能降解2,4–滴丁酯和敵敵畏的菌株及其制備修復(fù)菌劑的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種能降解2,4–滴丁酯和敵敵畏的菌株及其制備修復(fù)菌劑的方法，所述菌株為革蘭氏陰性菌，顯微鏡下可見菌株菌體為短桿狀。透射電鏡下，具有極生鞭毛。在LB平板上培養(yǎng)菌落呈圓形、油滴狀、黃色、不透明，表面濕潤、粘稠，邊緣整齊。在短時(shí)間內(nèi)對(duì)2,4-滴丁酯和敵敵畏降解率分別為99.82%和99.65%，該菌株為Pseudomonassp.LT1菌株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC?No.7947。該菌株可用于上述農(nóng)藥的生物降解，以及農(nóng)藥污染的土壤及農(nóng)產(chǎn)品的生物修復(fù)和生物凈化。
【專利說明】能降解2, 4 -滴丁酯和敵敵畏的菌株及其制備修復(fù)菌劑的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于化學(xué)農(nóng)藥生物降解【技術(shù)領(lǐng)域】,涉及一株土生細(xì)菌Pseudomonas sp.LTl菌株，及其對(duì)農(nóng)藥2，4 -滴丁酯和敵敵畏的降解作用，可用于土壤農(nóng)藥污染的原位修復(fù)工程。
【背景技術(shù)】
[0002]農(nóng)、獸藥是目前世界各國防治農(nóng)作物病蟲害和養(yǎng)殖業(yè)病害的有效手段。大量化學(xué)農(nóng)、獸藥，特別是高毒、高殘留農(nóng)獸藥的使用，成為食品安全和危害人們健康的主要“殺手”。
[0003]目前，主要使用的化學(xué)農(nóng)藥按其功能不同，主要分為殺蟲劑(Insecticide)、除草劑(Herbicide)和殺菌劑(Fungicide)三大類。依據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，可分為有機(jī)氯類、有機(jī)磷類、擬除蟲菊脂類、氨基甲酸脂類和無機(jī)農(nóng)藥等多種類型。這些化學(xué)農(nóng)藥的共同特點(diǎn)是:①有毒性，且靶向性差殘留性，一般分為高殘留、中殘留和低殘留等；③遷移性和累積性，可通過空氣、土壤或地下水發(fā)生遷移，甚至在生物體內(nèi)累積。有機(jī)磷類殺蟲劑成為目前使用量最大的農(nóng)藥之一，多屬于高效農(nóng)藥。目前，有機(jī)磷農(nóng)藥包括甲拌磷、乙拌磷、內(nèi)吸磷、對(duì)硫磷、甲胺磷、乙酰甲胺磷、殺螟硫磷、特普、敵百蟲、樂果、馬拉硫磷、甲基對(duì)硫磷、二甲硫吸磷、敵敵畏、甲基內(nèi)吸磷、氧化樂果、久效磷等。有機(jī)氯農(nóng)藥有滴滴涕、六六六、林丹、甲氧、高殘毒DDT、 硫丹。常用的擬除蟲菊脂類農(nóng)藥有溴氰菊脂、氯氰菊脂、氯菊脂、胺菊月旨、甲醚菊脂等。氨基甲酸酯類有西維因、葉蟬散、涕滅威、呋喃丹和異索威等。
[0004]在我國的農(nóng)藥品種結(jié)構(gòu)中，具有高毒和“三致性”的殺蟲劑占全部農(nóng)藥的40%以上，我國農(nóng)藥劇毒、高毒農(nóng)藥品種居多，存在著“3個(gè)70%”，即:農(nóng)藥中殺蟲劑占70% ;殺蟲劑中有機(jī)憐類品種占70% ;有機(jī)憐類中少數(shù)幾個(gè)聞毒品種占70%。
[0005]目前，世界上有機(jī)憐農(nóng)藥(Organophosphorus pesticides, OPs)的種類已達(dá)150多種，成為使用量最大的農(nóng)藥之一，我國生產(chǎn)的有機(jī)磷農(nóng)藥的品種就有20余種，年產(chǎn)量超過IOOkt,占我國農(nóng)藥總產(chǎn)量的80%以上。
[0006]據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國施用農(nóng)藥面積在218億hm2以上，每年用量50~60萬噸。這些施用的農(nóng)藥，有50%~60%殘留于土壤。目前，我國約有87~107萬hm2的農(nóng)田土壤受到有機(jī)磷農(nóng)藥嚴(yán)重污染，危害也越來越大。主要表現(xiàn)為:
[0007]一是有機(jī)磷農(nóng)藥在殺死靶標(biāo)生物的同時(shí)，也或多或少地殺死非靶標(biāo)生物，對(duì)周圍環(huán)境乃至整個(gè)生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重的破壞。
[0008]二是土壤中有機(jī)磷的成分含量過高，通過糧食、蔬菜、水果等間接影響人體和動(dòng)物的健康。有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)人體的危害不僅表現(xiàn)在干擾人體化學(xué)信息的傳遞，破壞身體的酶，而且它阻礙器官發(fā)揮正常的生理功能，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)功能失調(diào)。癌癥、不孕癥、內(nèi)分泌紊亂等疾病均與有機(jī)磷農(nóng)藥污染有關(guān)。
[0009]三是有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)土壤微生物數(shù)量、種群結(jié)構(gòu)和生物活性產(chǎn)生嚴(yán)重影響，造成土壤生產(chǎn)力下降。土壤微生物是調(diào)節(jié)土壤肥力的重要因素。高毒性有機(jī)磷農(nóng)藥的不斷使用，破壞了土壤微生物的繁殖，使敏感性的菌種受到抑制，土壤微生物的多樣性遭到破壞，種群趨于單一化，引起原有的平衡紊亂功能失調(diào)從而影響土壤物質(zhì)和能量的循環(huán)，影響土壤微生物的氨化硝化和呼吸作用等，由此破壞了土壤結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，土地肥力持續(xù)下降。
[0010]為治理有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)生態(tài)環(huán)境的危害，各國的研究人員做了大量的農(nóng)藥降解方法研究，建立了生物降解、化學(xué)降解、光化學(xué)降解、超聲波、洗滌劑和電離輻射等。而土壤中有機(jī)磷農(nóng)藥污染的治理主要是通過微生物降解有機(jī)磷農(nóng)藥。從上個(gè)世紀(jì)60年代開始，在污染物降解菌的分離、污染土壤微生物多樣性以及微生物中污染物降解基因的克隆等方面均有一定的研究。到目前為止，已分離到多種降解有機(jī)磷農(nóng)藥微生物，包括細(xì)菌、放線菌、真菌及藻類，其中細(xì)菌和真菌最多，細(xì)菌研究的較為透徹。細(xì)菌中優(yōu)勢菌主要為假單胞菌、芽胞桿菌、產(chǎn)堿桿菌、無色桿菌、黃桿菌等，真菌主要是霉菌。有的微生物專一降解某種農(nóng)藥，表現(xiàn)出降解惰性，如節(jié)桿菌和氣桿菌等。有的能同時(shí)降解多種農(nóng)藥，比較典型的有假單胞菌和芽胞桿菌等，可降解同類農(nóng)藥的多種品種或不同類型農(nóng)藥品種。有的不直接降解農(nóng)藥，而是通過共代謝完成降解過程。許多研究 者從自然土壤和環(huán)境中分離或篩選了大量的農(nóng)藥降解菌，如從長期使用毒死蜱的土壤中分離了一株可降解毒死蜱的真菌曲霉和一株可降解毒死蜱和甲胺磷的真菌木霉；通過富集培養(yǎng)和亞硝基肌誘變處理得到一株降解甲胺磷活性較高的華麗曲霉，它同時(shí)能降解樂果和對(duì)硫磷等有機(jī)磷農(nóng)藥；分離得到一株能以甲胺磷為唯一碳源、氮源和能源生長的曲霉M-2;從農(nóng)藥廠污泥中分離得到一株具有較高降解氧樂果活性的黑曲霉；從污泥中分離得到一株可降解樂果的不動(dòng)菌屬菌株，它以共代謝方式降解樂果，還能降解敵敵畏和對(duì)硫磷等農(nóng)藥；還分離得到一株能降解甲胺磷、敵敵畏和對(duì)硫磷的地衣芽抱桿菌。這些研究大大豐富了有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌陣營。但是，據(jù)《國際微生物學(xué)會(huì)聯(lián)盟通訊》有關(guān)專家估計(jì)，全球約有50萬~60萬種微生物，而今已被研究和記載的還不到5%，在如此豐富的微生物資源庫中，由于自然環(huán)境及其它理化條件的差異，尤其是長期受農(nóng)藥脅迫的環(huán)境中，仍有很多能降解農(nóng)藥的微生物未被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在分離到的還只是滄海一粟。因此，降解農(nóng)藥的微生物還需進(jìn)一步的發(fā)現(xiàn)和研究。
[0011]研究發(fā)現(xiàn)新的農(nóng)藥降解菌，可豐富降解農(nóng)藥微生物的種類，為土壤生物修復(fù)技術(shù)的研究和應(yīng)用提供依據(jù)，為構(gòu)建有機(jī)磷降解高效工程菌提供新的資源，推進(jìn)生物修復(fù)工程的發(fā)展，造福人類具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明從土壤樣本中分離篩選得到一株對(duì)2，4 -滴丁酯和敵敵畏具有高效降解能力的細(xì)菌菌株；本發(fā)明提供該菌株的鑒定特征和16S rDNA序列、菌株的分離篩選、菌株的生理生化特征、菌株對(duì)2，4-滴丁酯和敵敵畏的降解作用。本發(fā)明在發(fā)現(xiàn)和確定該菌株對(duì)2，4 -滴丁酯和敵敵畏具有高效降解特性的基礎(chǔ)上，還提供應(yīng)用該菌株降解土壤中2，4 -滴丁酯和敵敵畏菌劑發(fā)酵的方法。
[0013]本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
[0014]能降解2，4-滴丁酯和敵敵畏的菌株，該菌株為革蘭氏陰的假單胞菌屬，命名為Pseudomonas sp.LTl菌株，于2013年7月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編 100101 ;保藏號(hào)為 CGMCC N0.7947。
[0015]所述的能降解2，4 -滴丁酯和敵敵畏的菌株，該菌株16S rDNA序列為SEQ ID N0.1所示。
[0016]所述的能降解2，4 -滴丁酯和敵敵畏的菌株制備修復(fù)菌劑的方法，步驟如下:
[0017]步驟一,將Pseudomonas sp.LTl菌株接種于LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；
[0018]步驟二，將步驟一培養(yǎng)好的種子液按照體積比為10%接種于種子罐的培養(yǎng)基中，通入無菌空氣，振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；
[0019]步驟三，將步驟二培養(yǎng)后的種子液以體積比10%接種入生產(chǎn)罐發(fā)酵培養(yǎng)至菌體數(shù)量達(dá)到8億個(gè)/ml以上。
[0020]所述的能降解2，4 -滴丁酯和敵敵畏的菌株制備修復(fù)菌劑的方法，步驟一中振蕩培養(yǎng)條件可以為30°C，100轉(zhuǎn)/小時(shí)。
[0021]所述的能降解2，4 -滴丁酯和敵敵畏的菌株制備修復(fù)菌劑的方法，步驟二中振蕩培養(yǎng)條件可以為30°C，180轉(zhuǎn)/分鐘。
[0022]所述的能降解2，4 -滴丁酯和敵敵畏的菌株制備修復(fù)菌劑的方法，步驟二中無菌空氣的通入量可以為0.55-0.65m3/分鐘。
[0023]所述能降解2，4-滴丁酯和敵敵畏的菌株制備修復(fù)菌劑的方法，步驟二中的培養(yǎng)基組分以及含量可以如 下:可溶性淀粉3%，KNO30.1%, NaCl0.05%, K2HPO40.05%,MgSO40.05%和FeSO40.001% ;以上均為質(zhì)量比。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為菌株P(guān)seudomonas sp.LTl的透射電鏡照片(Iym)；
[0025]圖2為菌株P(guān)seudomonas sp.LTl的透射電鏡照片(0.2 μ m)；
[0026]圖3 為菌株 Pseudomonas sp.LTl 菌落形態(tài)；
[0027]圖4為2，4-滴丁酯為唯一碳源的固體培養(yǎng)基形成的水解圈(濃度為300mg/L)；
[0028]圖5為敵敵畏為唯一碳源的固體培養(yǎng)基形成的水解圈(濃度為300mg/L)；
[0029]圖6為菌株P(guān)seudomonas sp.LTl的系統(tǒng)發(fā)育地位分析。
【具體實(shí)施方式】
[0030]下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
[0031]下述實(shí)施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
[0032]實(shí)施例1:菌株分離與純化
[0033]菌株P(guān)seudomonas sp.LTl從甘肅省張掖市大弓農(nóng)藥廠污水處理池的活性污泥中分離得到，具體馴化、篩選、分離步驟為:取50g污泥，置于裝有IOOmL培養(yǎng)基A的500mL三角瓶中，先后加入100mg/L敵敵畏和相同量2，4-滴丁酯，30°C，100r/min,振蕩培養(yǎng)14d。取上層濁液10mL，置于含有40mL培養(yǎng)基A的250mL三角瓶中，加入300mg/L敵敵畏和相同量2，4-滴丁酯，300C，100r/min,振蕩培養(yǎng)14d。再取上層濁液10mL，同法培養(yǎng)3次，在這3次中，敵敵畏和2，4-滴丁酯逐級(jí)分別提高到500mg/L、800mg/L、1200mg/L。分別取ImL菌液于滅菌的平皿中，加入15mL含300mg/L的敵敵畏和2，4-滴丁酯，再加入冷卻至451:左右的培養(yǎng)基B，300C，培養(yǎng)3d。挑取有透明降解圈的單菌落，在同樣的培養(yǎng)基上純化3次，得到純化菌株。
[0034]所述的各培養(yǎng)基的組分及配比為:
[0035]培養(yǎng)基A(g.L-1) =NH4NO30.5，Na2HPO4L 19，KH2PO40.45，MgSO40.5，去離子水 1000ml，ρΗ6.8ο
[0036]培養(yǎng)基B (g.L—1):在培養(yǎng)基A中加20g瓊脂。
[0037]富集培養(yǎng)基:即LB液體培養(yǎng)基，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCllOg，搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)溶解。用5mol/L的NaOH調(diào)pH至7.0。
[0038]該菌株為革蘭氏陰性菌，顯微鏡下可見菌株菌體為短桿狀。透射電鏡下，具有極生鞭毛(圖1和圖2)。在LB平板上培養(yǎng)24h后菌落形態(tài)呈圓形、油滴狀、黃色、不透明，表面濕潤、粘稠，邊緣整齊(圖3)。
[0039]該菌株在以2，4-滴丁酯(濃度為300mg/L)為唯一碳源的固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)48h后形成的水解圈示意圖(圖4),在以敵敵畏(濃度為300mg/L)為唯一碳源的固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)48h后形成的水解圈示意圖(圖5)。
[0040]該菌株的理化特征為葡萄糖發(fā)酵液體培養(yǎng)基變成了黃色，能夠利用葡萄糖，產(chǎn)生有機(jī)酸，但是不產(chǎn)生氣體；不能產(chǎn)生淀粉酶水解淀粉，為陰性反應(yīng)。V.P試驗(yàn)中培養(yǎng)基兩天內(nèi)不顯現(xiàn)紅色，不能產(chǎn)生乙酰甲基甲醇，為陰性反應(yīng)；甲基紅試驗(yàn)中，培養(yǎng)基呈黃色，在糖代謝過程中不能產(chǎn)生丙酮酸，為陰性反應(yīng)；吲哚試驗(yàn)中，沒有吲哚存在，乙醚層沒有玫瑰紅色環(huán)狀物生成，不能分解蛋白胨中的色氨酸形成吲哚，此為陰性反應(yīng)；石蕊牛乳試驗(yàn)，培養(yǎng)48h后，培養(yǎng)基呈現(xiàn)粉色，能夠發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸。氧化酶試驗(yàn)，加鹽酸二甲基對(duì)苯二銨溶液，呈現(xiàn)粉紅色，并逐漸加深，能夠產(chǎn)生氧化酶；接觸酶試驗(yàn)，滴加I滴3%的過氧化氫后，有氣泡產(chǎn)生，具有接觸酶活性，能夠產(chǎn)生接觸酶，為陽性反應(yīng)；硝酸鹽還原試驗(yàn)，能使硝酸鹽還原為氮?dú)狻Ｆ渖砩卣饕姳?。
[0041]表1菌株為Pseudomonas sp.LTl的生理生化特征
[0042]
【權(quán)利要求】
1.能降解2，4-滴丁酯和敵敵畏的菌株，其特征在于，該菌株為革蘭氏陰的假單胞菌屬，命名為 Pseudomonas sp.LTl 菌株，保藏號(hào)為 CGMCC N0.7947。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能降解2，4-滴丁酯和敵敵畏的菌株，其特征在于，該菌株16S rDNA 序列為 SEQ ID N0.1 所示。
3.權(quán)利要求1所述的能降解2，4-滴丁酯和敵敵畏的菌株制備修復(fù)菌劑的方法，其特征在于，步驟如下: 步驟一,將sp.LTl菌株接種于LB培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期； 步驟二，將步驟一培養(yǎng)好的種子液按照體積比為10%接種于種子罐的培養(yǎng)基中，通入無菌空氣，振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期； 步驟三，將步驟二培養(yǎng)后的種子液以體積比10%接種入生產(chǎn)罐發(fā)酵培養(yǎng)至菌體數(shù)量達(dá)到 8億個(gè)/ml以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的能降解2，4-滴丁酯和敵敵畏的菌株制備修復(fù)菌劑的方法，其特征在于，步驟一中振蕩培養(yǎng)條件為30°C，100轉(zhuǎn)/小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的能降解2，4-滴丁酯和敵敵畏的菌株制備修復(fù)菌劑的方法，其特征在于，步驟二中振蕩培養(yǎng)條件為30°C，180轉(zhuǎn)/分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的能降解2，4-滴丁酯和敵敵畏的菌株制備修復(fù)菌劑的方法，其特征在于，步驟二中無菌空氣的通入量為0.55-0.65m3/分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述能降解2，4-滴丁酯和敵敵畏的菌株制備修復(fù)菌劑的方法，其特征在于，步驟二中的培養(yǎng)基組分以及含量如下:可溶性淀粉3 %，KNO3 0.1 %，NaCl 0.05%,K2HPO4 0.05%, MgSO4 0.05% 和 FeSO4 0.001% ；以上均為質(zhì)量比。
【文檔編號(hào)】C12R1/38GK104004689SQ201410256536
【公開日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年6月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月10日
【發(fā)明者】李同祥, 孫會(huì)剛, 黃天姿, 候進(jìn)慧, 王陶, 懂玉瑋, 高兆建, 劉全德, 王慶芝 申請(qǐng)人:徐州工程學(xué)院