Bhk-21細(xì)胞全懸浮培養(yǎng)技術(shù)在新城疫疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及BHK-21細(xì)胞全懸浮培養(yǎng)技術(shù)在新城疫疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用。本發(fā)明公開的BHK-21細(xì)胞全懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)新城疫疫苗的工藝包括以下步驟：(1)病毒株選育：雞胚培養(yǎng)的新城疫疫苗種毒接種單層BHK-21細(xì)胞，加入病毒維持液培養(yǎng)，得到適應(yīng)BHK-21細(xì)胞的新城疫疫苗毒，并進(jìn)行系統(tǒng)鑒定；(2)懸浮細(xì)胞株的馴化與選育：適合新城疫病毒培養(yǎng)用全懸浮BHK21細(xì)胞的馴化和基礎(chǔ)種子的建立；(3)懸浮細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)；(4)接毒和收毒：適應(yīng)BHK-21細(xì)胞的新城疫疫苗毒接種及其毒液收獲；(5)增殖新城疫疫苗毒的毒價測定與配苗。本發(fā)明使得新城疫疫苗實現(xiàn)了由雞胚向哺乳動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)的轉(zhuǎn)變，這不僅簡化了新城疫疫苗的生產(chǎn)工藝，降低生產(chǎn)成本，還大大提高疫苗的產(chǎn)量和質(zhì)量。CGMCC No88892014.06.17CGMCC No93192014.06.17
【專利說明】BHK-21細(xì)胞全懸淳培養(yǎng)技術(shù)在新城疫疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及BHK-21細(xì)胞全懸浮培養(yǎng)技術(shù)在新城疫疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用，屬于獸用 生物制藥領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 目前，國內(nèi)禽用疫苗的生產(chǎn)主要依靠傳統(tǒng)的"雞胚法"（中國獸藥典委員會.中華 人民共和國獸藥典三部二〇一〇年版.中國農(nóng)業(yè)出版社2011年）工藝實現(xiàn)。"雞胚法" 制取疫苗的技術(shù)由來已久，最初于20世紀(jì)50年代開發(fā)，雖然這種技術(shù)也不斷進(jìn)化來應(yīng)對各 種挑戰(zhàn)，包括產(chǎn)量、自動化、容量、質(zhì)量保證和生產(chǎn)速度等方面。但在我國，在實際的生產(chǎn)過 程中，由于SPF(無特異性病原）雞胚供應(yīng)量的制約以及成本問題，許多的國產(chǎn)疫苗并非全 部由SPF雞胚制造。尤其是禽用弱毒疫苗的制備，若所用雞胚來自普通雞蛋，可造成外源病 原的污染，并由此造成了某些疫病的傳播和蔓延。與此同時，雞胚中的母源抗體還會干擾接 種疫苗病毒的繁殖，直接影響疫苗的質(zhì)量，常常會造成免疫失敗。
[0003] 懸浮BHK-21細(xì)胞已成功在口蹄疫疫苗生產(chǎn)中應(yīng)用，不僅縮短了疫苗生產(chǎn)周期，降 低勞動強(qiáng)度和生產(chǎn)成本，還減少批間差異提高了疫苗質(zhì)量，懸浮BHK-21細(xì)胞在新城疫疫苗 上的應(yīng)用，有望終結(jié)新城疫疫苗的雞胚時代。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是篩選和馴化一株適應(yīng)BHK-21全懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的新城疫病毒適應(yīng) 株用于雞新城疫疫苗生產(chǎn)。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案
[0006] (1)病毒株的選育將新城疫病毒Mukteswar株經(jīng)BHK-21細(xì)胞連續(xù)傳代，獲得的 BHK-21 細(xì)胞適應(yīng)毒，命名為新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV)Mukteswar 株 / BHK-21，該毒株已于2014年6月17日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院 微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為=CGMCC No. 8889 〇
[0007] (2)懸浮細(xì)胞株的馴化與選育將適合新城疫病毒培養(yǎng)用BHK-21細(xì)胞進(jìn)行全懸浮 馴化和連續(xù)克隆純化選育，獲得全懸浮的幼金倉鼠腎細(xì)胞BHK-21/IVDC株，該細(xì)胞株已于 2014年6月17日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No. 9319。
[0008] (3)懸浮細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)復(fù)蘇BHK-21/IVDC株懸浮細(xì)胞，采用懸浮細(xì)胞培養(yǎng)瓶逐級 放大為5個500ml規(guī)格的懸浮培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞濃度達(dá)到4 X IO6細(xì)胞/ml后，全部轉(zhuǎn)移至美國 NBS BioFlo 115型總體積14L的反應(yīng)器，補(bǔ)加培養(yǎng)基至10L，反應(yīng)器參數(shù)設(shè)定四路氣體，分 別為空氣、氧氣、氮?dú)夂虲O2，轉(zhuǎn)速80r/min，溫度37°C，pH 7. 2,溶氧60%，分別于培養(yǎng)24h、 48h采樣進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)和活力檢測。
[0009] (4)接毒和收毒當(dāng)BioFlo 115型反應(yīng)器中活細(xì)胞密度不低于2. 5 X IO6細(xì)胞/ml 時，按細(xì)胞培養(yǎng)液體積的I %比例接入新城疫病毒Mukteswar株/BHK-2,反應(yīng)器參數(shù)設(shè)定四 路氣體，分別為空氣、氧氣、氮?dú)夂虲O2，轉(zhuǎn)速80r/min，溫度37°C，pH 7. 4,溶氧60%，，于接 毒后24h起,每隔2h采樣進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),活細(xì)胞密度低于0. 5X IO6后，收獲病毒液即為抗 原。
[0010] 2.用于制備抗原所述的病毒，可以是新城疫病毒的任何疫苗生產(chǎn)毒株。
[0011] 3.用以上所述的新城疫病毒抗原制備疫苗。
[0012] 4.用以上所述的新城疫病毒抗原制備疫苗的方法，包括：將Mukteswar株/BHK-21 細(xì)胞毒在BHK-21/IVDC株細(xì)胞中大量增殖，加入凍干保護(hù)劑經(jīng)真空冷凍干燥制備新城疫活 疫苗。
[0013] 5.用以上所述的新城疫病毒抗原制備疫苗的方法，包括：將Mukteswar株/BHK-21 細(xì)胞毒在BHK-21/IVDC株細(xì)胞中大量增殖、滅活，加入佐劑制備新城疫滅活疫苗。
[0014] 6.用于以上4或5所述的新城疫病毒抗原制備疫苗的方法，包括新城疫病毒的任 何疫苗生產(chǎn)毒株。
[0015] 7.以上3所述的的新城疫疫苗在預(yù)防新城疫中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明【具體實施方式】
[0017] 具體包括以下步驟
[0018] 1.病毒株的選育
[0019] (1)將雞胚培養(yǎng)增殖的新城疫疫苗生產(chǎn)種毒接種生長良好的細(xì)胞單層的BHK-21 細(xì)胞，加入維持液培養(yǎng)，得到適應(yīng)BHK-21細(xì)胞的新城疫病毒疫苗生產(chǎn)用毒種；
[0020] 所述具體方法為：所述的將雞胚培養(yǎng)的新城疫病毒疫苗生產(chǎn)毒株種毒接種單層 BHK-21細(xì)胞，包括以（按培養(yǎng)基的體積比）0.5%?10%毒量接種單層BHK-21細(xì)胞，加入 維持液后繼續(xù)在37°C 5%二氧化碳環(huán)境下培養(yǎng)至60%?100%細(xì)胞發(fā)生病變時收獲毒液， 獲得的病毒液再以同樣方法繼續(xù)接種細(xì)胞，如此在BHK-21細(xì)胞中增殖5?20代獲得適應(yīng) BHK-21細(xì)胞的新城疫病毒疫苗生產(chǎn)毒株。
[0021] (2)將適應(yīng)BHK-21細(xì)胞的新城疫病毒疫苗生產(chǎn)毒株（如Mukteswar株、Roakin株 及其它毒株）建立種子批，并進(jìn)行系統(tǒng)鑒定；
[0022] 具體方法為：所述的適應(yīng)BHK-21細(xì)胞的新城疫病毒疫苗生產(chǎn)毒株毒種建立種子 批，并進(jìn)行下列鑒定：
[0023] 1)病毒含量測定將適應(yīng)BHK-21細(xì)胞的新城疫病毒疫苗生產(chǎn)毒株病毒液（以下 簡稱"病毒液"）用無血清DMEM營養(yǎng)液（Gibco產(chǎn)品）作10倍系列稀釋，取KT 1?10_9共9 個稀釋度，每個稀釋度各接種已長成良好單層的96孔板BHK-21細(xì)胞8孔，每孔0. Iml，37°C 吸附1小時后，補(bǔ)加含2%小牛血清的DMEM營養(yǎng)液，置37°C 5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48? 96小時，記錄細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE)情況，按Reed-Muench法計算TCID5tl。每毫升病毒含量應(yīng) 不低于 l(f°TCID5。。
[0024] 2)紅細(xì)胞凝集價測定將病毒液用PBS做2倍系列稀釋（50 μ 1病毒液+50 μ 1 PBS)，加入等量1 %雞紅細(xì)胞，同時設(shè)紅細(xì)胞對照。振蕩混勻后，20?30°C孵育15?30分 鐘后檢查結(jié)果，使50%紅細(xì)胞凝集的最高稀釋度作為判定終點。病毒液對雞紅細(xì)胞凝集價 應(yīng)不低于1:256。
[0025] 3)鑒別檢驗將病毒液用無血清DMEM營養(yǎng)液稀釋為100TCID5(l/0. 1ml，與等量抗雞 新城疫病毒特異性血清混合，置室溫中和1小時，接種已長成良好單層的BHK-21細(xì)胞培養(yǎng) 瓶4瓶，每瓶接種2ml，37°C吸附1小時后棄去吸附液體，然后補(bǔ)加含2 %小牛血清的DMEM 營養(yǎng)液，置37°C 5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48?96小時，記錄CPE情況。同時設(shè)立正常細(xì)胞 對照2瓶。樣品接種瓶應(yīng)4/4不出現(xiàn)CPE，正常細(xì)胞對照應(yīng)正常。
[0026] 4)RT-PCR根據(jù)NDV標(biāo)準(zhǔn)毒株基因序列設(shè)計合成一對引物，引物序列如下：Pl : 5' -TTGATGGCAGGCCTCTTGC-3，（序列 1);P2:5' -GGAGGATGTTGGCAGCATT-3，（序列 2)， 預(yù)期擴(kuò)增片段大小為359bp。采用TakaRa RNA提取試劑盒提取RNA，然后采用TakaRa-步 法RT-PCR試劑盒進(jìn)行RT-PCR。反應(yīng)體系為25 μ 1 :酶混合物1 μ 1，2X bufferl2. 5 μ 1，Pl 和Ρ2引物（均為25μπι)各1μ 1，RNA模板10μ 1。反應(yīng)條件為：42°C 60min，94°C 5min ;然 后 94°C 40s，56°C lmin，72°C lmin，共 35 個循環(huán)，然后 72°C IOmin ;最后 4°C保溫。病毒液 及NDV對照應(yīng)出現(xiàn)359bp特異性條帶，陰性對照應(yīng)無條帶。
[0027] 2.懸浮細(xì)胞株的馴化與選育
[0028] (1)全懸浮備選BHK-21細(xì)胞的篩選與克?。痪唧w方法為：
[0029] 1)利用含2?8%血清的培養(yǎng)基在36?38°C 5% CO2單層貼壁培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞， 收集培養(yǎng)上清中貼壁能力弱或不貼壁的散在細(xì)胞；
[0030] 2)在36?38°C 5% CO2條件下懸浮培養(yǎng)收集的細(xì)胞，懸浮培養(yǎng)的BHK-21細(xì)胞 經(jīng)100?1000r/min離心5?20min，收集離心上清，上清再經(jīng)500?1000r/min離心5? 20min，棄上清，重懸細(xì)胞沉淀；
[0031] 3)細(xì)胞沉淀重懸后經(jīng)培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋，利用微量細(xì)胞板對收集的BHK-21細(xì)胞進(jìn) 行連續(xù)單克隆化培養(yǎng)，篩選出不貼壁生長的單細(xì)胞克隆株；
[0032] (2)全懸浮BHK-21細(xì)胞的放大和種子批建立；具體方法為：
[0033] 1)利用低血清或無血清培養(yǎng)基將BHK-21細(xì)胞克隆株用搖瓶懸浮培養(yǎng)放大，得到 適應(yīng)低血清或無血清全懸浮培養(yǎng)的BHK-21細(xì)胞；
[0034] 2)將全懸浮細(xì)胞經(jīng)500?IOOOrpm離心5?20min，棄上清，取細(xì)胞沉淀，用細(xì)胞 凍存液重懸為20?40萬細(xì)胞/ml，分裝后置液氮保存，建立細(xì)胞基礎(chǔ)種子批。；
[0035] 3.疫苗制備
[0036] (1)懸浮細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)
[0037] 懸浮BHK-21細(xì)胞復(fù)蘇及逐級放大培養(yǎng)；具體方法為：
[0038] 1)取出液氮凍存的懸浮BHK-21細(xì)胞，置于40°C水浴中迅速溶解，接種含0.5? 10%小牛血清的IOOml培養(yǎng)基，于搖瓶中置37°C培養(yǎng)72h ;
[0039] 2)將步驟1)培養(yǎng)得到的BHK-21細(xì)胞全部轉(zhuǎn)移至500ml規(guī)格的懸浮培養(yǎng)瓶，補(bǔ)力口 培養(yǎng)基至500ml，于37°C攪拌培養(yǎng)72h ;
[0040] 3)將步驟2)培養(yǎng)得到的BHK-21細(xì)胞按照1傳5比例傳到5個500ml規(guī)格的懸浮 培養(yǎng)瓶瓶，于37°C攪拌培養(yǎng)至細(xì)胞濃度達(dá)到不低于4X IO6細(xì)胞/ml ;
[0041] 4)將步驟3)培養(yǎng)得到的BHK-21細(xì)胞全部轉(zhuǎn)移至美國NBS BioFlo 115型反應(yīng)器 (罐體總體積14L)，補(bǔ)加培養(yǎng)基至10L，反應(yīng)器參數(shù)設(shè)定四路氣體，分別為空氣、氧氣、氮?dú)?和⑶2,轉(zhuǎn)速80r/min，溫度37°C，pH 7. 2,溶氧60%，分別于培養(yǎng)24h、48h采樣進(jìn)行細(xì)胞計 數(shù)和活力檢測。
[0042] (2)接毒和收毒
[0043] 1)適應(yīng)BHK-21細(xì)胞的新城疫疫苗毒接種及其毒液收獲；具體方法為：將適應(yīng) BHK-21細(xì)胞的新城疫疫苗毒種按培養(yǎng)液體積的1 %比例接種BioFlo 115型反應(yīng)器，反應(yīng)器 參數(shù)設(shè)定四路氣體，分別為空氣、氧氣、氮?dú)夂虲02,轉(zhuǎn)速80r/min，溫度37°C，pH 7. 4,溶氧 60 %于接毒后24h起，每隔2h采樣進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，活細(xì)胞密度低于0. 5 X IO6后，收獲病毒 液。
[0044] 2)新城疫疫苗毒的毒價測定；具體方法為：新城疫毒液的毒價按常規(guī)方法測定HA 效價和TCID5tl。
[0045] (3)疫苗配制按照《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程（二〇〇〇年版）新城疫 常規(guī)活疫苗或者滅活疫苗方法進(jìn)行制得成品，具體方法為：
[0046] 1)用以上所述的新城疫病毒抗原制備活疫苗的方法，包括：將Mukteswar株/ BHK-21在BHK-21/IVDC株細(xì)胞中大量增殖，加入凍干保護(hù)劑經(jīng)真空冷凍干燥制備新城疫活 疫苗。
[0047] 2)用以上所述的新城疫病毒抗原制備滅活疫苗的方法，包括：將Mukteswar株/ BHK-21在BHK-21/IVDC株細(xì)胞中大量增殖、滅活，加入佐劑制備新城疫滅活疫苗。
[0048] 4.疫苗檢驗
[0049] 具體方法為：
[0050] (1)對于由上述方法制備的活疫苗，疫苗檢驗主要包括物理性狀、無菌檢驗、支原 體檢驗、外源病毒檢驗、鑒別檢驗、安全檢驗和效力檢驗；
[0051] (2)對于由上述方法制備的滅活疫苗，疫苗檢驗主要包括物理性狀、無菌檢驗、安 全檢驗和效力檢驗。
[0052] 本發(fā)明涉及的微生物資源信息
[0053] 本發(fā)明涉及的細(xì)胞為：適合新城疫病毒培養(yǎng)用BHK-21全懸浮細(xì)胞，系 申請人:將已 適應(yīng)新城疫病毒培養(yǎng)的BHK-21細(xì)胞，經(jīng)懸浮馴化和連續(xù)克隆純化獲得的一株BHK-21全懸 浮細(xì)胞，命名為幼金倉鼠腎細(xì)胞（Baby hamster kidney cell)BHK-21/IVDC株，該細(xì)胞株已 于2014年06月17日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No. 9319。
[0054] 本發(fā)明涉及的微生物為：新城疫病毒Mukteswar株/BHK-21，系 申請人:將 Mukteswar株經(jīng)BHK-21細(xì)胞連續(xù)傳代，獲得的BHK-21細(xì)胞適應(yīng)毒，命名為新城疫病毒 (Newcastle disease virus, NDV)Mukteswar 株/BHK-21，該毒株已于 2014 年 06 月 17 日送 交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心保藏，保藏編號為：CGMCC No. 8889。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0055] 圖1懸浮培養(yǎng)的BHK21/IVDC株細(xì)胞
[0056] 圖2 NDV Mukteswar株/BHK-21細(xì)胞適應(yīng)毒株陽性病毒對照
[0057] 圖3 NDV Roakin株/BHK-21細(xì)胞適應(yīng)毒株陽性病毒對照
[0058] 圖4 NDV Mukteswar株/BHK-21細(xì)胞適應(yīng)毒株中和組
[0059] 圖5 NDV Roakin株/BHK-21細(xì)胞適應(yīng)毒株中和組
[0060] 圖6 BHK-21細(xì)胞對照
[0061] 圖 7 NDV Mukteswar 株 /BHK-21 細(xì)胞適應(yīng)毒株 IFA(200X)
[0062] 圖 8 NDV Roakin 株 /BHK-21 細(xì)胞適應(yīng)毒株 IFA (200X)
[0063] 圖 9 BHK-21 細(xì)胞對照 IFA (200 X)
[0064] 圖 10 RT-PCR結(jié)果圖中：M :DNA Marker II ;1 :NDV Mukteswar株/BHK-21 細(xì)胞適應(yīng) 毒株；2 :NDV Roakin株/BHK-21 細(xì)胞適應(yīng)毒株；3 :NDV Mukteswar株雞胚毒；4 :NDV Roakin 株雞胚毒；5 :NDV LaSota株陽性對照；6 :陰性對照
[0065] 本發(fā)明的積極意義
[0066] 本發(fā)明涉及BHK-21細(xì)胞全懸浮培養(yǎng)技術(shù)在新城疫疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用。
[0067] (1)本發(fā)明BHK-21細(xì)胞系代替雞胚制造新城疫疫苗，不僅可以解決SPF雞胚供應(yīng) 受限制約禽用疫苗生產(chǎn)的問題，還可解決禽源外源病原的污染問題，確保疫苗質(zhì)量和安全 性。
[0068] (2)本發(fā)明懸浮BHK-21細(xì)胞系代替雞胚制造新城疫疫苗，使得新城疫疫苗生產(chǎn)的 周期縮短，產(chǎn)量增加，質(zhì)量穩(wěn)定，效益顯著。
[0069] (3)本發(fā)明提供的懸浮BHK-21細(xì)胞生產(chǎn)新城疫疫苗的工藝，減少了疫苗生產(chǎn)過程 中人力物力的投入，降低了生產(chǎn)成本。 實施例
[0070] 以下實施例為更好的說明本發(fā)明，不對本申請形成限定。
[0071] 實施例一
[0072] --全懸浮培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞的馴化
[0073] 1 材料
[0074] I. 1細(xì)胞株：BHK-21細(xì)胞，購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。
[0075] 1. 2 培養(yǎng)基：DMEM、VP SFM AGT，均為 Gibco 公司產(chǎn)品。
[0076] 1. 3牛血清：Hyclone公司產(chǎn)品。
[0077] 1. 4儀器設(shè)備：離心機(jī)，Sigma 3-18K型；懸浮細(xì)胞培養(yǎng)瓶（100ml，500ml) ,WHEATON 產(chǎn)品；BioFlo 115型反應(yīng)器，美國NBS公司。
[0078] 2 方法
[0079] 2. 1利用含1 %?10%血清的DMEM培養(yǎng)基在35?38°C 5% CO2單層貼壁培養(yǎng) BHK-21細(xì)胞，收集培養(yǎng)上清中貼壁能力弱或不貼壁的散在細(xì)胞；
[0080] 2. 2在35?38°C 5% CO2條件下懸浮培養(yǎng)收集的細(xì)胞，懸浮培養(yǎng)的BHK-21細(xì)胞 經(jīng)100?1000r/min離心5?lOmin，收集離心上清，上清再經(jīng)100?1000r/min離心5? IOmin,棄上清，重懸細(xì)胞沉淀；
[0081] 2. 3細(xì)胞沉淀重懸后經(jīng)培養(yǎng)基稀釋，利用細(xì)胞微量培養(yǎng)板對收集的BHK21細(xì)胞進(jìn) 行單克隆化培養(yǎng)，初步篩選不貼壁生長的細(xì)胞克隆株，將初篩選的細(xì)胞克隆株再單克隆化， 直至篩選到不貼壁生長的單細(xì)胞克隆株；
[0082] 2. 4利用低血清或無血清培養(yǎng)基（VP SFM AGT，Gibco產(chǎn)品）將BHK-21細(xì)胞克隆株 用搖瓶懸浮培養(yǎng)放大至懸浮生物反應(yīng)器（IOOml懸浮細(xì)胞培養(yǎng)瓶、500ml懸浮細(xì)胞培養(yǎng)瓶、 美國NBS BioFlo 115型反應(yīng)器）培養(yǎng)，經(jīng)過連續(xù)篩選和克隆，篩選到1株適應(yīng)低血清或無 血清全懸浮培養(yǎng)的BHK-21細(xì)胞，命名為BHK-21/IVDC株（見圖1)。
[0083] 實施例二
[0084] --懸浮培養(yǎng)BHK21細(xì)胞生產(chǎn)新城疫病毒Mukteswar株的方法
[0085] 1.材料
[0086] I. 1細(xì)胞株：BHK_21/IVDC株懸浮細(xì)胞，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所馴化、選育。
[0087] I. 2NDV Mukteswar株和購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。
[0088] L 3 培養(yǎng)基：VP SFM AGT，Gibco 公司產(chǎn)品。
[0089] 1. 4牛血清：Hyclone公司產(chǎn)品。
[0090] 1. 5抗雞新城疫病毒特異性血清，購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。
[0091] 1. 6儀器設(shè)備：離心機(jī)，Sigma 3-18K型；懸浮細(xì)胞培養(yǎng)瓶（100ml，500ml) ,WHEATON 產(chǎn)品；BioFlo 115型反應(yīng)器，美國NBS公司。
[0092] 2 方法
[0093] 2. 1細(xì)胞的準(zhǔn)備
[0094] 2. I. 1將雞胚培養(yǎng)的新城疫疫苗生產(chǎn)毒種新城疫病毒Mukteswar株（中國獸醫(yī)微 生物保藏管理中心提供）接種單層BHK-21細(xì)胞，以0. 5%?10%毒量接種單層BHK-21細(xì) 胞，加入維持液培養(yǎng)至70 %以上細(xì)胞發(fā)生病變時收獲毒液，獲得的毒液再以同樣方法繼續(xù) 接種細(xì)胞，如此增殖5?20代獲得適應(yīng)BHK-21細(xì)胞的新城疫疫苗毒（見圖2)。
[0095] 2. 1.2取出液氮凍存的懸浮BHK-21細(xì)胞，置于40°C水浴中迅速溶解，接種含 0. 5%?10%小牛血清的IOOml培養(yǎng)基，于搖瓶中置37°C培養(yǎng)72h ;
[0096] (2. 1. 3將步驟（2. 1. 2)中培養(yǎng)得到的BHK-21細(xì)胞全部轉(zhuǎn)移至500ml規(guī)格的懸浮 培養(yǎng)瓶，補(bǔ)加培養(yǎng)基至500ml，于37°C攪拌培養(yǎng)72h ;
[0097] 2. 1. 4將步驟（2. 1. 3)中培養(yǎng)得到的BHK-21細(xì)胞按照1傳5比例傳到5個500ml 規(guī)格的懸浮培養(yǎng)瓶中，于37°C攪拌培養(yǎng)至細(xì)胞濃度不低于4X IO6細(xì)胞/ml ;
[0098] 2. 1. 5將步驟（2. 1. 4)中培養(yǎng)得到的BHK-21細(xì)胞全部轉(zhuǎn)移至美國NBS BioFlo 115 型反應(yīng)器（罐體總體積14L)，補(bǔ)加培養(yǎng)基至10L，反應(yīng)器參數(shù)設(shè)定四路氣體，分別為空氣、氧 氣、氮?dú)夂虲O 2，轉(zhuǎn)速80r/min，溫度37°C，pH 7. 2,溶氧60%，分別于培養(yǎng)36h、48h和72h采 樣進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)和活力檢測。當(dāng)細(xì)胞濃度> 2. 5X IO6細(xì)胞/ml時進(jìn)行病毒接種，否則繼續(xù) 進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)至所需濃度。
[0099] 按以上方法制備SY13001、SY13002和SY13003三批細(xì)胞，檢測結(jié)果（見表1)。
[0100] 表1反應(yīng)器細(xì)胞計數(shù)與活力檢測
[0101]

【權(quán)利要求】
1. BHK-21細(xì)胞全懸浮培養(yǎng)技術(shù)在新城疫疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用，如權(quán)利要求1所述的應(yīng) 用，其特征在于包括以下步驟： (1) 病毒株的選育將新城疫病毒Mukteswar株及其它疫苗毒株經(jīng)BHK-21細(xì)胞連續(xù) 傳代，獲得的BHK-21細(xì)胞適應(yīng)毒，命名為新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV) Mukteswar株/BHK-21，該毒株已于2014年06月17日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3 號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編 號為：CGMCC No. 8889 ; (2) 懸浮細(xì)胞株的馴化與選育將適合新城疫病毒培養(yǎng)用BHK-21細(xì)胞進(jìn)行全懸浮馴化 選育，獲得全懸浮的BHK-21/IVDC株，該細(xì)胞株已于2014年06月17日送交北京市朝陽區(qū) 北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心保藏，保藏編號為CGMCC No. 9319 ; (3) 懸浮細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)復(fù)蘇BHK-21/IVDC株懸浮細(xì)胞，采用懸浮細(xì)胞培養(yǎng)瓶逐級放大 為5個500ml規(guī)格的懸浮培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞濃度達(dá)到4 X 106細(xì)胞/ml后，全部轉(zhuǎn)移至美國NBS BioFlo 115型總體積14L的反應(yīng)器，補(bǔ)加培養(yǎng)基至10L，反應(yīng)器參數(shù)設(shè)定四路氣體，分別為 空氣、氧氣、氮?dú)夂虲02，轉(zhuǎn)速80r/min，溫度37 °C，pH7. 2，溶氧60 %，分別于培養(yǎng)24h、48h采 樣進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)和活力檢測。 (4) 接毒和收毒當(dāng)BioFlo 115型反應(yīng)器中活細(xì)胞密度不低于2. 5X 106細(xì)胞/ml時， 按細(xì)胞培養(yǎng)液體積的1 %比例接入新城疫病毒Mukteswar株/BHK-21，反應(yīng)器參數(shù)設(shè)定四路 氣體，分別為空氣、氧氣、氮?dú)夂虲02，轉(zhuǎn)速80r/min，溫度37°C，pH7. 4,溶氧60%，，于接毒后 24h起，每隔2h采樣進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，活細(xì)胞密度低于0. 5X 106后，收獲病毒液即為抗原。
2. 用于權(quán)利要求1制備抗原所述的病毒，可以是新城疫病毒的任何疫苗生產(chǎn)毒株。
3. 用權(quán)利要求1或2所述的新城疫病毒抗原制備疫苗。
4. 用權(quán)利要求1所述的新城疫病毒抗原制備疫苗的方法，包括：將Mukteswar株/ BHK-21細(xì)胞毒在BHK-21/IVDC株細(xì)胞中大量增殖，加入凍干保護(hù)劑經(jīng)真空冷凍干燥制備新 城疫活疫苗。
5. 用權(quán)利要求1所述的新城疫病毒抗原制備疫苗的方法，包括：將Mukteswar株/ BHK-21細(xì)胞毒在BHK-21/IVDC株細(xì)胞中大量增殖、滅活，加入佐劑制備新城疫滅活疫苗。
6. 用于權(quán)利要求4或5所述的新城疫病毒抗原制備疫苗的方法，包括新城疫病毒的任 何疫苗生產(chǎn)毒株。
7. 權(quán)利要求3所述的的新城疫疫苗在預(yù)防新城疫中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N7/00GK104258385SQ201410277713
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年11月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月3日
【發(fā)明者】吳華偉, 陳曉春, 高艷春, 郎洪武, 鄧永, 李俊平, 李慧姣, 夏業(yè)才 申請人:中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所