一種恒磁場促進(jìn)脂肪酶催化合成蔗糖-6-酯的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種恒磁場促進(jìn)脂肪酶催化合成蔗糖-6-酯的方法，屬于物理場輔助生物催化技術(shù)從而用于有機(jī)合成的范疇。本發(fā)明意在非水介質(zhì)二甲亞砜/叔丁(戊)醇的混合溶劑中，通過恒磁場輔助脂肪酶催化蔗糖與脂肪酸乙烯酯反應(yīng)生成蔗糖-6-酯。該方法快速，高效，操作簡單、安全，符合綠色化學(xué)的要求。
【專利說明】一種恒磁場促進(jìn)脂肪酶催化合成蔗糖-6-酯的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于物理場輔助生物催化的【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種恒磁場促進(jìn)脂肪酶催化合成蔗糖-6-酯的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蔗糖-6-酯是制備三氯蔗糖的重要中間體。三氯蔗糖是蔗糖分子中4，I’，6’ -OH被Cl原子取代，同時(shí)4-位發(fā)生構(gòu)型翻轉(zhuǎn)而其它-OH保持不變的一種功能甜味劑。而蔗糖分子中8個(gè)-OH發(fā)生氯化反應(yīng)的順序?yàn)?，6’ >4>1’ >其他位，因此在蔗糖進(jìn)行氯化處理之前，必須首先屏蔽反應(yīng)活性較高的6-OH使之不被氯化，然后再對4，I’，6’ -OH進(jìn)行氯化處理。所以蔗糖分子中的6-OH保護(hù)是氯化反應(yīng)的關(guān)鍵前期步驟，必須采用有效地6-OH?；椒?。
[0003]原酸酯法與有機(jī)錫催化法制備蔗糖-6-酯是傳統(tǒng)上主要采用的兩種化學(xué)方法。原酸酯法操作簡單，但收率偏低。相反，有機(jī)錫法收率較高，但操作及后處理過程復(fù)雜，并有產(chǎn)品中重金屬超標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)。
[0004]由于酶催化具有區(qū)域選擇性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、操作簡單、環(huán)境友好、安全性高等優(yōu)勢，近年來制備蔗糖-6-酯越來越傾向于利用酶催化法。經(jīng)大量研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶、脂肪酶、抗體酶都是用來合成蔗糖酯的主要酶。但不同來源的酶具有各自的催化特點(diǎn)和催化活力。蛋白酶主要催化蔗糖的1-OH或2-OH，且通常不接受長鏈脂肪酸作為?；w。相比蛋白酶，脂肪酶來源廣泛，較寬范圍的脂肪酸蔗糖酯都可被催化合成，并且反應(yīng)一般發(fā)生在
6-OH。利用抗體酶催化蔗糖合成更純的蔗糖-6-酯最近也有研究證實(shí)，但仍待深一步研究。所以目前用于催化合成蔗糖-6-酯的酶主要還是指脂肪酶。
[0005]Ferrel 等(Ferrer M, Cruces MA, BernatT e M, Ballesteros A, Plou FJ.Lipase-catalyzed reg1selective acylat1n of sucrose in two-solvent mixtures.B1technol B1eng 1999; 65:10 - 16)利用 H.lanuginosa 脂肪酶在非水相 DMSO/ 叔戍醇=1:4 (體積比)混合溶液中催化蔗糖與月桂酸乙烯酯反應(yīng)，24h后蔗糖轉(zhuǎn)化率為70%，蔗糖-6-月桂酸酯的產(chǎn)率為40%。羅旭等(羅旭，錢俊青.叔丁醇體系中脂肪酶催化合成蔗糖乙酸酯[J].高化學(xué)工程學(xué)報(bào)，2010，24(3):451-455)用Lipozyme TL頂催化蔗糖和乙酸乙烯酯反應(yīng)24 h后蔗糖-6-乙酸酯的產(chǎn)率為40.9%。王勅等(王勅，鄭璞，倪曄，等.非水介質(zhì)中脂肪酶催化合成蔗糖-6-乙酸酯的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè).2010，36(12):20-24)在DMSO/叔丁醇混合溶液中利用脂肪酶催化蔗糖和乙酸乙烯酯生成蔗糖-6-乙酸酯，反應(yīng)9h，相應(yīng)的摩爾轉(zhuǎn)化率為77%-89%。王勅等雖然提高了蔗糖-6-乙酸酯的產(chǎn)率、相對縮短了反應(yīng)時(shí)間，但仍存在著反應(yīng)時(shí)間偏長等主要問題。
[0006]自然界中的任何物質(zhì)都具有磁性，只是有的物質(zhì)磁性強(qiáng)，有的物質(zhì)磁性弱；任何地方都存在磁場，只是有的地方磁場高，有的地方磁場低，磁現(xiàn)象是普遍存在的。恒磁場是恒定直流電或靜止永磁體產(chǎn)生的磁場，大小和方向都不隨時(shí)間改變。
[0007] 對于脂肪酶而言，一方面，磁場作用可能導(dǎo)致酶分子整體構(gòu)象的部分延伸；另一方面，酶活性部位的空間結(jié)構(gòu)是由較少或較弱的次級鍵所維系，由于維系活性部位空間結(jié)構(gòu)的力量較弱，所以易受環(huán)境影響。外部磁場的作用，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，即酶的柔性發(fā)生了變化所致。這種變化可能使酶的活性中心更容易暴露在油一水界面上，有利于活性部位與底物的復(fù)合，從而提高酶的活性。另外，由于酶同時(shí)具有疏水頭和親水尾，磁場的作用使酶能夠較有序地排列在油一水界面上，這也有利于溶液接觸面對酶分子的吸附，使吸附在接觸面上的酶分子數(shù)目增多，由于反應(yīng)速度與溶液接觸面上所吸附的酶分子數(shù)目成立方函數(shù)關(guān)系，從而加快酶促反應(yīng)的速度。
[0008]陶偉華等(陶偉華，王紅民.磁場對有機(jī)溶劑中脂肪酶催化活性的影響[J].天水師范學(xué)院學(xué)報(bào).2005, 25(2))研究了磁場對有機(jī)溶劑中脂肪酶催化活性的影響，指出
0.216T的磁場可使豬胰脂肪酶的酯合成活力由24.8nmol/min.mg Pr提高到39.7nmol/min.mg Pr。張秋霞等(張秋霞，尹春玲，范秋領(lǐng)，朱元保.磁場對脂肪酶催化活性的影響[J].平頂山學(xué)院學(xué)報(bào).2005，20(5))研究了磁場對發(fā)生在液-液兩相界面上的酶促反應(yīng)的影響，結(jié)果表明0.1T的磁場作用I h可使酶活力提高76.1%等。他們認(rèn)為磁場主要是通過影響脂肪酶的結(jié)構(gòu)，使酶活性中心發(fā)生了局部的細(xì)微的構(gòu)象變化，從而影響酶促反應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]發(fā)明目的:針對現(xiàn)有技術(shù)的問題，本發(fā)明采用一種恒磁場促進(jìn)脂肪酶催化合成蔗糖-6-酯的方法，實(shí)現(xiàn)了縮短反應(yīng)時(shí)間、提高酶的重復(fù)利用率的目的。
[0010]技術(shù)方案:為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種恒磁場促進(jìn)脂肪酶催化合成蔗糖-6-酯的方法，包括以下步驟:
1)將真空干燥的蔗糖溶解于非水相二甲亞砜與叔丁醇或叔戊醇的混合溶劑中，加入脂肪酶和脂肪酸乙烯酯得到反應(yīng)體系，采用恒磁場輔助酶催化的方式，控制反應(yīng)溫度為20-60 0C，記錄反應(yīng)0.5-10h的轉(zhuǎn)化率；
2)反應(yīng)結(jié)束后，脂肪酶通過離心從混合體系中分離，然后用叔丁醇或叔戊醇清洗、真空干燥備用；
3)離心后的液體冷卻至室溫，旋蒸得到蔗糖-6-酯的濃縮液。
[0011]其中，上述脂肪酸乙烯酯包括乙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、辛酸乙烯酯、癸酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯、棕櫚酸乙烯酯或硬脂酸乙烯酯中的一種。
[0012]其中，上述二甲亞砜與叔丁醇或叔戊醇的體積比為1:3-9。
[0013]其中，上述脂肪酶加入量為lO-lOOmg/mL。
[0014]其中，上述蔗糖與脂肪酸乙烯酯的摩爾比為1:2_20。
[0015]其中，上述脂肪酶為Lipozyme TL IM、Lipozyme TL 100L 或 Lipozyme RM IM 中的一種。
[0016]其中，上述恒磁場輔助酶催化的方式為先對脂肪酶進(jìn)行恒磁場預(yù)處理后再置于反應(yīng)體系中進(jìn)行催化反應(yīng)或者直接在恒磁場中進(jìn)行反應(yīng)。
[0017]其中，上述先對脂肪酶進(jìn)行恒磁場預(yù)處理的磁感應(yīng)強(qiáng)度為20_650mT，優(yōu)選50-300mT ;預(yù)處理脂肪酶的時(shí)間為30-180min，優(yōu)選40_100min。
[0018]其中，上述直接在恒磁場中進(jìn)行反應(yīng)，磁感應(yīng)強(qiáng)度為20-650mT，優(yōu)選50-300mT。
[0019]有益效果:本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有以下優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明采用一種恒磁場輔助脂肪酶催化合成蔗糖-6-酯，具有反應(yīng)迅速，產(chǎn)物純度高，副產(chǎn)物少，操作簡單、安全，脂肪酶可被反復(fù)多次使用等優(yōu)點(diǎn)，符合綠色化學(xué)的理念。本發(fā)明采用恒磁場輔助脂肪酶催化蔗糖和脂肪酸乙烯酯合成蔗糖-6-酯，在適宜的磁場強(qiáng)度和磁化時(shí)間的恒磁場中，脂肪酶催化活性得到提高，主要表現(xiàn)為反應(yīng)時(shí)間大幅度縮短。
【具體實(shí)施方式】
[0020]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于此。
[0021]高效液相色譜(HPLC)分析條件:島津LC-10AT型高效液相色譜儀:LC_10AT高壓輸送泵，色譜柱 Supelcosil?LC-18 (250X4.6mm, 5um)，柱溫 30 °C ;檢測器=RID-1OA ;連接器:CBM-10A VP PLUS ;流動(dòng)相:乙腈 / 水=6/1 (V/V);進(jìn)樣量:20 μ L，流速 0.8mL/min。
[0022]實(shí)施例1:
在10mL的反應(yīng)器中先加已用1mLDMSO溶解的0.9g蔗糖，再依次加入30mL叔戊醇，Lipozyme TL 100L 100mg/mL,乙酸乙烯酯0.5mL (鹿糖與脂肪酸乙烯酯的摩爾比約為1:2),在磁感應(yīng)強(qiáng)度為20mT的恒磁場中反應(yīng)，反應(yīng)溫度40°C，攪拌反應(yīng)5h。加熱到80°C使脂肪酶TL 10L失活，從而離心除去脂肪酶；反應(yīng)產(chǎn)物冷卻至室溫，減壓蒸餾得到蔗糖-6-乙酸酯濃縮液。HPLC分析得蔗糖-6-乙酸酯的產(chǎn)率約78.3%。
[0023]實(shí)施例2:
將真空干燥后的蔗糖溶解于非水相二甲亞砜與叔丁醇的混合溶劑中，二甲亞砜與叔戊醇的體積比為1:5,然后加Lipozyme RM IM 50mg/mL,再加入癸酸乙烯酯,使得鹿糖與癸酸乙烯酯的摩爾比為1:10，在磁感應(yīng)強(qiáng)度為50mT的恒磁場中，50°C下反應(yīng)4h。離心除去脂肪酶；反應(yīng)產(chǎn)物冷卻至室溫，減壓蒸餾得到蔗糖-6-葵酸酯濃縮液。HPLC分析得蔗糖-6-癸酸酯的產(chǎn)率約為80.1%。
[0024] 實(shí)施例3:
在10mL的反應(yīng)器中先加入已用5mL DMSO溶解的0.6g鹿糖,再依次加入45mL叔丁醇、Lipozyme TL IM 10mg/mL、乙酸乙烯酯3.2mL(鹿糖與脂肪酸乙烯酯的摩爾比約為1:20),在磁感應(yīng)強(qiáng)度為300mT的恒磁場中反應(yīng)反應(yīng)溫度25°C，攪拌反應(yīng)lh。離心、旋蒸后得淡黃色液體。HPLC分析得蔗糖-6-乙酸酯的產(chǎn)率約80.3%。
[0025]實(shí)施例4:
將干燥后的蔗糖溶解于非水相二甲亞砜與叔丁醇的混合溶劑中，二甲亞砜與叔丁醇的體積比為1:4，置于水浴鍋恒溫振蕩器中，轉(zhuǎn)速3001'/1^11，恒溫501:至蔗糖完全溶解；然后加Lipozyme TL IM 100mg/mL,此酶已用磁感應(yīng)強(qiáng)度為650mT的恒磁場預(yù)處理40min ;再加入棕櫚酸乙烯酯，使得蔗糖與棕櫚酸乙烯酯的摩爾比為1:15，控制水域溫度35°C。反應(yīng)3h后，離心除去脂肪酶；反應(yīng)產(chǎn)物冷卻至室溫，減壓蒸餾得到蔗糖-6-棕櫚酯濃縮液。HPLC分析得蔗糖-6-棕櫚酸酯的產(chǎn)率約79.6%。
[0026]實(shí)施例5:
將干燥后的蔗糖溶解于非水相二甲亞砜與叔戊醇的混合溶劑中，二甲亞砜與叔戊醇的體積比為1:4，置于水浴鍋恒溫振蕩器中，轉(zhuǎn)速3001'/1^11，恒溫501:至蔗糖完全溶解；然后加Lipozyme TL IM 100mg/mL,此酶已用磁感應(yīng)強(qiáng)度為175mT的恒磁場預(yù)處理10min ;再加入月桂酸乙烯酯，使得蔗糖與月桂酸乙烯酯的摩爾比為1:18，控制水域溫度351:。反應(yīng)3h后，離心除去脂肪酶；反應(yīng)產(chǎn)物冷卻至室溫，減壓蒸餾得到蔗糖-6-月桂酯濃縮液。HPLC分析得蔗糖-6-月桂酸酯的產(chǎn)率約88.9%。
[0027]實(shí)施例6:
在50mL的反應(yīng)器中先加入已用ImL DMSO溶解的0.1g鹿糖,再依次加入4mL叔丁醇、Lipozyme TL IM 100mg/mL、乙酸乙烯酯0.5mL (鹿糖與脂肪酸乙烯酯的摩爾比約為1:20),在磁感應(yīng)強(qiáng)度為230mT的恒磁場中反應(yīng)，反應(yīng)溫度35°C，攪拌反應(yīng)3.5h。離心、旋蒸后得淡黃色液體。HPLC分析得蔗糖-6-乙酸酯的產(chǎn)率約90.7%。
[0028]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出:對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的 保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種恒磁場促進(jìn)脂肪酶催化合成蔗糖-6-酯的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)將真空干燥的蔗糖溶解于非水相二甲亞砜與叔丁醇或叔戊醇的混合溶劑中，加入脂肪酶和脂肪酸乙烯酯得到反應(yīng)體系，采用恒磁場輔助酶催化的方式，控制反應(yīng)溫度為20-600C，記錄反應(yīng)0.5-10h的轉(zhuǎn)化率； 2)反應(yīng)結(jié)束后，脂肪酶通過離心從混合體系中分離，然后用叔丁醇或叔戊醇清洗、真空干燥備用； 3)離心后的液體冷卻至室溫，旋蒸得到蔗糖-6-酯的濃縮液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的恒磁場促進(jìn)脂肪酶催化合成蔗糖-6-酯的方法，其特征在于，所述脂肪酸乙烯酯包括乙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、辛酸乙烯酯、癸酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯、棕櫚酸乙烯酯或硬脂酸乙烯酯中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的恒磁場促進(jìn)輔助脂肪酶催化合成蔗糖-6-酯的方法，其特征在于，所述二甲亞砜與叔丁醇或叔戊醇的體積比為1:3-9。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的恒磁場促進(jìn)脂肪酶催化合成蔗糖-6-酯的方法，其特征在于，所述脂肪酶加入量為lO-lOOmg/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的恒磁場促進(jìn)脂肪酶催化合成蔗糖-6-酯的方法，其特征在于，所述蔗糖與脂肪酸乙烯酯的摩爾比為1:2_20。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的恒磁場促進(jìn)脂肪酶催化合成蔗糖-6-酯的方法，其特征在于，所述脂肪酶為 Lipozyme TL IM、Lipozyme TL 10L 或 Lipozyme RM IM 中的一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的恒磁場促進(jìn)脂肪酶催化合成蔗糖-6-酯的方法，其特征在于，所述恒磁場輔助酶催化的方式為先對脂肪酶進(jìn)行恒磁場預(yù)處理后再置于反應(yīng)體系中進(jìn)行催化反應(yīng)或者直接在恒磁場中進(jìn)行反應(yīng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的恒磁場促進(jìn)脂肪酶催化合成蔗糖-6-酯的方法，其特征在于，所述先對脂肪酶進(jìn)行恒磁場預(yù)處理的磁感應(yīng)強(qiáng)度為20-650mT，預(yù)處理脂肪酶的時(shí)間為30_180min。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的恒磁場促進(jìn)脂肪酶催化合成蔗糖-6-酯的方法，其特征在于，所述直接在恒磁場中進(jìn)行反應(yīng)，磁感應(yīng)強(qiáng)度為20-650mT。
【文檔編號】C12P19/12GK104031957SQ201410257672
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月12日
【發(fā)明者】沈彬, 申桂賢, 張衡, 趙芬利 申請人:東南大學(xué)