 2 mol/L 山梨醇，10 mmol/L Tris-HCl pH7. 5,50 mmol/L CaCl2，高壓滅菌）洗滌1次，在離心管中加入1 mL STC溶液，懸浮原生質(zhì)體。
[0046] 所述馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PD)的配方為：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水 1，000 mL〇
[0047] 2、重組P-Z-F質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體 轉(zhuǎn)化步驟如下： (1)在上述原生質(zhì)體懸浮液中加入10 μ g重組P-Z-F質(zhì)粒，輕輕混合均勻；4°C冰箱內(nèi) 放置1 h。
[0048] (2)然后逐滴加入 200 μLPTC溶液（含40%(w/v)PEG4000，10mmol/LTris-HCl pH 7. 5,50 mmol/L CaCl2,0. 45 μπι細(xì)菌過濾器過濾滅菌)，室溫放置20 min;再逐滴加入 800 μ L PTC溶液，放入搖床中輕搖20 min;在離心管內(nèi)加入5 mL液體再生培養(yǎng)基，置于 25°C，150 rpm條件下振蕩培養(yǎng)過夜。
[0049] (3)將過夜的培養(yǎng)液離心，棄部分上清，并將培養(yǎng)液中原生質(zhì)體濃度稀釋至104個 /mL ;取200 μ L培養(yǎng)液(含原生質(zhì)體濃度1 X 104個/mL)涂于含有200 μ g/mL潮霉素 B的 原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基平板上，25°C條件下培養(yǎng)30 h。
[0050] (4)記錄平板上菌斑數(shù)，并計算原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化率。培養(yǎng)基上生長的菌落即為轉(zhuǎn)化 子。
[0051] 所述原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基的配方為：蛋白胨5 g，NaN03 3 g, K2HP04 1 g, MgS04.7H20 0.5 g，KC1 0.5 g，F(xiàn)eS04.7H20 0.01 g，蔗糖 30 g，瓊脂 15?20 g，水 1,000 mL;0.7 mol/L NaCl〇
[0052] 3、轉(zhuǎn)化子篩選 (1)在長勢良好的重組菌株平板上用打孔器取菌碟若干，加入到含有青霉素的ro培養(yǎng) 基中，25 °C，150 rpm條件下培養(yǎng)2天左右。
[0053] (2)提取菌株DNA，用引物TLR7F和TLR7R，以及引物ch-BF和ch-BR進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 經(jīng)基因測序、凝膠電泳，選擇含有目的片段和潮霉素 B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因片段的菌株，即為初 選菌株。
[0054] 所述引物ch-BF的核苷酸序列如SEQ ID N0. 8所示，和ch-BR的核苷酸序列如SEQ ID N0. 9 所示。
[0055] (3)將初步篩選的重組菌株在含200 μ g/mL潮霉素 B的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (PDA培養(yǎng)基）上轉(zhuǎn)接3次，再在不含潮霉素 B的PDA上轉(zhuǎn)接3次，再轉(zhuǎn)接到含潮霉素 B的 PDA上，按照初步篩選的方法和條件提取DNA、PCR擴(kuò)增和測序，瓊脂糖凝膠電泳后依舊含有 目的條帶且測序結(jié)果正確的菌株，即為我們所要的最終重組菌株。
[0056] (4)經(jīng)過多次陽性篩選和毒力測試，得到一株能夠穩(wěn)定遺傳且對能夠高效殺滅煙 粉虱的基因重組玫煙色棒孢霉菌If〇l GM;該菌株已于2014年5月13日保藏于中國典型 培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :M 2014199,保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)。該菌 株攜帶有B型煙粉虱TOLL受體基因 TLR7的正反向核苷酸片斷；該菌株能夠沉默煙粉虱免 疫相關(guān)基因，即TOLL受體蛋白基因 TLR7。
[0057] 該菌株的形態(tài)學(xué)特征為： 在察氏培養(yǎng)基上：起初菌落規(guī)則圓形，隆起，菌絲白色，背面淡黃色或黃褐色；延長培 養(yǎng)，菌落呈不規(guī)則圓形，形成肉紅色孢子層； 顯微鏡下觀察：菌絲體細(xì)長，無色透明，寬度2. 7(Γ3. 8 μ m，產(chǎn)大量分生孢子，孢子無色 透明，柱狀至橢圓形，長4. 9?6.4 μ m，寬1. 9?2.4 μ m。
[0058] 實施例3重組玫煙色棒孢霉菌IfOl GM的毒力測驗 在室內(nèi)條件下，采用浸漬法將離體的帶有2齡B型煙粉虱若蟲的扶桑葉片(每葉不少于 30頭若蟲)分別在2. OX 107個分生孢子/mL、l. OX 107個分生孢子/mL、5. OX 106個分生孢 子/mL、2. 5Χ 106個分生孢子/mL、l. 25Χ 106個分生孢子/mL濃度梯度的重組玫煙色棒孢 霉菌IfOl GM分生孢子懸浮液中浸漬葉片10 s，晾干后放入培養(yǎng)皿(底部墊濕濾紙，葉柄基 部纏繞濕棉球）中，然后將培養(yǎng)皿放入光照14 :10 (L :D)，溫度25±1°C下培養(yǎng)，實驗重復(fù)3 次。
[0059] 每隔2天觀察記錄若蟲死亡情況，計算死亡率與半致死濃度（LC5(I)及半致死時間 (LT 50)。
[0060] 結(jié)果如表1、表2、表3所示。結(jié)果顯示，孢子濃度為5. ΟΧΙΟ6個/mL時，重組菌株 第12天對2齡煙粉虱若蟲的累計校正死亡率為80. 00%，野生菌株IfBOl第12天對2齡煙 粉虱若蟲的累計校正死亡率為54. 67%，重組菌株的殺蟲效率比野生菌株高50%左右，并且， 重組菌株的LC5(I值比野生菌株低約50%，LT 5(I值短1~2天，說明重組菌株的殺蟲效果更高更 快。
[0061] 表1不同菌株對2齡B型煙粉虱若蟲的累積校正病死率（％)
【權(quán)利要求】
1. 一種基因重組玫煙色棒抱霉菌IfOl GM (/ saria/amsiomsea IfOl GM)，其特征在 于，該菌株于2014年5月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :M 2014199,保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述基因重組玫煙色棒孢霉菌IfOl GM，其特征在于，該菌株攜帶 有B型煙粉虱TOLL受體基因 TLR7的正反向核苷酸片段，所述TLR7的正反向核苷酸片段序 列如SEQ ID NO :1所示；該菌株能夠沉默煙粉虱免疫相關(guān)基因，即TOLL受體蛋白基因 TLR7。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述基因重組玫煙色棒孢霉菌IfOl GM，其特征在于，該菌株的形 態(tài)學(xué)特征為： 在察氏培養(yǎng)基上：起初菌落規(guī)則圓形，隆起，菌絲白色，背面淡黃色或黃褐色；延長培 養(yǎng)，菌落呈不規(guī)則圓形，形成肉紅色孢子層； 顯微鏡下觀察：菌絲體細(xì)長，無色透明，寬度2. 7(Γ3. 8 μ m，產(chǎn)大量分生孢子，孢子無色 透明，柱狀至橢圓形，長4. 9?6.4 μ m，寬1. 9?2.4 μ m。
4. 一種權(quán)利要求1所述基因重組玫煙色棒孢霉菌IfOl GM的構(gòu)建方法，其特征在于， 步驟如下：
51. 構(gòu)建重組質(zhì)粒
511. 提取B型煙粉虱的總RNA，合成第一鏈cDNA ;
512. 以S11的cDNA為模板，利用引物TLR7F和TLR7R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得目的片段；
513. 以S12目的片段為模板，分別利用引物TLR7F-1和TLR7R-1，引物TLR7F-2和 TLR7R-2,進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到正向片段和反向片段；
514. 將正向片段XhoI、HindII雙酶切，經(jīng)回收、純化后，連接到XhoI、HindII雙酶切過 的pSilent-Ι質(zhì)粒，得P-Z質(zhì)粒；
515. 將反向片段Kpnl、SphI雙酶切，經(jīng)回收、純化后，連接到Kpnl、SphI雙酶切過的 P_Z質(zhì)粒，得重組P-Z-F質(zhì)粒；
52. 構(gòu)建重組菌株
521. 獲得玫煙色棒孢霉IfBOl菌株的原生質(zhì)體；
522. 重組P-Z-F質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體，得轉(zhuǎn)化子；
523. 轉(zhuǎn)化子經(jīng)過陽性篩選和毒力測試，得到基因重組玫煙色棒孢霉菌IfOl GM; 其中，S12所述目的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示； S12所述引物TLR7F的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，TLR7R的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示； S13所述引物TLR7F-1的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示，TLR7R-1的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 5 所示； S13所述引物TLR7F-2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示，TLR7R-2的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 7 所示。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述構(gòu)建方法，其特征在于，S12或S13所述PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增程序 為：94 °C 預(yù)變性 4 min; 94 °C 變性 1 min，56 °C 退火 30 s，72 °C 延伸 45 s，30 個循環(huán)；72 °C補(bǔ)平 10 min。
6. 權(quán)利要求1所述基因重組玫煙色棒孢霉菌IfOl GM應(yīng)用于防治煙粉虱。
7. 權(quán)利要求1所述基因重組玫煙色棒孢霉菌IfOl GM應(yīng)用于制備防治煙粉虱的藥劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述應(yīng)用，其特征在于，所述煙粉虱為B型煙粉虱。
【文檔編號】C12R1/645GK104109637SQ201410317110
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2014年7月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月4日
【發(fā)明者】胡瓊波, 李霖, 金豐良, 翁群芳 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)