一種利用乳酸菌靜息細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了乳酸菌靜息細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸（GABA）工藝，利用經(jīng)過誘導(dǎo)的乳酸菌活性靜息細(xì)胞體，分散于含有底物的轉(zhuǎn)化緩沖液中，在合適的條件下轉(zhuǎn)化生產(chǎn)γ-氨基丁酸。利用該方法可以大幅度縮短轉(zhuǎn)化時間，提高轉(zhuǎn)化效率，產(chǎn)物成份簡單，利于分離提純。且轉(zhuǎn)化無需無菌條件，設(shè)備要求簡單，耗能低。經(jīng)條件優(yōu)化，本工藝已適合工業(yè)化生產(chǎn)?！緦＠綀D】

【附圖說明】：附圖2為pH對乳酸菌株的生長與發(fā)酵生產(chǎn)GABA的影響(▼生長影響；▲發(fā)酵影響)。
【專利說明】—種利用乳酸菌靜息細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)Y-氨基丁酸工藝
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及Y-氨基丁酸生物轉(zhuǎn)化的方法，特別是涉及利用乳酸菌的活性靜息細(xì)胞作為轉(zhuǎn)化反應(yīng)的酶源。
【背景技術(shù)】
[0002]GABA在人體中是一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在腦內(nèi)，GABA以突觸后抑制為主，在脊髓中，GABA以突觸前抑制為主，減少谷氨酸的釋放，L-谷氨酸作為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，傳遞神經(jīng)沖動，通過突觸前抑制作用可以減少神經(jīng)沖動的傳遞。如果人體內(nèi)興奮和抑制的平衡失控，將會導(dǎo)致許多神經(jīng)紊亂相關(guān)的臨床疾病。因此，GABA在人體內(nèi)具有極其重要的生理功能，健腦益智，抗擊癲癇，還能美容皮膚，延緩腦衰老，同時還具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥、降血壓、利尿、改善老年癡呆癥和帕金森癥等神經(jīng)衰敗癥等的作用，還能降低血氨，解除氨毒，促進(jìn)乙醇代謝。作為抑制劑，它還具有抑制癌細(xì)胞的增殖的作用。最近的一項研究表明，Y -氨基丁酸能夠促進(jìn)胰腺分泌胰島素，并有效地防止糖尿病的發(fā)生。
[0003]GABA的制備方法主要有植物富集法、化學(xué)合成法和生物合成法三種。植物富集法操作復(fù)雜，且得率低，不適于規(guī)模化生產(chǎn)?；瘜W(xué)合成法成本較高，得率較低，并且在生產(chǎn)工藝中使用危險溶劑，甚至是有毒溶劑。因此化學(xué)合成法制備的GABA不能用于食品，也不能被認(rèn)為是一種天然食品添加劑。生物合成法相比較來說是一種既安全、又低成本的方法。
[0004]生物法合成GABA是利用生物所含谷氨酸脫羧酶，將L-谷氨酸或其鈉鹽經(jīng)α _脫羧生成GABA的過程，再分離純化得到GABA制品的方法。谷氨酸脫羧酶存在于多種細(xì)菌、古細(xì)菌和真菌中。乳酸菌是被人們普遍接受且安全的、對人體友好、有益的菌株，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到食品發(fā)酵生產(chǎn)中。利用乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)GABA是一種環(huán)保有效的生物合成方法。
[0005]國內(nèi)外對乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)GABA的研究主要是高產(chǎn)菌株的篩選及傳統(tǒng)發(fā)酵方法的優(yōu)化。但研究表明乳酸菌的生長與發(fā)酵轉(zhuǎn)化產(chǎn)GABA所需的pH值并不一致，傳統(tǒng)發(fā)酵方法為了保證發(fā)酵菌體的良好生長，同時兼顧GABA的高效轉(zhuǎn)化，通常采用2步法控制發(fā)酵培養(yǎng)基的PH，首先保持菌體的最佳生長pH，待菌體生長到一定濃度后將pH條件為發(fā)酵轉(zhuǎn)化的最佳值。同時傳統(tǒng)發(fā)酵方法時間較長，需防止雜菌污染，且產(chǎn)物雜質(zhì)較多。由此可以看出，傳統(tǒng)發(fā)酵方法生產(chǎn)GABA操作復(fù)雜，產(chǎn)物分離困難，阻礙了工業(yè)化生產(chǎn)的進(jìn)一步發(fā)展，需在發(fā)酵方式上進(jìn)行改進(jìn)，以簡化發(fā)酵生產(chǎn)的條件控制及減少產(chǎn)物中雜質(zhì)，以利于產(chǎn)物的分離純化，從而降低生產(chǎn)成本，提高轉(zhuǎn)化效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種利用乳酸菌轉(zhuǎn)化生產(chǎn)GABA的新方法，將細(xì)胞培養(yǎng)與GABA轉(zhuǎn)化過程徹底分開，簡化控制條件控制，且能將每個部分的作用最大化，從而提高轉(zhuǎn)化的綜合效率。
[0007]本發(fā)明提出的一種利用乳酸菌靜息細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)Y-氨基丁酸工藝，步驟如下:
(I)將斜面上的GABA高產(chǎn)乳酸菌種接種于改良的MRS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中含有2%_4%的谷氨酸脫羧酶誘導(dǎo)劑MSG，于30-40°C下靜置培養(yǎng)20-40h。
[0008](2)12000rmp，4°C離心上述培養(yǎng)液，收集菌體，并利用0.2M的檸檬酸緩沖液沖洗3遍，獲得具有GABA轉(zhuǎn)化能力的活性靜息細(xì)胞體，備用。
[0009](3)將所獲得靜息細(xì)胞均勻分散于轉(zhuǎn)化緩沖液中，靜息細(xì)胞的濃度為OD6c?為
1.0-8.0，pH控制在3.0-6.0，溫度控制在25-35 °C，緩沖液中引入了乙醇，濃度控制在0.5-2%，轉(zhuǎn)速 50-150rmp ;轉(zhuǎn)化時間 3_5h 獲得 GABA。
[0010]本發(fā)明所述的菌株是GABA高產(chǎn)乳酸菌株，包括短乳桿菌、腸球菌、戊糖片球菌等多種類群乳酸菌菌株。
[0011]本發(fā)明中在菌體培養(yǎng)階段需要添加谷氨酸脫羧酶的誘導(dǎo)劑MSG，因該酶為誘導(dǎo)酶，只有經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的靜息細(xì)胞體才有GABA轉(zhuǎn)化的活性。
[0012]本發(fā)明中采用改良的MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)菌體，在合適的pH值下，菌體能夠快速生長，能夠在較短時間內(nèi)獲得大量菌體。
[0013]本發(fā)明中在轉(zhuǎn)化緩沖液中引入乙醇，在0.5-2%的濃度下能大幅提高靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)GABA的效率。
[0014]作為優(yōu)選，所述的改良MRS各成份的質(zhì)量濃度分別為蛋白胨(5 g/L)、牛肉膏(5 g/L)、酵母粉(20 g/L)、葡萄糖(20 g/L)、乙酸鈉(2.5 g/L)、磷酸氫二鉀(2 g/L)、檸檬酸二胺(I g/L)、吐溫 0.1 g/L、硫酸鎂 0.2 g/L、硫酸錳 0.05 g/L、碳酸鈣 20 g/L。pH 為 6.5-7.5。
[0015]作為優(yōu)選，所述的檸檬酸緩沖液濃度為0.2M。
[0016]作為優(yōu)選，所述的轉(zhuǎn)化緩沖液為0.2M的檸檬酸緩沖液，含60_200mM的轉(zhuǎn)化底物MSG
作為優(yōu)選，轉(zhuǎn)化緩沖液中引入乙醇，且體積濃度為0.5-2%。
[0017]本發(fā)明解決了傳統(tǒng)發(fā)酵轉(zhuǎn)化產(chǎn)GABA工藝過程中條件控制困難，產(chǎn)物成分復(fù)雜等問題。將細(xì)胞培養(yǎng)與GABA轉(zhuǎn)化兩個步驟分離開來，分別保證每個步驟都處于最優(yōu)條件下，使細(xì)胞生長迅速、GABA轉(zhuǎn)化高效，且保證了產(chǎn)物成分相對單一，便于分離提純，提高了GABA生產(chǎn)的綜合效率，節(jié)省成本。本發(fā)明的技術(shù)成熟，菌體培養(yǎng)迅速，靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化率高(90-95%)，轉(zhuǎn)化時間短，適合與工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1乳酸菌株的生長曲線
圖2 p H對乳酸菌株的生長與發(fā)酵生產(chǎn)GABA的影響(▼生長影響；▲發(fā)酵影響)
圖3 pH對靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)GABA的影響 圖4乙醇濃度對靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)GABA的影響 圖5溫度對靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)GABA的影響 圖6底物濃度對靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)GABA的影響 圖7靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中GABA的積累 圖8重復(fù)利用靜息細(xì)胞對其轉(zhuǎn)化效率的影響 具體實施方法
一下結(jié)合實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不能理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬本發(fā)明的范圍。[0019]本實施例所采用的菌種為乳酸菌(Lactic acid bacteria)，包括短乳桿菌、腸球菌、戊糖片球菌等。
[0020]培養(yǎng)基及轉(zhuǎn)化緩沖液成份I
斜面培養(yǎng)基:蛋白胨(5g/L)、牛肉膏(5g/L)、酵母粉(10 g/L)、葡萄糖(10 g/L)、乙酸鈉(2.5 g/L)、磷酸氫二鉀(0.5 g/L)、檸檬酸二胺(0.5 g/L)、吐溫 0.1 g/L、硫酸鎂 0.2 g/L、硫酸錳 0.05 g/L、瓊脂粉 18g/L。pH 為 6.0。
[0021]改良MRS培養(yǎng)基:蛋白胨(5g/L)、牛肉膏(5g/L)、酵母粉(10 g/L)、葡萄糖(10 g/L)、乙酸鈉(2.5 g/L)、磷酸氫二鉀(0.5 g/L)、檸檬酸二胺(0.5 g/L)、吐溫0.1 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、硫酸錳 0.05 g/L。pH 為 6.0
轉(zhuǎn)化緩沖液:0.2M的檸檬酸，60mM的轉(zhuǎn)化底物MSG，乙醇0.5% (v/v)，pH為3.0。
[0022]培養(yǎng)基及轉(zhuǎn)化緩沖液成份2
斜面培養(yǎng)基:蛋白胨(10g/L)、牛肉膏(10g/L)、酵母粉(20 g/L)、葡萄糖(20 g/L)、乙酸鈉(5 g/L)、磷酸氫二鉀(0.75 g/L)、檸檬酸二胺(0.5 g/L)、吐溫0.1 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、硫酸錳0.05 g/L、瓊脂粉18g/L。pH為6.0。
[0023]改良MRS培養(yǎng)基:蛋白胨(10g/L)、牛肉膏(10g/L)、酵母粉(20 g/L)、葡萄糖(20g/L)、乙酸鈉(5 g/L)、磷酸氫二鉀(0.75 g/L)、檸檬酸二胺(0.5 g/L)、吐溫0.1 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、硫酸錳 0.05 g/L。pH 為 6.0
轉(zhuǎn)化緩沖液:0.3M的檸檬酸，10mM的轉(zhuǎn)化底物MSG,乙醇1.0% (v/v)，pH為4.0。
[0024]培養(yǎng)基及轉(zhuǎn)化緩沖液成份3
斜面培養(yǎng)基:蛋白胨(5g/L)、牛肉膏(5g/L)、酵母粉(20 g/L)、葡萄糖(5 g/L)、乙酸鈉(5 g/L)、磷酸氫二鉀(I g/L)、檸檬酸二胺(0.75 g/L)、吐溫0.1 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、硫酸錳 0.05 g/L、瓊脂粉 18g/L。pH 為 6.0。
[0025]改良MRS培養(yǎng)基:蛋白胨(5g/L)、牛肉膏(5g/L)、酵母粉(10 g/L)、葡萄糖(10 g/L)、乙酸鈉(2.5 g/L)、磷酸氫二鉀(I g/L)、檸檬酸二胺(0.75 g/L)、吐溫0.1 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、硫酸錳 0.05 g/L。pH 為 6.0
轉(zhuǎn)化緩沖液:0.4M的檸檬酸，120mM的轉(zhuǎn)化底物MSG，乙醇1.25% (v/v)，pH為4.5。
[0026]培養(yǎng)基及轉(zhuǎn)化緩沖液成份4
斜面培養(yǎng)基:蛋白胨(5g/L)、牛肉膏(5g/L)、酵母粉(10 g/L)、葡萄糖(10 g/L)、乙酸鈉(2.5 g/L)、磷酸氫二鉀(1.5 g/L)、檸檬酸二胺(I g/L)、吐溫0.1 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、硫酸錳 0.05 g/L、瓊脂粉 18g/L。pH 為 6.0。
[0027]改良MRS培養(yǎng)基:蛋白胨(5g/L)、牛肉膏(5g/L)、酵母粉(10 g/L)、葡萄糖(10 g/L)、乙酸鈉(2.5 g/L)、磷酸氫二鉀(1.5 g/L)、檸檬酸二胺(I g/L)、吐溫0.1 g/L、硫酸鎂0.2g/L、硫酸猛 0.05 g/L。pH 為 6.0
轉(zhuǎn)化緩沖液:0.2M的檸檬酸，160mM的轉(zhuǎn)化底物MSG，乙醇1.75% (v/v)，pH為5。
[0028]培養(yǎng)基及轉(zhuǎn)化緩沖液成份5
斜面培養(yǎng)基:蛋白胨(5g/L)、牛肉膏(5g/L)、酵母粉(10 g/L)、葡萄糖(10 g/L)、乙酸鈉(2.5 g/L)、磷酸氫二鉀(2 g/L)、檸檬酸二胺(I g/L)、吐溫0.1 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、硫酸錳
0.05 g/L、瓊脂粉 18g/L。pH 為 6.0。
[0029]改良MRS培養(yǎng)基:蛋白胨(5g/L)、牛肉膏(5g/L)、酵母粉(10 g/L)、葡萄糖(10 g/L)、乙酸鈉(2.5 g/L)、磷酸氫二鉀(2 g/L)、檸檬酸二胺(I g/L)、吐溫0.1 g/L、硫酸鎂0.2g/L、硫酸猛 0.05 g/L。pH 為 6.0
轉(zhuǎn)化緩沖液:0.3M的檸檬酸，200mM的轉(zhuǎn)化底物MSG，乙醇2.0% (v/v)，pH為6。
[0030]實施例1
使用培養(yǎng)基及轉(zhuǎn)化緩沖液成份I
(1)斜面培養(yǎng):將分離的乳酸菌株接種于新鮮的斜面上，26°c培養(yǎng)20h
(2)菌體細(xì)胞培養(yǎng)及靜息細(xì)胞獲取:步驟(1)斜面上的培養(yǎng)菌株接種于改良的MRS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中含有2%的谷氨酸脫羧酶誘導(dǎo)劑MSG，于30°C下靜置培養(yǎng)20h。12000rmp,4°C離心上述培養(yǎng)液，收集菌體，并利用0.2M的檸檬酸緩沖液沖洗3遍，獲得具有GABA轉(zhuǎn)化能力的活性靜息細(xì)胞體，備用。
[0031](3)靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化:將步驟(2)所獲得的活性乳酸菌靜息細(xì)胞分散于IL轉(zhuǎn)化緩沖液中，280C，10rmp恒溫孵育3h。(靜息細(xì)胞在緩沖液中的濃度為0D_=1.0)
實施例2
使用培養(yǎng)基及轉(zhuǎn)化緩沖液成份2
(1)斜面培養(yǎng):將分離 的乳酸菌株接種于新鮮的斜面上，28°C培養(yǎng)24h
(2)菌體細(xì)胞培養(yǎng)及靜息細(xì)胞獲取:步驟(1)斜面上的培養(yǎng)菌株接種于改良的MRS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中含有2.5%的谷氨酸脫羧酶誘導(dǎo)劑MSG，于32°C下靜置培養(yǎng)24h。12000rmp,4°C離心上述培養(yǎng)液，收集菌體，并利用0.2M的檸檬酸緩沖液沖洗3遍，獲得具有GABA轉(zhuǎn)化能力的活性靜息細(xì)胞體，備用。
[0032](3)靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化:將步驟(2)所獲得的活性乳酸菌靜息細(xì)胞分散于5L轉(zhuǎn)化緩沖液中，300C，10rmp恒溫孵育3h。(靜息細(xì)胞在緩沖液中的濃度為0D_=2.0)
實施例3
使用培養(yǎng)基及轉(zhuǎn)化緩沖液成份3
(1)斜面培養(yǎng):將分離的乳酸菌株接種于新鮮的斜面上，30°C培養(yǎng)30h
(2)菌體細(xì)胞培養(yǎng)及靜息細(xì)胞獲取:步驟(1)斜面上的培養(yǎng)菌株接種于改良的MRS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中含有3%的谷氨酸脫羧酶誘導(dǎo)劑MSG，于34°C下靜置培養(yǎng)30h。12000rmp,4°C離心上述培養(yǎng)液，收集菌體，并利用0.2M的檸檬酸緩沖液沖洗3遍，獲得具有GABA轉(zhuǎn)化能力的活性靜息細(xì)胞體，備用。
[0033](3)靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化:將步驟(2)所獲得的活性乳酸菌靜息細(xì)胞分散于1L轉(zhuǎn)化緩沖液中，320C，10rmp恒溫孵育3h。(靜息細(xì)胞在緩沖液中的濃度為0D_=4.0)
實施例4
使用培養(yǎng)基及轉(zhuǎn)化緩沖液成份4
(1)斜面培養(yǎng):將分離的乳酸菌株接種于新鮮的斜面上，32°C培養(yǎng)40h
(2)菌體細(xì)胞培養(yǎng)及靜息細(xì)胞獲取:步驟(1)斜面上的培養(yǎng)菌株接種于改良的MRS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中含有3.5%的谷氨酸脫羧酶誘導(dǎo)劑MSG，于36°C下靜置培養(yǎng)36h。12000rmp,4°C離心上述培養(yǎng)液，收集菌體，并利用0.2M的檸檬酸緩沖液沖洗3遍，獲得具有GABA轉(zhuǎn)化能力的活性靜息細(xì)胞體，備用。
[0034](3)靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化:將步驟(2)所獲得的活性乳酸菌靜息細(xì)胞分散于20L轉(zhuǎn)化緩沖液中，340C，10rmp恒溫孵育3h。(靜息細(xì)胞在緩沖液中的濃度為0D_=6.0)實施例5
使用培養(yǎng)基及轉(zhuǎn)化緩沖液成份5
(1)斜面培養(yǎng):將分離的乳酸菌株接種于新鮮的斜面上，37°C培養(yǎng)48h
(2)菌體細(xì)胞培養(yǎng)及靜息細(xì)胞獲取:步驟(1)斜面上的培養(yǎng)菌株接種于改良的MRS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中含有2%-4%的谷氨酸脫羧酶誘導(dǎo)劑MSG，于37°C下靜置培養(yǎng)40h。12000rmp,4°C離心上述培養(yǎng)液，收集菌體，并利用0.2M的檸檬酸緩沖液沖洗3遍，獲得具有GABA轉(zhuǎn)化能力的活性靜息細(xì)胞體，備用。
[0035](3)靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化:將步驟(2)所獲得的活性乳酸菌靜息細(xì)胞分散于50L轉(zhuǎn)化緩沖液中，380C，10rmp恒溫孵育3h。(靜息細(xì)胞在緩沖液中的濃度為0D_=8.0)。
【權(quán)利要求】
1.一種利用乳酸菌靜息細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)Y-氨基丁酸工藝，其特征包括以下步驟: (1)靜息細(xì)胞獲取:將具有Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)化能力的乳酸菌株從斜面培養(yǎng)基上接種于含有誘導(dǎo)劑-谷氨酸鈉(MSG)的改良MRS培養(yǎng)基，30-40°C培養(yǎng)20_40h，12000rmp,4°C低溫離心收集菌體，用檸檬酸緩沖液沖洗3遍后備用； 所說的斜面培養(yǎng)基為:蛋白胨(5-10g/L)、牛肉膏(5-10g/L)、酵母粉(10-20 g/L)、葡萄糖(10-20 g/L)、乙酸鈉(2.5-5 g/L)、磷酸氫二鉀(0.5-2 g/L)、檸檬酸二胺(0.5-1 g/L)、吐溫 0.1 g/L、硫酸鎂 0.2 g/L、硫酸錳 0.05 g/L、瓊脂粉 18g/L, pH 為 6.0-8.0; 所說的改良MRS培養(yǎng)基為:蛋白胨(5-10g/L)、牛肉膏(5-10g/L)、酵母粉(10-20 g/L)、葡萄糖(10-20 g/L)、乙酸鈉(2.5-5 g/L)、磷酸氫二鉀(0.5-2 g/L)、檸檬酸二胺(0.5_lg/L)、吐溫 0.1 g/L、硫酸鎂 0.2 g/L、硫酸錳 0.05 g/L, pH 為 6.0-8.0; 所說的檸檬酸緩沖液為:0.2M檸檬酸緩沖液； (2)將活性乳酸菌靜息細(xì)胞分散于轉(zhuǎn)化緩沖液中，于30-40°C，10rmp孵育3_5h，完成轉(zhuǎn)化，靜息細(xì)胞在緩沖液中的濃度為OD_值為1.0-8.0; 所說的轉(zhuǎn)化緩沖液為0.2-0.4M的檸檬酸緩沖液，并含有60-200mM的轉(zhuǎn)化底物MSG，乙醇 0.5%-2% (v/v)，pH 為 3.0-6.0。
【文檔編號】C12R1/46GK104031951SQ201410295837
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月27日
【發(fā)明者】田永強, 雷祖超, 劉波, 田杰偉, 王磊, 邱鵬, 龍秀鋒 申請人:四川大學(xué)