一種適用于幼齡兔卵母細(xì)胞體外受精方法及培養(yǎng)液配方的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種適用于幼齡兔卵母細(xì)胞體外受精方法及培養(yǎng)液配方。本發(fā)明在BO受精液中添加10μM EGCG，用于幼齡兔卵母細(xì)胞體外受精，在BO受精液中添加10μM EGCG，BO受精液為：NaCl 6.5453mg/mL，KCl 0.2997mg/mL，NaH2PO4·H2O 0.1145mg/mL，MgCl2·6H2O 0.1057mg/mL，CaCl2·2H2O 0.330mg/mL，葡萄糖2.518mg/mL，0.2％酚紅4％，100IU/mL青霉素，100IU/mL鏈霉素，NaHCO33.1080mg/mL，丙酮酸鈉0.1380mg/mL，肝素20μg/mL，BSA 20mg/mL?？朔爽F(xiàn)有幼齡家畜體外培養(yǎng)體系的缺陷。本發(fā)明在BO受精液中，不同濃度EGCG對(duì)幼齡兔卵母細(xì)胞體外受精具有顯著性的影響(P＜0.05)，受精液中EGCG添加濃度為5μM、10μM、15μM時(shí)，受精率顯著高于0和20μM(分別為43.26±5.92和46.34±3.57)，而添加5μM、10μM、15μM時(shí)，幼齡兔卵母細(xì)胞受精率差異不顯著，添加10μM時(shí)，高于5μM和15μM。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種適用于幼齡兔卵母細(xì)胞體外受精方法及培養(yǎng)液配方

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種適用于幼齡兔卵母細(xì)胞體外受精方法及培 養(yǎng)液配方。

【背景技術(shù)】
[0002] 幼畜體外胚胎生產(chǎn)和移植技術(shù)（Juvenile In Vitro Embryo Transfer，JIVET) 包括幼畜超數(shù)排卵、卵母細(xì)胞體外成熟（In Vitro Maturation，IVM)、體外受精（In Vitro Fertil ization，IVF)、胚胎體外培養(yǎng)（In Vitro Culture, IVC)及胚胎移植等技術(shù)。該技 術(shù)是通過(guò)外源性促性腺激素，誘導(dǎo)幼畜卵巢上卵泡的超數(shù)發(fā)育，而后通過(guò)取卵、卵母細(xì)胞體 外成熟、體外受精及受精卵體外培養(yǎng)等技術(shù)生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)胚胎，并移植母體內(nèi)從而獲得優(yōu)質(zhì) 后代。體外受精技術(shù)是JIVET技術(shù)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，通過(guò)提高體外受精培養(yǎng)效果，能顯著提 高后期胚胎的生長(zhǎng)及發(fā)育質(zhì)量，有效地提高JIVET技術(shù)的生產(chǎn)效率。
[0003] 表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG)是兒茶素中一種主要的酯型兒茶素，其分子 量為：458. 38,分子式：C22H18(VEGCG具有較強(qiáng)的抗氧化作用，能有效地清除氧自由基，能保 護(hù)細(xì)胞及其DNA免受損傷，EGCG的這些特點(diǎn)，使得其在抗氧化、防治糖尿病、抗癌變和神經(jīng) 元保護(hù)功能等方面具有很強(qiáng)的功效。在體外受精過(guò)程中，精子在體外獲能及受精過(guò)程中會(huì) 產(chǎn)生多種有害物質(zhì)，如細(xì)胞脂肪代謝產(chǎn)生的活性氧、氧自由基，過(guò)量的活性氧和氧自由基將 會(huì)大大降低體外胚胎生產(chǎn)效率。而EGCG具有很強(qiáng)的抗氧化作用，因此在體外胚胎生產(chǎn)培養(yǎng) 體系中，添加一定濃度EGCG能有效地提高卵母細(xì)胞成熟率、受精率及胚胎發(fā)育。
[0004] 在本發(fā)明之前，目前幼齡家畜的體外培養(yǎng)體系多參照成年家畜的體外培養(yǎng)體系， 但由于幼齡家畜卵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)及生長(zhǎng)發(fā)育模式與成年家畜有所不同，因而需要建立一種適 用于幼齡家畜特有的培養(yǎng)體系及方法，才能有效地提高幼齡家畜胚胎體外生產(chǎn)效率。成年 兔體外受精培養(yǎng)過(guò)程中，常采用B0受精液。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的就是要克服上述缺陷，研制一種適用于幼齡兔卵母細(xì)胞體外受精方 法及培養(yǎng)液配方。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0007] 本發(fā)明所述的一種適用于幼齡兔卵母細(xì)胞體外受精方法，其主要技術(shù)特征在于在 B0受精液中添加10 μ M EGCG，用于幼齡兔卵母細(xì)胞體外受精。
[0008] 本發(fā)明的另一技術(shù)方案是：
[0009] -種用于幼齡兔卵母細(xì)胞體外受精的受精培養(yǎng)液，其主要技術(shù)特征在于， 在 Β0 受精液中添加 10 μ M EGCG，Β0 受精液為：NaC16. 5453mg/mL，KC10. 2997mg/mL， NaH2P04 · Η200· 1145mg/mL，MgCl2 · 6Η200· 1057mg/mL，CaCl2 · 2Η200· 330mg/mL，葡萄糖 2. 518mg/mL，0. 2%酚紅 4%，lOOIU/mL 青霉素，lOOIU/mL 鏈霉素，NaHC033. 1080mg/mL，丙酮 酸納 0· 1380mg/mL，肝素 20 μ g/mL，BSA20mg/mL。
[0010] 本發(fā)明利用幼齡兔卵母細(xì)胞進(jìn)行體外成熟，將成熟卵母細(xì)胞移入含不同濃度EGCG 受精液（0、5、10、15、20μΜ)中，將精子獲能后，加入受精液中，研究不同濃度EGCG對(duì)幼齡兔 卵母細(xì)胞體外受精的影響，選出最優(yōu)添加濃度，建立一種高效的幼齡兔卵母細(xì)胞體外受精 培養(yǎng)體系，優(yōu)化JIVET的相關(guān)技術(shù)。
[0011] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果在于：
[0012] 在Β0受精液中，不同濃度的EGCG對(duì)幼齡兔卵母細(xì)胞體外受精具有顯著性的影響 (P<0.05)，受精液中EGCG添加濃度為5μM、10μM、15μM時(shí)（受精率分別為56.05±5.22、 62. 41 ±3. 09和58. 99±2. 21)，其受精率顯著高于0和20 μ Μ(受精率分別為43. 26±5. 92 和46. 34±3. 57)，而添加5 μ Μ、10 μ Μ、15 μ Μ時(shí)，幼齡兔卵母細(xì)胞受精率差異不顯著（Ρ > 0.05)，但可以看出，添加10 μ Μ時(shí)，其受精率高于5 μ Μ和15 μ Μ(見(jiàn)表1)。
[0013] 在幼齡兔體外受精過(guò)程中，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)精子獲能效果的研究，得出EGCG 最佳添加濃度為10 μ Μ。（注：前期研究已證明添加10 μ Μ濃度EGCG能有效地提高精子獲 能效果）
[0014] 表1不同濃度EGCG對(duì)幼齡兔卵母細(xì)胞體外受精的影響
[0015]

【權(quán)利要求】
1. 一種適用于幼齡兔卵母細(xì)胞體外受精方法，其特征在于在BO受精液中添加10 μ Μ EGCG，用于幼齡兔卵母細(xì)胞體外受精。
2. -種用于權(quán)利要求1所述方法的受精培養(yǎng)液，其特征在于，在B0受精液中添加 10 μ M EGCG，B0 受精液為：NaC16. 5453mg/mL，KC10. 2997mg/mL，NaH2P04 · Η200· 1145mg/mL， MgCl2 · 6Η200· 1057mg/mL，CaCl2 · 2Η200· 330mg/mL，葡萄糖 2. 518mg/mL，0. 2 % 酚紅 4 %， lOOIU/mL 青霉素，lOOIU/mL 鏈霉素，NaHC033. 1080mg/mL，丙酮酸鈉 0· 1380mg/mL，肝素 20 μ g/mL, BSA20mg/mL。
【文檔編號(hào)】C12N5/075GK104232569SQ201410287367
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年6月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月23日
【發(fā)明者】李擁軍, 張光景, 張佳慧, 楊波, 蔡繆熒 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)