一種適用于兔精子體外獲能方法及培養(yǎng)液配方的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種適用于兔精子體外獲能方法及培養(yǎng)液配方。本發(fā)明在BO獲能液中添加10μmol/L?EGCG，用于精子體外獲能處理，且在BO獲能液中添加10μmol/L?EGCG，BO獲能液配方為：NaCl?6.5453mg/mL，KCl?0.2997mg/mL，NaH2PO4·H2O?0.1145mg/mL，MgCl2·6H2O?0.1057mg/mL，CaCl2·2H2O?0.330mg/mL，葡萄糖2.518mg/mL，0.2％酚紅4％，100IU/mL青霉素，100IU/mL鏈霉素，NaHCO33.1080mg/mL，丙酮酸鈉0.1380mg/mL，肝素20μg/mL，BSA20mg/mL。本發(fā)明克服了現(xiàn)有的精子體外獲能過(guò)程中，由于精子密度較大，精子自身代謝產(chǎn)生的氧自由基積累較多的缺陷。本發(fā)明利用成年新西蘭白兔公免，對(duì)其采精后，在BO獲能液中添加不同濃度EGCG(0μM、10μM、15μM、20μM、25μM)，研究其對(duì)兔精子獲能效果的影響，得出最佳EGCG添加濃度，建立一種高效的兔體外獲能培養(yǎng)體系。
【專利說(shuō)明】一種適用于兔精子體外獲能方法及培養(yǎng)液配方

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種適用于兔精子體外獲能方法及培養(yǎng)液配 方。

【背景技術(shù)】
[0002] 體外受精技術(shù)是體外胚胎生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)，通過(guò)體外受精，能夠生產(chǎn)大量?jī)?yōu)質(zhì)廉 價(jià)的胚胎，以滿足胚胎商業(yè)化的需求。精子體外獲能是體外受精技術(shù)必不可少的環(huán)節(jié)，精子 獲能時(shí)，精子內(nèi)部發(fā)生著一系列的生理生化反應(yīng)，包括精子表面精漿蛋白類物質(zhì)的去除、離 子在胞膜內(nèi)外之間的運(yùn)動(dòng)（Ca 2+、Mg2+、Cr和HCCV內(nèi)流而K+、Na+外流）、精子獲能調(diào)控系統(tǒng) 的開(kāi)放、精子膜電位的超極化等。精子獲能的分子機(jī)理主要有去能因子的失活、蛋白質(zhì)酪氨 酸的磷酸化、膽固醇的流失、活性氧的產(chǎn)生等。
[0003] 表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG)是兒茶素中一種主要的酯型兒茶素，其分子 量為：458. 38,分子式：C22H18(VEGCG具有較強(qiáng)的抗氧化作用，能有效地清除氧自由基，能保 護(hù)細(xì)胞及其DNA免受損傷，EGCG的這些特點(diǎn)，使得其在抗氧化、防治糖尿病、抗癌變和神經(jīng) 元保護(hù)功能等方面具有很強(qiáng)的功效。在精子體外獲能過(guò)程中，精子會(huì)產(chǎn)生多種有害物質(zhì)，如 細(xì)胞脂肪代謝產(chǎn)生的活性氧、氧自由基，過(guò)量的活性氧和氧自由基將會(huì)大大降低精子體外 荻能效果，進(jìn)而影響體外受精效果。而EGCG具有很強(qiáng)的抗氧化作用，因此在體外胚胎生產(chǎn) 培養(yǎng)體系中，添加一定濃度EGCG能有效地提高精子獲能效果。
[0004] 目前已建立了許多精子獲能效果的評(píng)價(jià)方法，其中考馬斯亮藍(lán)染色法是一種常用 的方法?？捡R斯亮藍(lán)是一類蛋白質(zhì)染色劑，未獲能的精子頂體外膜中含有大量的糖蛋白，經(jīng) 染色后，精子頭部頂端呈深藍(lán)色，而獲能后精子的頂體膜破裂，其中的糖蛋白被釋放出來(lái)， 因此，經(jīng)過(guò)染色后，頂體區(qū)不著色。染色后在普通光學(xué)顯微鏡下可以觀察到兩種類型的精 子：所有精子尾部均染成紫藍(lán)色，頭部則呈A型和B型。A型為沒(méi)有發(fā)生頂體反應(yīng)的精子， 頂體區(qū)染成紫藍(lán)色而頂體后區(qū)不染色或呈淺紫色，少量精子頂體后區(qū)也呈紫藍(lán)色；B型為 已發(fā)生頂體反應(yīng)的精子，頂體區(qū)不染色或染淺紫色，其余部位染色與A型相似。考馬斯亮藍(lán) 檢查結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性好、各批次間的差異不大，可以在普通實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，能有效地 評(píng)價(jià)精子獲能效果。
[0005] 在本發(fā)明之前，兔精液體外獲能的研究較為成熟，但是在精子體外獲能過(guò)程中，由 于精子密度較大，精子自身代謝產(chǎn)生的氧自由基積累較多，因此有必要發(fā)明一種抗氧化型 精子體外獲能液用于提商精子獲能效率，為后期胚胎生廣奠定一定基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的就在于克服上述缺陷，研制建立一種適用于兔精子體外獲能方法及 培養(yǎng)液配方。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0008] -種適用于兔精子體外獲能方法，其主要技術(shù)特征是在B0獲能液中添加 ΙΟμπιοΙ/L EGCG，用于精子體外獲能處理。
[0009] 本發(fā)明的另一技術(shù)方案是：
[0010] 一種用于兔精子體外獲能的獲能液，其主要技術(shù)特征在于，是在B0獲能液中添加 10 μ mol/L EGCG，B0 獲能液配方為：NaCl 6. 5453mg/mL，KC1 0· 2997mg/mL，NaH2P04 · H20 0. 1145mg/mL, MgCl2 · 6H20 0. 1057mg/mL, CaCl2 · 2H20 0. 330mg/mL,葡萄糖 2. 518mg/ mL，0. 2% 酚紅 4%，100IU/mL 青霉素，lOOIU/mL 鏈霉素，NaHC033. 1080mg/mL，丙酮酸鈉 0· 1380mg/mL，肝素 20μ g/mL，BSA20mg/mL。
[0011] 本發(fā)明的效果和優(yōu)點(diǎn)在于利用成年新西蘭白兔公兔，對(duì)其采精后，在BO獲能液中 添加不同濃度EGCG(0 μ M、10 μ M、15 μ Μ、20 μ Μ、25 μ M)，研究其對(duì)兔精子獲能效果的影響， 得出最佳EGCG添加濃度，建立一種高效的兔體外獲能培養(yǎng)體系。同時(shí)可由表1可知，獲能液 中添加不同濃度EGCG對(duì)活精子百分?jǐn)?shù)具有顯著的影響（Ρ < 0.05)，其中0、5和10 μ mol/ L EGCG對(duì)活精子百分率的影響差異不顯著（P > 0. 05)，但顯著的高于其他三組。由圖1可 知，在添加0 μ mol/L到10 μ mol/L的EGCG之間，活精子百分率的變化趨勢(shì)基本不變，但到 10 μ mol/L之后，活精子百分率開(kāi)始逐漸下降。說(shuō)明添加0、5和10 μ mol/L EGCG對(duì)精子的 活力沒(méi)有顯著影響。
[0012] 在B0獲能液中添加不同濃度EGCG對(duì)精子頂體反應(yīng)發(fā)生率具有顯著影響（P <0.05)，其中獲能液添加10 μ Μ濃度的頂體反應(yīng)發(fā)生率顯著高于其他各組（P< 0.05)(見(jiàn) 表2)，圖2可以看出，在添加0到10 μ Μ濃度區(qū)間，精子頂體反應(yīng)發(fā)生率逐漸增加，在添加 10到20 μ Μ濃度區(qū)間，精子頂體反應(yīng)發(fā)生率逐漸降低。
[0013] 在精子體外獲能過(guò)程中，EGCG最佳添加濃度為10 μ Μ。
[0014] 精子獲能6h后，活精子的百分?jǐn)?shù)見(jiàn)表1和圖1。
[0015] 表1不同濃度EGCG對(duì)活精子百分率的影響
[0016]

【權(quán)利要求】
1. 一種適用于兔精子體外獲能方法，是在BO獲能液中添加10 μ mol/L EGCG，用于精子 體外獲能處理。
2. -種用于權(quán)利1所述方法的獲能培養(yǎng)液，其特征在于，是在B0獲能液中添加 10 μ mol/L EGCG，B0 獲能液配方為：NaCl 6. 5453mg/mL，KC1 0· 2997mg/mL，NaH2P04 · H20 0. 1145mg/mL, MgCl2 · 6H20 0. 1057mg/mL, CaCl2 · 2H20 0. 330mg/mL,葡萄糖 2. 518mg/ mL，0. 2% 酚紅 4%，100IU/mL 青霉素，lOOIU/mL 鏈霉素，NaHC033. 1080mg/mL，丙酮酸鈉 0· 1380mg/mL，肝素 20μ g/mL，BSA20mg/mL。
【文檔編號(hào)】C12N5/076GK104059878SQ201410287368
【公開(kāi)日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2014年6月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月23日
【發(fā)明者】李擁軍, 張光景, 張佳慧, 楊波, 蔡繆熒 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)