基因突變體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了基因突變體及其應(yīng)用。其中，該基因突變體，與野生型ABCA4基因相比，具有c.4604dup突變；或者與野生型CNGB3基因相比具有選自下列的至少一種突變：c.1774dup、c.129+1G>A和c.1957G>A；或者與野生型PDE6C基因相比具有選自下列的至少一種突變：c.1935+1del、c.2518+5G>C和c.1004+1G>A；或者與野生型RPGRIP1基因相比具有c.2592T>G突變；或者與野生型CACNA1F基因相比具有c.2542G>A突變。通過檢測這些突變體在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測生物樣品是否易感錐桿營養(yǎng)不良癥。
【專利說明】基因突變體及其應(yīng)用
[0001] 優(yōu)先權(quán)信息
[0002] 本申請請求2013年6月10日向中國國家知識產(chǎn)權(quán)局提交的、專利申請?zhí)枮?201310270648. 6的專利申請的優(yōu)先權(quán)和權(quán)益，并且通過參照將其全文并入此處。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003] 本發(fā)明涉及基因突變體及其應(yīng)用。具體地，本發(fā)明涉及分離的核酸、分離的多肽、 篩選易感錐桿營養(yǎng)不良癥的生物樣品的方法、篩選易感錐桿營養(yǎng)不良癥的生物樣品的系 統(tǒng)、用于篩選易感錐桿營養(yǎng)不良癥的生物樣品的試劑盒、構(gòu)建體以及重組細(xì)胞。

【背景技術(shù)】
[0004] 錐桿營養(yǎng)不良（CORD)是指一系列主要是錐細(xì)胞參與的遺傳性視網(wǎng)膜疾病。視桿 細(xì)胞減少的情況可能同時發(fā)生，或后期發(fā)生。CORD患者通常會有視覺靈敏度降低，畏光，色 覺異常的癥狀。
[0005] CORD可以以常染色體顯性（adCORD)，常染色體隱性（arCORD)，或者X連鎖 (xlCORD)方式遺傳。目前為止至少有25個基因被報道與不同遺傳方式的CORD相關(guān)，涉及 較多致病突變，但仍存在著相當(dāng)一部分未知致病基因位點。
[0006] 因而，目前對錐桿營養(yǎng)不良癥的研究仍有待深入。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的 在于提出一種能夠有效篩選易感錐桿營養(yǎng)不良癥的生物樣品的方法。
[0008] 本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列工作而完成的：發(fā)明人通過高通量外顯子組測序聯(lián)合 候選基因突變驗證的方法確定了錐桿營養(yǎng)不良癥的致病基因上的新突變。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種分離的核酸。根據(jù)本發(fā)明的實施例，與 野生型ABCA4基因相比，所述核酸具有c. 4604dup突變；或者與野生型CNGB3基因相比，所 述核酸具有選自下列的至少一種突變：c. 1774dup、c. 129+1G>A和c. 1957G>A ;或者與野生 型TOE6C基因相比，所述核酸具有選自下列的至少一種突變：c. 1935+ldel、c. 2518+5G>C和 c. 1004+1G>A ;或者與野生型RPGRIP1基因相比，所述核酸具有c. 2592T>G突變；或者與野 生型CACNA1F基因相比，所述核酸具有c. 2542G>A突變。根據(jù)本發(fā)明的實施例，發(fā)明人確定 了 ABCA4、CNGB3、H)E6C、RPGRIP1和CACNA1F基因突變體，這些新突變體與錐桿營養(yǎng)不良癥 的發(fā)病密切相關(guān)，從而通過檢測這些新突變體在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測生 物樣品是否易感錐桿營養(yǎng)不良癥。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種篩選易感錐桿營養(yǎng)不良癥的生物樣 品的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括以下步驟：從生物樣品提取核酸樣本；確定 所述核酸樣本的核酸序列；所述核酸樣本的核酸序列或其互補序列，與野生型ABCA4基因 相比具有c. 4604dup突變，或者與野生型CNGB3基因相比具有選自下列的至少一種突變： c. 1774dup、c. 129+1G>A和c. 1957G>A，或者與野生型TOE6C基因相比具有選自下列的至少 一種突變：c. 1935+ldel、c. 2518+5G>C和c. 1004+1G>A，或者與野生型RPGRIP1基因相比具 有c. 2592T>G突變，或者與野生型CACNA1F基因相比具有c. 2542G>A突變，是所述生物樣品 易感錐桿營養(yǎng)不良癥的指示。通過根據(jù)本發(fā)明實施例的篩選易感錐桿營養(yǎng)不良癥的生物樣 品的方法，可以有效地篩選易感錐桿營養(yǎng)不良癥的生物樣品。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種篩選易感錐桿營養(yǎng)不良癥的生物樣品 的系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該系統(tǒng)包括：核酸提取裝置，所述核酸提取裝置用于從所 述生物樣品提取核酸樣本；核酸序列確定裝置，所述核酸序列確定裝置與所述核酸提取裝 置相連，用于對所述核酸樣本進(jìn)行分析，以便確定所述核酸樣本的核酸序列；判斷裝置，所 述判斷裝置與所述核酸序列確定裝置相連，以便基于所述核酸樣本的核酸序列或其互補序 列，與野生型ABCA4基因相比具有c. 4604dup突變，或者與野生型CNGB3基因相比具有選自 下列的至少一種突變：c. 1774dup、c. 129+1G>A和c. 1957G>A，或者與野生型TOE6C基因相比 具有選自下列的至少一種突變：c. 1935+ldel、c. 2518+5G>C和c. 1004+1G>A，或者與野生型 RPGRIP1基因相比具有c. 2592T>G突變，或者與野生型CACNA1F基因相比具有c. 2542G>A突 變，判斷所述生物樣品是否易感錐桿營養(yǎng)不良癥。利用該系統(tǒng)，能夠有效地實施前述篩選易 感錐桿營養(yǎng)不良癥的生物樣品的方法，從而可以有效地篩選易感錐桿營養(yǎng)不良癥的生物樣 品。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了一種用于篩選易感錐桿營養(yǎng)不良癥的生 物樣品的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該試劑盒含有：適于檢測ABCA4、CNGB3、TOE6C、 RPGRIP1和CACNA1F基因突變體的至少一種的試劑，其中與野生型ABCA4基因相比，所述 ABCA4基因突變體具有c. 4604dup突變；與野生型CNGB3基因相比，所述CNGB3基因突變體 具有選自下列的至少一種突變：c. 1774dup、c. 129+1G>A和c. 1957G>A ;與野生型H)E6C基 因相比，所述PDE6C基因突變體具有選自下列的至少一種突變：c. 1935+ldel、c. 2518+5G>C 和c. 1004+1G>A ;與野生型RPGRIP1基因相比，所述RPGRIP1基因突變體具有c. 2592T>G突 變；與野生型CACNA1F基因相比，所述CACNA1F基因突變體具有c. 2542G>A突變。利用根據(jù) 本發(fā)明的實施例的試劑盒，能夠有效地篩選易感錐桿營養(yǎng)不良癥的生物樣品。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明還提出了一種構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該構(gòu) 建體包含前面所述的分離的核酸。需要說明的是，"構(gòu)建體包含前面所述的分離的核酸"表 示，本發(fā)明的構(gòu)建體包含與野生型ABCA4基因相比具有c. 4604dup突變的ABCA4基因突變 體的核酸序列，或者與野生型CNGB3基因相比具有選自下列的至少一種突變：c. 1774dup、 c. 129+1G>A和c. 1957G>A的CNGB3基因突變體的核酸序列，或者與野生型TOE6C基因相比 具有選自下列的至少一種突變：c. 1935+ldel、c. 2518+5G>C和c. 1004+1G>A的PDE6C基因 突變體的核酸序列，或者與野生型RPGRIP1基因相比具有c. 2592T>G突變的RPGRIP1基因 突變體的核酸序列，或者與野生型CACNA1F基因相比具有c. 2542G>A突變的CACNA1F基因 突變體的核酸序列，或者同時包含上述各種基因突變體的核酸序列。由此，本發(fā)明的構(gòu)建體 轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞獲得的重組細(xì)胞，能夠有效地用作錐桿營養(yǎng)不良癥相關(guān)研究的模型。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明還提出了一種重組細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該 重組細(xì)胞是通過前面所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞而獲得的。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，本 發(fā)明的重組細(xì)胞，能夠有效地用作錐桿營養(yǎng)不良癥相關(guān)研究的模型。
[0015] 本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變 得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結(jié)合下面附圖對實施例的描述中將變 得明顯和容易理解，其中 ：
[0017] 圖1 :顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的篩選易感錐桿營養(yǎng)不良癥的生物樣品的系 統(tǒng)及其組成部分的示意圖，其中，
[0018] A為根據(jù)本發(fā)明實施例的篩選易感錐桿營養(yǎng)不良癥的生物樣品的系統(tǒng)的示意圖，
[0019] B為根據(jù)本發(fā)明實施例的核酸提取裝置的示意圖，
[0020] C為根據(jù)本發(fā)明實施例的核酸序列確定裝置的示意圖；
[0021] 圖2 :顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例，檢出新突變的8個CORD患者家系Familyl-8 的家系圖譜；
[0022] 圖3 :顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例，檢出新突變的8個CORD患者家系Familyl-8 內(nèi)的患者及其家系外正常人對照的相應(yīng)CORD致病基因突變位點的Sanger測序驗證峰圖。

【具體實施方式】
[0023] 下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實施例。下面描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā) 明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
[0024] 基因突變體
[0025] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種分離的核酸。根據(jù)本發(fā)明的實施例，與 野生型ABCA4基因相比，所述核酸具有c. 4604dup突變；或者與野生型CNGB3基因相比，所 述核酸具有選自下列的至少一種突變：c. 1774dup、c. 129+1G>A和c. 1957G>A ;或者與野生 型TOE6C基因相比，所述核酸具有選自下列的至少一種突變：c. 1935+ldel、c. 2518+5G>C和 c. 1004+1G>A ;或者與野生型RPGRIP1基因相比，所述核酸具有c. 2592T>G突變；或者與野 生型CACNA1F基因相比，所述核酸具有c. 2542G>A突變。需要說明的是，本發(fā)明的分離的核 酸編碼 ABCA4、CNGB3、PDE6C、RPGRIP1 和 CACNA1F 突變體，也可以稱為"編碼 ABCA4、CNGB3、 TOE6C、RPGRIP1和CACNA1F突變體的核酸"，即該核酸可以理解為與編碼ABCA4、CNGB3、 H)E6C、RPGRIP1和CACNA1F突變體的基因相對應(yīng)的核酸物質(zhì)，即核酸的類型不受特別限制， 可以是任何包含與ABCA4、CNGB3、TOE6C、RPGRIP1和CACNA1F的編碼基因相對應(yīng)的脫氧核 糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根據(jù)本發(fā)明的一個 具體示例，前面所述的編碼ABCA4、CNGB3、H)E6C、RPGRIP1和CACNA1F突變體的核酸為DNA。 根據(jù)本發(fā)明的實施例，發(fā)明人確定了 ABCA4、CNGB3、H)E6C、RPGRIP1和CACNA1F基因的新突 變體，這些突變體與錐桿營養(yǎng)不良癥的發(fā)病密切相關(guān)，從而通過檢測該突變體在生物樣品 中是否存在，可以有效地檢測生物樣品是否易感錐桿營養(yǎng)不良癥，也可以通過檢測這些突 變體在生物體中是否存在，可以有效地預(yù)測生物體是否易感錐桿營養(yǎng)不良癥。
[0026] 對于本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中，提及核酸，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，實際包 括互補雙鏈的任意一條，或者兩條。為了方便，在本說明書和權(quán)利要求書中，雖然多數(shù)情況 下只給出了一條鏈，但實際上也公開了與之互補的另一條鏈。例如，提及SEQ ID N0:1，實際 包括其互補序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以理解，利用一條鏈可以檢測另一條鏈，反之亦然。
[0027] 這些編碼480八4、0如83、^^6(：、1^61?1?1和040隱1?基因突變體的核酸，是本申請 的發(fā)明人通過高通量外顯子組測序聯(lián)合候選基因突變驗證的方法，確定的錐桿營養(yǎng)不良癥 的致病基因上的新突變，并且在現(xiàn)有技術(shù)中并未見到上述致病突變與錐桿營養(yǎng)不良癥相關(guān) 的報道。
[0028] 需要說明的是，上述各野生型基因的cDNA和/或基因組DNA序列可以從如下網(wǎng)址 獲得：
[0029] ABCA4 基因組 DNA 序列獲取網(wǎng)址：：http://asia. ensembl. org/Homo_sapiens/ Gene/Sequence ? g = ENSG00000198691 ;r = 1:94458393-94586688 ;
[0030] ABCA4 基因 cDNA 序列獲取網(wǎng)址：http://asia. ensembl. org/Homo- sapiens/Transcript/Sequence_cDNA ? db = core ；g = ENSG00000198691 ；r = 1:94458393-94586688 ；t = ENST00000370225 ；
[0031] CNGB3 基因組 DNA 序列獲取網(wǎng)址：http://asia. ensembl. org/Homo_sapiens/ Gene/Sequence ? g = ENSG00000170289 ；r = 8:87566205-87755903 ；
[0032] CNGB3 基因 cDNA 序列獲取網(wǎng)址：http://asia. ensembl. org/Homo- sapiens/Transcript/Sequence_cDNA ? db = core ；g = ENSG00000170289 ；r = 8:87566205-87755903 ；t = ENST00000320005 ；
[0033] PDE6C 基因組 DNA 序列獲取網(wǎng)址：http://asia. ensembl. org/Homo_sapiens/ Gene/Sequence ? g = ENSG00000095464 ;r = 10:95372345-95425767 ;
[0034] PDE6C 基因 cDNA 序列獲取網(wǎng)址：http://asia. ensembl. org/Homo- sapiens/Transcript/Sequence_cDNA ? db = core ；g = ENSG00000095464 ；r = 10:95372345-95425767 ；t = ENST00000371447 ；
[0035] RPGRIP1 基因組 DNA 序列獲取網(wǎng)址：http://asia. ensembl. org/Homo_sapiens/ Gene/Sequence ? g = ENSG00000092200 ；r = 14:21756098-21819460 ；
[0036] RPGRIP1 基因 cDNA 序列獲取網(wǎng)址：http://asia. ensembl. org/Homo- sapiens/Transcript/Sequence_cDNA ? db = core ；g = ENSG00000092200 ；r = 14:21756098-21819460 ；t = ENST00000400017 ；
[0037] CACNA1F 基因組 DNA 序列獲取網(wǎng)址：http://asia. ensembl. org/Homo_sapiens/ Gene/Sequence ? g = ENSG00000102001 ；r = X:49061523-49089833 ；
[0038] CACNA1F 基因 cDNA 序列獲取網(wǎng)址：http://asia. ensembl. org/Homo- sapiens/Transcript/Sequence_cDNA ? db = core ；g = ENSG00000102001 ；r = X:49061523-49089833 ;t = ENST00000376265。
[0039] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的ABCA4基因突變體，與野生型ABCA4基因相比具有c. 4604dup突變， 即相對于野生型ABCA4基因，本發(fā)明的ABCA4基因突變體的cDNA第4604位堿基發(fā)生了插入 突變，插入了一個T堿基（c. 4604dup，在本文中有時也表示為"c. 4605insT") ANGB3基因突 變體，與野生型CNGB3基因相比具有選自下列的至少一種突變：c. 1774dup、c. 129+1G>A和 c. 1957G>A，即相對于野生型CNGB3基因，本發(fā)明的CNGB3基因突變體的cDNA具有選自下列 的至少一種突變：其cDNA第1774位堿基發(fā)生了插入突變，插入了一個G堿基（c. 1774dup， 在本文中有時也表示為"c. 1775insG"）；第129位堿基后一位的位于非編碼區(qū)堿基發(fā)生了 突變，由G突變?yōu)锳(c. 129+1G>A);第1957位堿基G突變?yōu)锳(c. 1957G>A)。PDE6C基因突 變體，與野生型H)E6C基因相比具有選自下列的至少一種突變：c. 1935+ldel、c. 2518+5G>C 和c. 1004+1G>A，即相對于野生型TOE6C基因，本發(fā)明的TOE6C基因突變體的cDNA具有選自 下列的至少一種突變：其cDNA第1935位堿基后一位的位于非編碼區(qū)堿基發(fā)生了一個缺失 突變，缺失堿基G(c. 1935+ldel，在本文中有時也表示為"c. 1935+ldelG"）；第2518位堿基 后第五位的位于非編碼區(qū)的堿基發(fā)生了突變，由G突變?yōu)镃(c. 2518+5G>C);第1004位堿基 后一位的位于非編碼區(qū)堿基發(fā)生了突變，由G突變?yōu)锳(c. 1004+1G>A))。RPGRIP1基因突變 體，與野生型RPGRIP1基因相比具有c. 2592T>G突變，即相對于野生型RPGRIP1基因，本發(fā) 明的RPGRIP1基因突變體的cDNA第2592位的T突變?yōu)镚。CACNA1F基因突變體，與野生型 CACNA1F基因相比具有c. 2542G>A突變，即相對于野生型CACNA1F基因，本發(fā)明的CACNA1F 基因突變體的cDNA第2542位的G突變?yōu)锳。
[0040] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，ABCA4基因的c. 4604dup突變與已知突變c. 1957CXT同時發(fā)生能夠 導(dǎo)致患者出現(xiàn)錐桿營養(yǎng)不良癥狀，其中c. 4604dup致病位點由本發(fā)明人首次提出的；CNGB3 基因的c. 1774dup和c. 129+1G>A，任何一種純合突變發(fā)生均能夠?qū)е禄颊叱霈F(xiàn)錐桿營養(yǎng)不 良癥狀，這兩個致病位點均由發(fā)明人首次提出；CNGB3基因的c. 1957G>A突變與已知突變 c. 2415A>C同時發(fā)生能夠?qū)е禄颊叱霈F(xiàn)錐桿營養(yǎng)不良癥狀，其中c. 1957G>A致病位點由發(fā) 明人首次提出；PDE6C基因的c. 1935+ldel、c. 2518+5G>C和c. 1004+1G>A，任何一種純合突 變發(fā)生均能夠?qū)е禄颊叱霈F(xiàn)錐桿營養(yǎng)不良癥狀；RPGRIP1基因的c. 2592T>G突變與已知突 變c. 799C>T同時發(fā)生能夠?qū)е禄颊叱霈F(xiàn)錐桿營養(yǎng)不良癥狀，其中c. 2592T>G致病位點由發(fā) 明人首次提出；CACNA1F基因的c. 2542G>A突變，也是發(fā)明人首次提出的易感錐桿營養(yǎng)不良 癥的致病突變，也能夠?qū)е禄颊叱霈F(xiàn)錐桿營養(yǎng)不良癥狀。
[0041] 篩選易感錐桿營養(yǎng)不良癥的生物樣品的方法
[0042] 根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種篩選易感錐桿營養(yǎng)不良癥的生物樣品 的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該篩選易感錐桿營養(yǎng)不良癥的生物樣品的方法可以包括以 下步驟：
[0043] 首先，從生物樣品提取核酸樣本。根據(jù)本發(fā)明的實施例，生物樣品的類型并不受 特別限制，只要從該生物樣品中能夠提取到反映生物樣品ABCA4、CNGB3、TOE6C、RPGRIP1和 CACNA1F基因是否存在突變的核酸樣本即可。根據(jù)本發(fā)明的實施例，生物樣品可以為選自 人體血液、皮膚、皮下組織的至少一種。由此，可以方便地進(jìn)行取樣和檢測，從而能夠進(jìn)一 步提高篩選易感錐桿營養(yǎng)不良癥的生物樣品的效率。根據(jù)本發(fā)明的實施例，這里所使用的 術(shù)語"核酸樣本"應(yīng)做廣義理解，其可以是任何能夠反映生物樣品中ABCA4、CNGB3、TOE6C、 RPGRIP1和CACNA1F基因是否存在突變的樣本，例如可以是從生物樣品中直接提取的全基 因組DNA，也可以是該全基因組中包含ABCA4、CNGB3、TOE6C、RPGRIP1和CACNA1F基因編碼序 列的一部分，可以是從生物樣品中提取的總RNA，也可以是從生物樣品中提取的mRNA。根據(jù) 本發(fā)明的一個實施例，所述核酸樣本為全基因組DNA。由此，可以擴(kuò)大生物樣品的來源范圍， 并且可以同時對生物樣品的多種信息進(jìn)行確定，從而能夠提高篩選易感錐桿營養(yǎng)不良癥的 生物樣品的效率。另外，根據(jù)本發(fā)明的實施例，針對采用RNA作為核酸樣本，從生物樣品提 取核酸樣本可以進(jìn)一步包括：從生物樣品提取RNA樣本，優(yōu)選RNA樣本為mRNA ;以及基于所 得到的RNA樣本，通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA樣本，所得到的cDNA樣本構(gòu)成核酸樣本。由 此，可以進(jìn)一步提高利用RNA作為核酸樣本篩選易感錐桿營養(yǎng)不良癥的生物樣品的效率。
[0044] 接下來，在得到核酸樣本之后，可以對核酸樣本進(jìn)行分析，從而能夠確定所得到核 酸樣本的核酸序列。根據(jù)本發(fā)明的實施例，確定所得到核酸樣本的核酸序列的方法和設(shè)備 并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，可以通過測序方法，確定核酸樣本的核酸序 列。根據(jù)本發(fā)明的實施例，可以用于進(jìn)行測序的方法和設(shè)備并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的 實施例，可以采用第二代測序技術(shù)，也可以采用第三代以及第四代或者更先進(jìn)的測序技術(shù)。 根據(jù)本發(fā)明的具體示例，可以利用選自Hiseq2000、S0LiD、454和單分子測序裝置的至少一 種對核酸序列進(jìn)行測序。由此，結(jié)合最新的測序技術(shù)，針對單個位點可以達(dá)到較高的測序 深度，檢測靈敏度和準(zhǔn)確性大大提高，因而能夠利用這些測序裝置的高通量、深度測序的特 點，進(jìn)一步提高對核酸樣本進(jìn)行檢測分析的效率。從而，能夠提高后續(xù)對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析 時的精確性和準(zhǔn)確度。由此，根據(jù)本發(fā)明的實施例，確定核酸樣本的核酸序列可以進(jìn)一步包 括：首先，針對所得到的核酸樣本，構(gòu)建核酸測序文庫；以及對所得到的核酸測序文庫進(jìn)行 測序，以便獲得由多個測序數(shù)據(jù)構(gòu)成的測序結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，可以采用選自 HiSeq2000、S0LiD、454和單分子測序裝置的至少一種對所得到的核酸測序文庫進(jìn)行測序。 另外，根據(jù)本發(fā)明的實施例，可以對核酸樣本進(jìn)行篩選，富集ABCA4、CNGB3、TOE6C、RPGRIP1 和CACNA1F基因外顯子，該篩選富集可以在構(gòu)建測序文庫之前，構(gòu)建測序文庫過程中，或者 構(gòu)建測序文庫之后進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，針對核酸樣本，構(gòu)建核酸測序文庫進(jìn) 一步包括：利用選自ABCA4、CNGB3、TOE6C、RPGRIP1和CACNA1F基因外顯子特異性引物的 至少一種，對核酸樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增；以及針對所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，構(gòu)建核酸測序文庫。由 此，可以通過PCR擴(kuò)增，富集ABCA4、CNGB3、PDE6C、RPGRIP1和CACNA1F基因外顯子，從而能 夠進(jìn)一步提高篩選易感錐桿營養(yǎng)不良癥的生物樣品的效率。根據(jù)本發(fā)明的實施例，ABCA4、 CNGB3、TOE6C、RPGRIP1和CACNA1F基因外顯子特異性引物的序列不受特別限制，例如可以 參考人類基因組序列數(shù)據(jù)庫GRCh37. l/hgl9,采用Primerf. 0在線設(shè)計獲得。根據(jù)本發(fā)明的 優(yōu)選實施例，所述ABCA4基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID N0:l-2所示的核苷酸序列； 所述CNGB3基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID NO :3-8所示的核苷酸序列；所述TOE6C 基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID NO :9-14所示的核苷酸序列；所述RPGRIP1基因外 顯子特異性引物具有如SEQ ID NO :15-16所示的核苷酸序列；所述CACNA1F基因外顯子特 異性引物具有如SEQ ID NO :17-18所示的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，針對 c. 1774dup突變，所述CNGB3基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID N0:3-4所示的核苷酸序 列；針對c. 129+1G>A突變，所述CNGB3基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID NO :5-6所示 的核苷酸序列；針對c. 1957G>A突變，所述CNGB3基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID N0 : 7-8所示的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的另一些實施例，針對c. 1935+ldel突變，所述TOE6C 基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID勵：9-10所示的核苷酸序列；針對〇.2518+56>(：突 變，所述TOE6C基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID NO :11-12所示的核苷酸序列；針對 c.l004+lG>A突變，所述roE6C基因外顯子特異性引物具有如SEQIDN0:13-14所示的核 苷酸序列。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過采用SEQ ID NO :1-18所示的引物，可以在PCR反應(yīng)體 系中顯著有效地完成對相應(yīng)基因突變所在外顯子序列的擴(kuò)增。需要說明的是，下表中的這 些SEQ ID NO :1-18所示的核苷酸序列是本發(fā)明的發(fā)明人在付出了艱苦的勞動后，意外獲得 的。
[0045]

【權(quán)利要求】
1. 一種分離的核酸，其特征在于， 與野生型ABCA4基因相比，所述核酸具有c. 4604dup突變；或者 與野生型CNGB3基因相比，所述核酸具有選自下列的至少一種突變：c. 1774dup、 c. 129+1G>A 和 c. 1957G>A ;或者 與野生型TOE6C基因相比，所述核酸具有選自下列的至少一種突變：c. 1935+ldel、 c. 2518+5G>C 和 c. 1004+1G>A ;或者 與野生型RPGRIP1基因相比，所述核酸具有c. 2592T>G突變；或者 與野生型CACNA1F基因相比，所述核酸具有c. 2542G>A突變， 任選地，所述核酸為DNA。
2. -種篩選易感錐桿營養(yǎng)不良癥的生物樣品的方法，其特征在于，包括以下步驟： 從所述生物樣品提取核酸樣本； 確定所述核酸樣本的核酸序列； 所述核酸樣本的核酸序列或其互補序列，與野生型ABCA4基因相比具有c. 4604dup突 變，或者與野生型CNGB3基因相比具有選自下列的至少一種突變：c. 1774dup、c. 129+1G>A 和c. 1957G>A，或者與野生型TOE6C基因相比具有選自下列的至少一種突變：c. 1935+ldel、 c. 2518+5G>C和c. 1004+1G>A，或者與野生型RPGRIP1基因相比具有c. 2592T>G突變，或者 與野生型CACNA1F基因相比具有c. 2542G>A突變，是所述生物樣品易感錐桿營養(yǎng)不良癥的 指示， 任選地，所述生物樣品為選自人體血液、皮膚、毛發(fā)和肌肉的至少一種， 任選地，所述核酸樣本為全基因組DNA。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，從所述生物樣品提取核酸樣本進(jìn)一步包 括： 從所述生物樣品提取RNA樣本，優(yōu)選所述RNA樣本為mRNA ;以及 基于所述RNA樣本，通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA樣本，所述cDNA樣本構(gòu)成所述核酸樣 本。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，確定所述核酸樣本的核酸序列進(jìn)一步包 括： 針對所述核酸樣本，構(gòu)建核酸測序文庫；以及 對所述核酸測序文庫進(jìn)行測序，以便獲得由多個測序數(shù)據(jù)構(gòu)成的測序結(jié)果， 任選地，采用選自Hiseq2000、S0LiD、454和單分子測序裝置的至少一種對所述核酸測 序文庫進(jìn)行測序。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，針對所述核酸樣本，構(gòu)建核酸測序文庫進(jìn) 一步包括： 利用選自ABCA4、CNGB3、TOE6C、RPGRIP1和CACNA1F基因外顯子特異性引物的至少一 種，對所述核酸樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增；以及 針對所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，構(gòu)建所述核酸測序文庫， 任選地， 所述ABCA4基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID N0:l-2所示的核苷酸序列； 所述CNGB3基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID NO :3-8所示的核苷酸序列； 所述TOE6C基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID NO :9-14所示的核苷酸序列； 所述RPGRIP1基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID NO :15-16所示的核苷酸序列； 所述CACNA1F基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID NO :17-18所示的核苷酸序列， 任選地， 針對c. 1774dup突變，所述CNGB3基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID NO :3-4所示 的核苷酸序列； 針對c. 129+1G>A突變，所述CNGB3基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID N0:5-6所示 的核苷酸序列； 針對c. 1957G>A突變，所述CNGB3基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID NO :7-8所示 的核苷酸序列， 任選地， 針對c.l935+ldel突變，所述roE6C基因外顯子特異性引物具有如SEQIDN0:9-10所 示的核苷酸序列； 針對c. 2518+5G>C突變，所述TOE6C基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID N0:ll-12 所示的核苷酸序列； 針對c. 1004+1G>A突變，所述TOE6C基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID N0:13-14 所示的核苷酸序列。
6. -種篩選易感錐桿營養(yǎng)不良癥的生物樣品的系統(tǒng)，其特征在于，包括： 核酸提取裝置，所述核酸提取裝置用于從所述生物樣品提取核酸樣本； 核酸序列確定裝置，所述核酸序列確定裝置與所述核酸提取裝置相連，用于對所述核 酸樣本進(jìn)行分析，以便確定所述核酸樣本的核酸序列； 判斷裝置，所述判斷裝置與所述核酸序列確定裝置相連，以便基于所述核酸樣本的 核酸序列或其互補序列，與野生型ABCA4基因相比具有c. 4604dup突變，或者與野生型 CNGB3基因相比具有選自下列的至少一種突變：c. 1774dup、c. 129+1G>A和c. 1957G>A，或 者與野生型H)E6C基因相比具有選自下列的至少一種突變：c. 1935+ldel、c. 2518+5G>C和 c. 1004+1G>A，或者與野生型RPGRIP1基因相比具有c. 2592T>G突變，或者與野生型CACNA1F 基因相比具有c. 2542G>A突變，判斷所述生物樣品是否易感錐桿營養(yǎng)不良癥， 任選地，所述核酸提取裝置進(jìn)一步包括： RNA提取單元，所述RNA提取單元用于從所述生物樣品提取RNA樣本；以及 反轉(zhuǎn)錄單元，所述反轉(zhuǎn)錄單元與所述RNA提取單元相連，用于對所述RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn) 錄反應(yīng)，以便獲得cDNA樣本，所述cDNA樣本構(gòu)成所述核酸樣本。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述核酸序列確定裝置進(jìn)一步包括： 文庫構(gòu)建單元，所述文庫構(gòu)建單元用于針對所述核酸樣本，構(gòu)建核酸測序文庫；以及 測序單元，所述測序單元與所述文庫構(gòu)建單元相連，用于對所述核酸測序文庫進(jìn)行測 序，以便獲得由多個測序數(shù)據(jù)構(gòu)成的測序結(jié)果， 任選地，所述文庫構(gòu)建單元進(jìn)一步包括： PCR擴(kuò)增模塊，所述PCR擴(kuò)增模塊中設(shè)置有選自ABCA4、CNGB3、TOE6C、PITPNM3、RPGRIP1 和CACNA1F基因外顯子特異性引物的至少一種，以便利用選自ABCA4、CNGB3、TOE6C、 RPGRIP1和CACNA1F基因外顯子特異性引物的至少一種，對所述核酸樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 任選地， 所述ABCA4基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID NO :1-2所示的核苷酸序列； 所述CNGB3基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID NO :3-8所示的核苷酸序列； 所述TOE6C基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID NO :9-14所示的核苷酸序列； 所述RPGRIP1基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID NO :15-16所示的核苷酸序列； 所述CACNA1F基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID NO :17-18所示的核苷酸序列， 任選地， 針對c. 1774dup突變，所述CNGB3基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID NO :3-4所示 的核苷酸序列； 針對c. 129+1G>A突變，所述CNGB3基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID N0:5-6所示 的核苷酸序列； 針對c. 1957G>A突變，所述CNGB3基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID NO :7-8所示 的核苷酸序列， 任選地， 針對c.l935+ldel突變，所述roE6C基因外顯子特異性引物具有如SEQIDN0:9-10所 示的核苷酸序列； 針對c. 2518+5G>C突變，所述TOE6C基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID N0:ll-12 所示的核苷酸序列； 針對c. 1004+1G>A突變，所述TOE6C基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID N0:13-14 所示的核苷酸序列， 任選地，所述測序單元包括選自HISEQ2000、S0LiD、454和單分子測序裝置的至少一 種。
8. -種用于篩選易感錐桿營養(yǎng)不良癥的生物樣品的試劑盒，其特征在于，含有： 適于檢測ABCA4、CNGB3、H)E6C、RPGRIP1和CACNA1F基因突變體的至少一種的試劑，其 中 與野生型ABCA4基因相比，所述ABCA4基因突變體具有c. 4604dup突變； 與野生型CNGB3基因相比，所述CNGB3基因突變體具有選自下列的至少一種突變： c. 1774dup、c.129+1G>A 和 c. 1957G>A ; 與野生型TOE6C基因相比，所述TOE6C基因突變體具有選自下列的至少一種突變： c. 1935+ldel、c.2518+5G>C 和 c. 1004+1G>A ; 與野生型RPGRIP1基因相比，所述RPGRIP1基因突變體具有c. 2592T>G突變； 與野生型CACNA1F基因相比，所述CACNA1F基因突變體具有c. 2542G>A突變， 任選地，所述試劑為核酸探針或引物。
9. 一種構(gòu)建體，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述的分離的核酸。
10. -種重組細(xì)胞，其特征在于，所述重組細(xì)胞是通過權(quán)利要求9所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化受 體細(xì)胞而獲得的。
【文檔編號】C12N5/10GK104232649SQ201410256625
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年6月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月10日
【發(fā)明者】管李萍, 張清巖, 王俊 申請人:深圳華大基因科技有限公司