微囊泡在誘導(dǎo)干細(xì)胞巨核分化中的用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了微囊泡在誘導(dǎo)干細(xì)胞巨核分化中的用途、用于誘導(dǎo)干細(xì)胞巨核分化的培養(yǎng)基以及促進(jìn)干細(xì)胞巨核分化的方法。在干細(xì)胞向巨核細(xì)胞培養(yǎng)分化的體系中添加微囊泡，能夠有效提高巨核分化效率和獲得的巨核細(xì)胞或血小板的細(xì)胞活性。
【專利說明】微囊泡在誘導(dǎo)干細(xì)胞巨核分化中的用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微囊泡在誘導(dǎo)干細(xì)胞巨核分化中的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 核輻射，武器傷，大劑量的化療，異體組織器官移植，免疫系統(tǒng)和血液系統(tǒng)的一些 疾病都會(huì)導(dǎo)致血小板數(shù)量的減少或者功能不良，引起內(nèi)出血而危及生命。臨床上多通過反 復(fù)輸注血小板，預(yù)防病人內(nèi)出血的發(fā)生。因此，血小板的需求量巨大。目前常采用的機(jī)采血 小板卻存在著供者舒適度低，供應(yīng)量少，保存時(shí)間短，會(huì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)及病原體污染等不利 因素，要解決血液來源匱乏的問題，開發(fā)新的血源變得尤為迫切，其中干細(xì)胞研究為體外制 備血小板提供了新的研究方向，包括胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC)及臍帶、骨髓、夕卜 周血來源的造血干祖細(xì)胞都可以作為種子細(xì)胞，通過大量誘導(dǎo)擴(kuò)增生成可用于移植的巨核 祖細(xì)胞、巨核細(xì)胞或者血小板。經(jīng)研究證實(shí)，在體外擴(kuò)增的造血干細(xì)胞，誘導(dǎo)其分化為巨核 細(xì)胞和血小板，重新回輸入體內(nèi)，也可以發(fā)揮相應(yīng)的凝血功能。健康新生兒的臍帶血因具有 從臨床較易獲得、對(duì)捐獻(xiàn)者無傷害且無倫理學(xué)爭議等獨(dú)特優(yōu)勢，已經(jīng)成為干細(xì)胞移植領(lǐng)域 中，繼骨髓、動(dòng)員外周血之后的又一種新的造血干/祖細(xì)胞來源，成功用于臨床上再生障礙 性貧血、白血病、急性輻射損傷等病人的造血重建。
[0003] 雖然誘導(dǎo)干細(xì)胞獲得巨核細(xì)胞和成熟血小板的研究不斷見諸報(bào)導(dǎo)，但是目前的干 細(xì)胞的巨核分化效率和細(xì)胞活性低，產(chǎn)生的有功能的細(xì)胞和血小板的生成量少，不能滿足 臨床應(yīng)用需要。因而，目前的誘導(dǎo)干細(xì)胞巨核分化的方法仍有待改進(jìn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的 在于提出一種巨核分化效率高、細(xì)胞活性好的誘導(dǎo)干細(xì)胞巨核分化的方法。
[0005] 需要說明的是，本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：
[0006] 生理?xiàng)l件下，造血干細(xì)胞向紅系定向分化的過程經(jīng)歷了如下過程： pluripotent stem cell (多能干細(xì)胞）一committed stem cell (定向干細(xì) 胞）-CFU-GEMM(colony forming unit-granulocyte, erythrocyte, monocyte and megakaryocyte :粒細(xì)胞，紅細(xì)胞，單核細(xì)胞及巨核細(xì)胞集落形成單位；多能造血祖細(xì) 胞）一BFU_MK(burst forming unit-megakaryocyte:爆式巨核細(xì)胞集落形成單位；前 巨核細(xì)胞系祖細(xì)胞）一CFU_MK(colony forming unit-megakaryocyte:巨核細(xì)胞集落 形成單位；巨核細(xì)胞系祖細(xì)胞）一promegakaryoblast(前原始巨核細(xì)胞；前成巨核細(xì) 胞）一megakaryoblast (原始巨核細(xì)胞；成巨核細(xì)胞）一promegakaryocyte (幼稚巨核細(xì) 胞）一megakaryocyte (巨核細(xì)胞）一platelet (血小板）。
[0007] 微囊泡是由細(xì)胞膜的出芽形成的一種磷脂膜結(jié)構(gòu)包裹的顆粒，直徑在 100-1000nm，多在200nm左右。血液中70% -90%的微囊泡來自于激活的血小板，因?yàn)樵谀?出芽生成的同時(shí)微囊泡還包裹了一些胞質(zhì)成分，所以其富含細(xì)胞因子，趨化因子，酶類，生 長因子等各種發(fā)揮不同生物學(xué)功能的物質(zhì)。微囊泡通過受體配體連接作用，捕獲靶細(xì)胞，從 而形成特殊的脂質(zhì)復(fù)合物，進(jìn)而把生物活性物質(zhì)傳遞到靶細(xì)胞中，更重要的是，微囊泡是在 循環(huán)血中運(yùn)送獨(dú)特MicroRNA的主要載體形式，在細(xì)胞間信息傳遞中發(fā)揮了重要作用。而且 血小板產(chǎn)生的微囊泡參與了血栓形成、炎癥反應(yīng)和血管再生等過程，在促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和平 滑肌細(xì)胞生長、促進(jìn)造血干祖細(xì)胞增殖，存活，粘附，趨化性和移植的存活率等方面有著重 要作用。
[0008] 發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，特發(fā)性血小板減少性紫癜，陣發(fā)性血紅蛋白尿，肝素誘導(dǎo)的血小 板減少這些特發(fā)的或者某些藥物引起的由自身免疫系統(tǒng)對(duì)血小板進(jìn)行破壞的疾病中，外周 血中由血小板產(chǎn)生的微囊泡的數(shù)量增加，骨髓也呈現(xiàn)出巨核系的增生象，因而，發(fā)明人推測 這兩者之間可能會(huì)存在著某種聯(lián)系。進(jìn)而，發(fā)明人在無血清無基質(zhì)細(xì)胞的、造血干細(xì)胞向巨 核細(xì)胞的培養(yǎng)分化的體系中添加由血小板生成的微囊泡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于對(duì)照，添加微囊 泡后造血干細(xì)胞的擴(kuò)增能力和向巨核細(xì)胞分化的能力均顯著增加，從而獲得了數(shù)量更多成 熟度更高的巨核細(xì)胞。因而，發(fā)明人認(rèn)為，微囊泡能夠顯著增加造血干細(xì)胞或其他干細(xì)胞的 巨核分化能力。
[0009] 為此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了微囊泡在誘導(dǎo)干細(xì)胞巨核分化中的 用途。由此，在干細(xì)胞向巨核細(xì)胞培養(yǎng)分化的體系（如誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基）中添加微囊泡，能 夠有效提高巨核分化效率和獲得的巨核細(xì)胞或血小板的細(xì)胞活性。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述微囊泡由血小板形成。由此，干細(xì)胞的巨核分化效率 高，獲得的巨核細(xì)胞或血小板活性好。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述干細(xì)胞為造血干細(xì)胞，優(yōu)選臍帶血單個(gè)核細(xì)胞。即微囊 泡對(duì)造血干細(xì)胞尤其是臍帶血單個(gè)核細(xì)胞的巨核分化促進(jìn)效果尤其顯著。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種用于誘導(dǎo)干細(xì)胞巨核分化的培養(yǎng) 基。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該培養(yǎng)基包含微囊泡。由此，利用本發(fā)明的培養(yǎng)基能夠高效地誘 導(dǎo)干細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化，從而能夠獲得大量細(xì)胞活性好的巨核細(xì)胞或血小板。
[0013] 另外，根據(jù)本發(fā)明上述實(shí)施例的用于誘導(dǎo)干細(xì)胞巨核分化的培養(yǎng)基還可以具有如 下附加的技術(shù)特征：
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述微囊泡由血小板形成。由此，利用本發(fā)明的用于誘導(dǎo)干 細(xì)胞巨核分化的培養(yǎng)基誘導(dǎo)干細(xì)胞巨核分化時(shí)，干細(xì)胞的巨核分化效率高，獲得的巨核細(xì) 胞或血小板活性好。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述干細(xì)胞為造血干細(xì)胞，優(yōu)選臍帶血單個(gè)核細(xì)胞。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述培養(yǎng)基中包含1-25X 105個(gè)/ml微囊泡。由此，干細(xì)胞 的巨核分化效率高，獲得的巨核細(xì)胞或血小板活性好。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述培養(yǎng)基為添加了 100ng/mL rhTP0、100ng/mL SCF、 20ng/mL IL_3、50ng/mL IL-6 和 20ng/mL IL-11 的 Stemspan 培養(yǎng)基。由此，干細(xì)胞的巨核 分化效率高，獲得的巨核細(xì)胞或血小板活性好。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種促進(jìn)干細(xì)胞巨核分化的方法。根據(jù) 本發(fā)明的實(shí)施例，該方法利用添加微囊泡的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)所述干細(xì)胞。發(fā)明人驚奇 地發(fā)現(xiàn)，利用該方法能夠有效地促進(jìn)干細(xì)胞巨核分化，提高干細(xì)胞的巨核分化效率和獲得 的巨核細(xì)胞或血小板的細(xì)胞活性。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中添加有1-25 X 105個(gè)/ml微囊泡。由 此，利用本發(fā)明的方法誘導(dǎo)干細(xì)胞巨核分化時(shí)，能夠顯著提高干細(xì)胞的巨核分化效率和獲 得的巨核細(xì)胞或血小板活性。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述添加微囊泡的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為前面所述的本發(fā)明的 用于誘導(dǎo)干細(xì)胞巨核分化的培養(yǎng)基。由此，能夠顯著提高干細(xì)胞的巨核分化效率和獲得的 巨核細(xì)胞或血小板的細(xì)胞活性。進(jìn)而，根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施例，于37攝氏度，5% C02條 件下，利用添加微囊泡的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)所述干細(xì)胞7-15天，其中，隔天半量換液，并 使所述誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中各成分濃度不變。由此，干細(xì)胞的巨核分化效率高，獲得的巨核細(xì) 胞或血小板活性好。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述微囊泡由血小板形成。由此，干細(xì)胞的巨核分化效率 高，獲得的巨核細(xì)胞或血小板活性好。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述干細(xì)胞為造血干細(xì)胞，優(yōu)選臍帶血單個(gè)核細(xì)胞。
[0023] 此外，需要說明的是，本發(fā)明通過添加血小板提取的微囊泡，解決了巨核細(xì)胞在無 血清無滋養(yǎng)層細(xì)胞的條件下，體外分化效率低，增殖能力差，成熟度不高的問題。
[0024] 本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變 得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變 得明顯和容易理解，其中 ：
[0026] 圖1顯示了實(shí)施例1中獲得的血小板生成的微囊泡的免疫表型檢測結(jié)果，其中，
[0027] 圖1A顯示了依據(jù)微囊泡的大小劃定微囊泡的范圍P1的結(jié)果，
[0028] 圖1B顯示了依據(jù)乳糜微粒大小不同，劃定的乳糜微粒和微囊泡的范圍的結(jié)果，
[0029] 圖1C顯示了對(duì)圖1B劃定范圍的微囊泡進(jìn)行表面標(biāo)志分析的結(jié)果；
[0030] 圖2顯示了實(shí)施例1中獲得的血小板生成的微囊泡的透射電鏡掃描結(jié)果；
[0031] 圖3-圖8顯示了實(shí)施例2中，微囊泡是否添加、添加時(shí)間點(diǎn)和添加濃度對(duì)誘導(dǎo)干 細(xì)胞巨核分化的影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0032] 下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。下面描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā) 明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0033] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下面的實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本 發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條 件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得 的常規(guī)產(chǎn)品，例如可以采購自Illumina公司。
[0034] 實(shí)施例1微囊泡的制備
[0035] 按照以下步驟制備微囊泡：
[0036] a.血小板的分離
[0037] 1)取新鮮的經(jīng)檢驗(yàn)合格并經(jīng)抗凝處理的全血，經(jīng)過4°C，2000r/min離心20-30分 鐘，分離出上層血漿。
[0038] 2)使用1)中獲取的血漿，或直接使用新鮮合格的單采血小板以及富血小板血漿， 經(jīng)4°C，2000g/min離心15-20分鐘，取下層沉淀，為分離的血小板。
[0039] 3)并用緩沖鹽溶液懸起，重復(fù)步驟2)。
[0040] b.血小板的激活
[0041] 4)將分離得到的血小板用緩沖鹽溶液懸起，加入血小板的激活劑（如凝血酶、 CaCl2、ADP、A23187等）后37°C，200r震蕩15-25分鐘，使血小板充分激活。主要激活方法 如下表：
[0042]

【權(quán)利要求】
1. 微囊泡在誘導(dǎo)干細(xì)胞巨核分化中的用途。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述微囊泡由血小板形成。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述干細(xì)胞為造血干細(xì)胞，優(yōu)選臍帶血單 個(gè)核細(xì)胞。
4. 一種用于誘導(dǎo)干細(xì)胞巨核分化的培養(yǎng)基，其特征在于，包含微囊泡。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述微囊泡由血小板形成。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述干細(xì)胞為造血干細(xì)胞，優(yōu)選臍帶血 單個(gè)核細(xì)胞。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基中包含1-25 X 105個(gè)/ml微 囊泡， 任選地,所述培養(yǎng)基為添加了 100ng/mL rhTP0、100ng/mL SCF、20ng/mL IL-3、50ng/ mLIL-6 和 20ng/mL IL-11 的 Stemspan 培養(yǎng)基。
8. -種促進(jìn)干細(xì)胞巨核分化的方法，其特征在于， 利用添加微囊泡的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)所述干細(xì)胞。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中添加有1-25 X 105 個(gè)/ml微囊泡， 任選地，所述添加微囊泡的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為權(quán)利要求4-7任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基， 任選地，于37攝氏度，5 % C02條件下，利用添加微囊泡的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)所述干 細(xì)胞7-15天，其中，隔天半量換液，并使所述誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中各成分濃度不變。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述微囊泡由血小板形成， 任選地，所述干細(xì)胞為造血干細(xì)胞，優(yōu)選臍帶血單個(gè)核細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12N5/078GK104195107SQ201410309772
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年6月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月30日
【發(fā)明者】裴雪濤, 謝小燕, 曲洺逸 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所