冬蟲夏草中國被毛孢磷脂酶c、編號基因及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一個來自“百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國被毛孢參與水解磷脂制備相應游離脂肪酸中的磷脂酶C，編碼這個酶的基因及其應用。所述磷脂酶C的氨基酸序列與SEQ?ID?No.1所示的蛋白具有90％以上同源性，其編碼基因核苷酸序列與SEQ?ID?No.2所示序列具有90％以上同源性。本發(fā)明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用來通過轉導、轉化、結合轉移的方法轉入工程菌中，通過調節(jié)催化水解磷脂制備相應游離脂肪酸的酶對應編碼基因的表達，賦予宿主漆酶的高表達性，為擴大磷脂酶C的生物應用提供了有效途徑，具有重大應用前景。
【專利說明】冬蟲夏草中國被毛孢磷脂酶C、編號基因及其應用 (一）

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一個來自"百令"生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國被毛孢參與水解磷脂制備相應 游離脂肪酸中的磷脂酶c (Laccase)，編碼這個酶的基因及其應用。 (二）

【背景技術】
[0002] 冬蟲夏草（Cordyceps sinensis (Berk. ) Sacc.)是冬蟲夏草菌寄生在鱗翅目 (Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆蟲（Hepialus armoricanus Oberthur)幼蟲上的子座及幼蟲尸 體上的復合體（包括子座和蟲體）。冬蟲夏草是一類珍惜的傳統(tǒng)真菌藥材資源，具有代謝產(chǎn) 物和生物活性多樣的特點，在生物醫(yī)藥領域展現(xiàn)出巨大的應用和發(fā)展前景。冬蟲夏草以其 多種藥用功效廣泛、明顯而備受關注，在世界范圍內備受推崇。中醫(yī)認為，冬蟲夏草入肺腎 二經(jīng)，既能補肺陰，又能補腎陽，主治腎虛，陽痿遺精，腰膝酸痛，病后虛弱，久咳虛弱，勞咳 痰血，自汗盜汗等，是唯一的一種能同時平衡、調節(jié)陰陽的中藥。現(xiàn)代藥理學已證實，冬蟲夏 草具有免疫調節(jié)、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素樣作用等廣泛的生物 活性。
[0003] 冬蟲夏草菌是一種子囊菌，在其生活史中具有分生孢子階段（無性型）和子囊孢 子階段（有性型）。而在人工培養(yǎng)、液體發(fā)酵等實際生產(chǎn)中使用的是無性階段的冬蟲夏草 菌，因而冬蟲夏草無性型的鑒定非常重要。國內外學者在冬蟲夏草資源調查、無性型確證、 活性成分分離分析和作用機理、開發(fā)應用方面做了大量工作。冬蟲夏草中國被毛孢已被證 明是冬蟲夏草的無性型存在形式，具有與天然冬蟲夏草相同的活性成分和藥效。
[0004] 但是，對冬蟲夏草中國被毛孢中磷脂酶C的研究幾乎為空白，尤其在參與中國被 毛孢水解磷脂制備相應游離脂肪酸中的磷脂酶C的研究上。
[0005] 磷脂酶是在生物體內存在的可以水解甘油磷脂的一類酶，其中主要包括磷脂酶 Al、AC、B、C和D，它們特異地作用于磷脂分子內部的各個酯鍵，形成不同的產(chǎn)物，被廣泛用 于甘油磷脂的改造。磷脂酶C(EC:3. 1. 4. 3)可以催化PIP2分解產(chǎn)生1，4, 5-肌醇三磷酸 (IP3)和二酰甘油（DAG)兩個第二信號分子，是存在于胞漿膜上的一個關鍵酶。
[0006] 2001年，查?光等人從廣西產(chǎn)金環(huán)蛇（Bungarus fasciatus)毒腺中抽提總RNA, 經(jīng)mRNA純化后構建了金環(huán)蛇毒腺cDNA文庫。根據(jù)已發(fā)表的眼蛇科蛇毒磷脂酶A[2]基因 序列中的保守區(qū)設計探針篩選克隆，得到2個磷脂酶A[2]基因。測定兩者序列，其cDNA的 閱讀框均為435bp，編碼145個氨基酸的磷脂酶A[2]前體。
[0007] 2002年，李偉琳用探針從紫紅鏈霉菌2917基因組文庫中克隆出磷脂酶A3基因，經(jīng) 雙向測序，確定了其基因的全序列，并由此推導出其氮基酸序列，將此序列與其他來源的磷 脂酶A2基因序列進行了比較研究，結果顯示，與天藍色鏈霉菌A3 (2)中磷脂酶A2的同源性 為98%，與蛇毒的磷脂酶A2的同源性小于10%。
[0008] 2007年，盧冬梅等人從超嗜熱需氧古細菌Aeropyrum pernix K1中抽提出染色體 基因組，經(jīng)PCR擴增得到磷脂酶A2基因，用帶有His-tag標記的pET15b作為表達載體，在 大腸桿菌BLP中成功地誘導表達。表達產(chǎn)物經(jīng)過Ni.螯合柱一步得到純化。SDS-PAGE檢測 只有一條帶，其準確分子量為17. 871kD。
[0009] 2007年，羅滟蘇等人應用銜接頭PCR技術，以藍豬耳（Torenia fournieri)全基因 組DNA分別經(jīng)Dra I、EcoR V、Pvu II和Sma I消化后與銜接頭連接產(chǎn)物為模板，用銜接頭引 物和TfPLCl基因的特異引物經(jīng)過多輪的巢式PCR，先后克隆到2個798和813bp的TfPLCl 基因上游序列，經(jīng)測序、blast比較分析和拼接得到一個藍豬耳TfPLCl基因的啟動子序列， 共 1432bp。
[0010] 2010年，徐賢廣等人研究牛分枝桿菌（M. bovis)溶血磷脂酶基因在致病機理中的 作用，本研究構建了表達M.bovis的溶血酶（LIP)基因的重組質粒pET30a-LIP，經(jīng)IPTG誘 導在大腸桿菌BL21(DE3)中高效表達，SDS-PAGE分析表明，重組蛋白表達量占菌體總蛋白 的20 %，該蛋白經(jīng)電洗脫純化后，純度達95 %以上。
[0011] 2011年，JS Seo等人從牙鲆的cDNA上通過cDNA末端（RACE)快速擴增克隆到了 一個磷脂酶C基因。該cDNA編碼含有一個高度保守的PH結構域，催化X和Y結構域，C2結 構域1244個氨基酸長度的多肽。
[0012] 2011年，Simona Antonacci等人利用設計簡并引物和RT-PCR的方法擴增出了一 個270bp的DNA片段，并且利用RACE的方法分離到了一個全長為2290bp的磷脂酶C基因， 含有1765bp的開放讀碼框。
[0013] 但是，目前NCBI數(shù)據(jù)庫中目前還檢索不到中國被毛孢中磷脂酶C的基因相關信 肩、。 (三）
【發(fā)明內容】

[0014] 本發(fā)明目的在于針對以上存在的不足和需要解決的技術問題，對"百令"生產(chǎn)菌冬 蟲夏草中國被毛孢水解磷脂制備相應游離脂肪酸中的酶及其編碼基因進行深入研究，提供 了 "百令"生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國被毛孢水解磷脂制備相應游離脂肪酸中的一種磷脂酶C、以 及編碼的基因及其應用。
[0015] 本發(fā)明采用的技術方案是：
[0016] 一種參與中國被毛孢水解磷脂制備相應游離脂肪酸中的磷脂酶C(Phospholipase C)，與SEQ ID No. 1所示序列具有90%以上同源性。由于氨基酸序列的特殊性，任何含有 SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其變體，如其保守性變體、生物活性片段或 衍生物，只要該肽蛋白的片段或肽蛋白變體與前述氨基酸序列同源性在90%以上，均屬于 本發(fā)明保護范圍之列。具體的所述改變可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替換；其 中，對于變體的保守性改變，所替換的氨基酸具有與原氨基酸相似的結構或化學性質，如用 亮氨酸替換異亮氨酸，變體也可具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。
[0017] 優(yōu)選的，所述磷脂酶C氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示（記為phoC蛋白）；該酶 可催化磷脂制備相應的磷酸膽堿和甘油二酯。
[0018] 本發(fā)明述磷脂酶C來自"百令"生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國被毛孢。
[0019] 由磷脂經(jīng)過磷脂酶C的催化獲得對應磷酸膽堿和甘油二酯的路徑如下所示：
[0020]

【權利要求】
1. 一種冬蟲夏草中國被毛孢磷脂酶C，其特征在于所述磷脂酶C的氨基酸序列如SEQ ID No. 1 所示。
2. 如權利要求1所述的磷脂酶C在生物催化磷脂生成磷酸膽堿和甘油二酯中的應用。
3. 如權利要求2所述的應用，其特征在于所述的應用為：將含磷脂酶C基因的重組 工程菌經(jīng)誘導培養(yǎng)后的濕菌體用PH8. 0磷酸鹽緩沖液懸浮，超聲破碎后，將破碎混合液離 心，取上清液為催化劑，以磷脂溶液為底物，于pH值為7.0的緩沖液中，37°C下反應，反應 結束后，將反應液離心，獲得含磷酸膽堿和甘油二酯的混合液；所述磷脂溶液按如下步驟制 備：將大豆磷脂用丙酮洗滌，真空脫溶后，獲得無油大豆磷脂；將無油大豆磷脂、質量濃度 0. 5%聚乙烯醇水溶液溶于pH值7. 0的緩沖液中，在10000r/min的條件下均質3min，得到 磷脂溶液；所述〇. 5%聚乙烯醇水溶液的體積用量以無油大豆磷脂質量計為3. 33mL/g，所 述磷脂溶液中無油大豆磷脂的終濃度為50g/L。
4. 如權利要求3所述的應用，其特征在于：所述磷脂溶液的用量以無油大豆磷脂質量 計，所述無油大豆磷脂的初始濃度為48g/L，所述催化劑的用量以超聲破碎前濕菌體的質量 計，終濃度為〇.9g/L。
5. 如權利要求3所述的應用，其特征在于所述催化劑按如下方法制備：將含磷脂酶C 基因的重組工程菌接種于含終濃度50 μ g/ml的Kan抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、250r/ min培養(yǎng)過夜，取培養(yǎng)物，以體積濃度2%的接種量轉接于50mL含有50 μ g/mlKan抗性的LB 液體培養(yǎng)基中，37°C、250r/min培養(yǎng)至菌體濃度0D600為0. 6?0. 8,向培養(yǎng)物中加入終濃 度0. 05mmol/L的IPTG誘導培養(yǎng)8h，收集濕菌體，將濕菌體在功率40%、破Is停Is條件下 超聲破碎，離心，取上清液即為催化劑。
6. -種編碼權利要求1所述磷脂酶C的基因。
7. 如權利要求6所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
8. 如權利要求6或7所述的編碼基因在構建能夠生物催化磷脂生成磷酸膽堿和甘油二 酯的基因工程菌中的應用。
9. 如權利要求8所述的應用，其特征在于所述的應用為：構建含有所述磷脂酶C基因 的重組載體，將所述重組載體轉化至大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌進行誘導培養(yǎng)，培 養(yǎng)液分離純化獲得含有磷脂酶C基因的菌體細胞。
【文檔編號】C12N9/16GK104120115SQ201410305839
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年6月30日 優(yōu)先權日:2014年6月30日
【發(fā)明者】柳志強, 鄭裕國, 林善, 薛亞平, 吳暉, 李邦良, 許靜, 許峰, 袁水金, 王鴻艷 申請人:浙江工業(yè)大學, 杭州中美華東制藥有限公司